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Verfahren zur mikrobiologischen Erzeugung von Cobalaminen Patent
1046 258 bezieht sich auf die Verwendung eines Mikroorganismus der
GattungNocardia, insbesondere des Stammes Nocardia rugosa, zur mikrobiologischen
Erzeugung von Cobalaminen, wobei die Nährflüssigkeit gegebenenfalls oberflächenaktive
Mittel enthält.
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Die zur Erzeugung der Cobalaminanaloge verwendeten Stämme sind Mutanten
der von Di Marco und Spalla (Giorn. Microbiol., 4, 24, 1957) beschriebenen
Art Nocardia rugosa. Die Mutantenstämme wurden durch Bestrahlung des Ausgangsstammes
mit ultraviolettem Licht erhalten. Sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit zur Ansammlung
des B-Faktors und anderer Vitamin-Bl,-ähnlicher Substanzen aus, die zu der Gruppe
der »unvollständigen Faktoren« (Kon, S. und Pawelkiewicz, J., Biosynthesis
of Vitamin B" Analogues, Symposium XI, Congress of Biochemistry, Wien
1958)
gehören. Die Anwesenheit dieser Faktoren in den Kulturen der Mutantenstämme
kann durch den Unterschied zwischen ihren wachstumsfördernden Wirkungen auf
E. coli 113/3, der auf alle Faktoren anspricht, und auf L-leichmannii
7830, der nur auf Vitamin B" anspricht, sowie durch Papierchromatographie
oder Elektrophorese und Bioautographie mit E. coli 11313 nachgewiesen
werden.
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Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer Cobalamine (Vitamin-B"-Analoge)
durch die durch Zusatz bestimmter Verbindungen modifizierte Gärung der Nährsubstrate
mit Mikroorganismen der Art Nocardia rugosa. Ferner betrifft die Erfindung die Isolierung
dieser Cobalamine von den Substraten durch Elektrophorese und Gegenstromextraktion.
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Das neue Verfahren zur Herstellung der Cobalamine besteht im Vergären
eines 2,3-Diamino-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin oder 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol
oder 2,4,5-Triaininotoluol oder 5(6)-Amino-6(5)-methylbenzimidazol enthaltenden
Nährsubstrats mit Mikroorganismen der Art Nocardia rugosa. Ein erfindungsgemäßes
Cobalamin hat eine Vitamin-B1.-ähnliche Wirksamkeit; es ist von Vitamin Bl, durch
Chromatographie oder Elektrophorese trennbar.
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Es werden bekannte Gärungsverfahren angewendet. Vorzugsweise wird
nach dem Submersverfahren mit Durchlüftung gearbeitet, beispielsweise nach dem Verfahren
der deutschen Auslegeschrift 1068 429, wobei man jedoch je nach dem
gewünschten Analog dem Substrat 2,3-Diamino-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin oder 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol
oder 2,4,5-Triaminotoluol oder 5(6)-Amino-6(5)-methylbenzimidazol zusetzt.
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Die verwendeten Extraktionsverfahren sind ebenfalls den in der genannten
Auslegeschrift beschriebenen ähnlich, jedoch wird zur Abtrennung von Vitamin B"
und anderen in dem Rohextrakt enthaltenen Substanzen der Cobalamingruppe
je nach dem herzustellenden Analog ein anderes Verfahren angewendet. Da die
in Frage kommenden Methoden in hohem Maße von den Eigenschaften der neuen erfindungsgemäß
erhaltenen Analoge A, B und C abhängig sind, werden zunächst diese
Eigenschaften beschrieben.
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Analog A
Bei Zusatz von 2,3-Diaminotetrahydronaphthalin erzeugen
Kulturen von Nocardia rugosa ein Cobalamin (Analog A), das sich von dem Vitamin
Bl, durch folgende Eigenschaften unterscheidet: 1. Das chromatische Rf in
sek.Butylalkohol-Essigsäure-Wasser nach der Methode von Ford u. a. (j. Ford,
E. S. Holdsworth, S. Kon, Biochein. J., Nr. 59, S. 86,
1955)
ist deutlich höher als das des Vitamins B" (RfIRf B12 # 1,2).
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2. Der Verteilungskoeffizient zwischen 240/,iger wäßriger Ammoniumsulfatlösung
und 1-Butanol ist größer als 1 (Verteilungskoeffizient von Bl, =
1).
3. Durch Säurehydrolyse des Analogs freigesetztes
Benzimidazol verhält sich bei Papierchromatographie wie 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol
(Rf --0,78; Rf des aus Vitamin B12 erhältlichen 5,6-Dimethylbenzimidazols
= 0,7,4). Das Absorptionsspektrum des gleichen Hydrolyseprodukts, das nach
der Papierchrornatographie eluiert wurde, hat die für das 5,6-Tetrahydrobenzolbenzimidazol
charakteristischen Absorptionsspitzen bei 281
und 289 m#t, während
das aus Vitamin B" erhältliche Dimethylbenzimidazol Absorptionsspitzen bei
275,5 und 283 m#L hat.
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Das Verfahren zum Abtrennen des in dem Rohextrakt ebenfalls enthaltenen
Vitamins Bi. beruht auf der Eigenschaft 2., nämlich dem Unterschied zwischen den
Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen in dem aus n-Butanol und einer 2411/#gen
Ammoniumsulfatlösung bestehenden Zweiphasensystem.
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Das Verfahren wird in einer automatischen Einrichtung durchgeführt,
die jener ähnlich ist, die von Craig (L. C.
Craig, Anal. Chem., Nr. 22,
S. 1346, 1950; L. C. Craig, W. Hausmann, E. H. Ahrens,
E. Harfenist, ebd., Nr. 23, S. 1236, 1951) beschrieben wurde und 200
Röhren aufweist, wobei die obere Phase im Kreislauf geführt wurde. Die Trennung
ist vollständig, wenn die beiden dem Analog A bzw. dem Vitamin B" entsprechenden
farbigen Schichten klar voneinander getrennt erscheinen.
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Der Gehalt der Röhren wird durch Chromatographie kontrolliert. Die
nur das Analog enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Zu der Alkoholphase wird
ein Lösungsmittel zugesetzt, das die Löslichkeit des Cobalamins herabsetzt, so daß
dieses mit Wasser extrahiert und mit der wäßrigen Phase vereinigt werden kann. Aus
der wäßrigen Salzlösung wird das Analog mit zur Extraktion von Cobalaminen,
d. h. von Vitamin-13,-ähnlichen Substanzen geeigneten Lösungsmitteln, beispielsweise
Phenol oder Naphtholen, ihren Homologen oder Halogenderivaten, allein oder im Gemisch
mit anderen Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, extrahiert.
Dann wird es mit Azeton oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel auf einem Adsorptions-
oder Filtrationsmittel auf der Grundlage von Kieselerde ausgefällt, aus dem es mit
Alkoholen, die eine niedrige Anzahl von Kohlenstoffatomen haben, gelöst wird. Die
alkoholische Lösung wird mit Wasser gemischt, der Alkohol verdampft und das Analog
aus der wäßrigen Lösung durch Zusatz von 3 bis 4 Volumen Azeton ausgefällt.
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Das so erhaltene Analog zeichnet sich durch seine biologische Wirksamkeit
als Wachstumsfaktor für Mikroorganismen, welche Vitamin Bi. brauchen, aus.
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Wie das Vitamin B12 fördert das Analog A das Wachstum von höheren
Tieren, die auf einer Vitamin-B,2-armen Diät gehalten werden.
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Analoge B und C Bei Zusatz von 2,4,5-Triaminotoluol bilden Kulturen
von Nocardia rugosa zusammen mit Vitamin B12 zwei andere Cobalamine (Analoge B und
C), die sich von dem Vitamin Bi. durch folgende Eigenschaften unterscheiden:
a) Bei der Säurehydrolyse geben beide Analoge B und C
eine Substanz ab, die
an ihrem chromatographischen Verhalten, ihrer Fluoreszenz und ihrem Absorptionsspektrum
bei verschiedenen pH-Werten als 5(6)-Methyl-6(5)-aminobenzimidazol erkennbar ist.
Ferner wird eine nicht definierte Substanz gebildet, die ein höheres clircmatographisches
Rf, gelbe Fluoreszenz und eine Absorptionsspitze bei 260 mtL hat und die
ebenfalls in ähnlich sätirebehandelten Lösungen von 5(6)-Methyl-6(5)-aminobenzimidazol
gefunden wird.
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b) Elektrophoreseverhalten: Die beiden Analoge B und
C unterscheiden sich von dem Vitamin BU deutlich durch ihr elektropositives
Verhalten in 0,5 n-Essigsäurelösungen und voneinander durch ihre verschiedenen
Beweglichkeiten zur Kathode.
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c) Chromatographisches Verhalten: Bei der Chromatographie auf Papier
in sek.Btitylalkohol-Essigsäure-Wasser nach j. E. Ford u. a. können die beiden
Analoge B und C von dem Vitamin B" infolge ihrer geringeren Wanderungsgeschwindigkeit
(Rf IRf B" = 0,45) unterschieden werden.
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d) Absorptionsspektrum: Das Absorptionsspektrum der Analoge
B und C unterscheidet sich von dem des Vitamins B" in der Zone zwischen
260 und 330 m#t. In dieser Zone sind zwei Absorptionsbanden bei
278 bzw. 300 bis 305 mp. erkennbar, deren relative Intensität
sich mit dem pH-Wert verändert, während die Bande bei 300
bis 305 m#t
bei pH > 3,6 klarer wird. Das Absorptionsspektrum ermöglicht auch eine Unterscheidung
der beiden Analoge voneinander. Beispielsweise hat das stärker elektropositive Analog
bei pH 3,6 eine sehr deutliche Spitze bei 278 m#L und einen Absatz
bei 295 bis 305 m#t,'während das weniger elektropositive Analog bei
278 und 300 m[i zwei Spitzen von gleicher Intensität zeigt. Dieses
Spektralverhalten bestätigt ebenfalls, daß in den Analogen 5(6)-Methyl-6(5)-aminobenzimidazol
anwesend ist, dessen Ultraviolettspektrum bei einem sauren pH-Wert zwei Spitzen
bei 270 und 278 m#t und bei einem alkalischen pII-Wert eine einzige
Spitze bei 295 mix zeigt.
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e) Biologische Wirksamkeit: Die beiden neuen Analoge B und
C sind als Wachstumsfaktoren für alle Mikroorganismen wirksam, die Vitamin
B,2 brauchen, was durch das Verfahren nach B. D. Davis, E. Mingioli
(j. Bacteriol., Nr. 60, S. 17, 1950) für E. coli 113
',!3, durch das Verfahren nach U. S. P. IV, Third suppl. Revision:
15, 1951, für Lactobacillus leichmannii 7830, durch das Verfahren
von S. H. Hutner, L. Provasoli und G. Filfus (Am. N.
j. Acad. Sci, Nr. 56 (5), S. 856, 1953) für Ochromonas malhamensis und durch
das Verfahren von S. H. H u t n e r u. a. (angeführt von Glick in Methods
of Biochemical Analysis, Bd. II, S. 81, 1957) für Euglena gracilis var. bacillaris
festgestellt wurde.
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Wie das Vitamin B" fördern die beiden Analoge B und C in gleichem
Maße das Wachstum von höheren Tieren (Ratten, Hühnern), die auf einer Vitamin-13,-armen
Diät gehalten wurden. Eine derartige Wirkung wird nach 4- bis 5wöchiger Behandlung
bei einer zweimal wöchentlichen subkutanen Verabreichung von 5 bis 40
y
pro kg Körpergewicht und oraler Verabreichung von 20 bis
80,y pro kg der Diät erzielt. Beträchtliche Mengen der beiden
Substanzen finden sich selbst nach Unterbrechung der Behandlung in dem Serum, der
Leber und der Niere. Außerdem erweisen sich die Analoge B und C bei der Behandlung
von Patienten wirksam, die an perniziöser Anämie, Megaloblastanämie oder Pernicosiformanämie
(nach Gastrektomie) leiden und bewirken dabei eine beträchtliche Erhöhung der Anzahl
der Reticulazyten, des Hämoglobinwertes und der Anzahl der Erythrozyten sowie eine
Herabsetzung des Globularwertes bei ähnlichen Dosen, wie sie bei Vitamin B,2 angewendet
werden.
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Die Trennung der beiden Analoge von dem in dem Rohprodukt enthaltenen
Vitamin B12 und voneinander wird unter Ausnutzung ihrer verschiedenen elektrochemischen
Eigenschaften mit Hilfe des Verfahrens durchgeführt, dasvon H. Dellweg,
E. Becker, X. Bernhauer (Biochem. 2, Nr. 328, S. 88, 1956)
beschrieben wurde. Aus den nach der Elektrophorese erhaltenen 0,5 n-Essigsäurelösungen
werden beide Analoge B und C nach Verfahren gewonnen, die jenen ähnlich sind,
die nach der Gegenstromextraktion für das Analog A angewendet wurden. Im
allgemeinen muß die Elektrophorese der
die weniger elektropositive
Verbindung enthaltenden Fraktion wiederholt werden, damit diese einwandfrei von
der anderen abgetrennt wird.
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Die nachstehenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
| Beispiel 1 |
| Nährsubstrat |
| 4 % Malzextrakt, |
| 4 0/0 Glukose, |
| 1,50/, N-Z-Amin, |
| 0,511/0 Maisquellwasser, |
| 0,501, CaCO" |
| 0,51)10 (NH4)2S04 |
| 0,10/, NaC1, |
| 10millionstel % COC)2' |
.Nach Sterilisieren und Kühlen auf 33'C werden
501
Substrat mit
100 cm' einer Suspension geimpft, die durch Waschen einer Kultur auf einem
Kuchen aus Nähragar erhalten wurde. Die Masse wird
25 bis 40 Stunden bei
33'C vergoren und dabei mit
30 bis
50 1 durchgeblasener Luft/min durchlüftet
und mit
150 bis
300 Uimin gerührt. Wenn die Trübung der Kultur einem
Trockenge-,vicht von
3 bis
5 mgl'cm3 entspricht, wird die erhaltene
Kultur zum Impfen eines größeren Substratvolumens in einem Gärbehälter verwendet.
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Das in dieser Stufe verwendete Substrat hat die oben angebene Zusammensetzung
zuzüglich 100 bis 400 y,/cm3 2,3-Diaminotetrahydronaphthalin, das nach Sterilisation
in wäßriger Lösung oder durch 2stündige Berührung mit 950/,igem Alkohol zugesetzt
wird.
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Nach vollständiger Durchführung der Gärung erhält man 45
1 einer vergorenen Maische, die nach Zusatz von 0,5 % NaCN
30 Minuten lang in einem Autoklav bei 120'C erhitzt werden. Das Mycelium
wird durch Abschleudern und Waschen in Wasser abgetrennt, wobei die Waschablaugen
der klaren Flüssigkeit zugesetzt werden, die dadurch auf ein Volumen von 48
1 gebracht wird. Diese Flüssigkeit wird mit 620 cm3 Kresol gesättigt
und zuerst mit 30/,igem und dann mit 20/,igem Kresol im Gemisch mit Tetrachlorkohlenstoff
in einemVolumenverhältnis von 40: 60 extrahiert. Nach Zusatz von 34 (1f,
Pyridin zu dem Extrakt wird das Gemisch zweimal mit demselben Volumen Wasser gerührt.
Die Vitamin Bl, und das Cobalaminanalog enthaltende wäßrige Lösung wird über ein
ammonisches quaternäres Anionaustauscher-Kunstharz geführt. Das Vitamin B" und das
Cobalaminanalog bleiben im Effluenten und werden nach Zusatz des zum Waschen des
Harzes verwendeten Wassers, wie vorstehend beschrieben, durch Behandlung mit Kresol
und Chloroform aus dem flüssigen Effluenten extrahiert.
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Bei Zusatz von Azeton und Äther zu dem Extrakt erhält man einen flockigen
Niederschlag, der nach Zusatz von einem Adsorptions- oder Filtrationsmittel auf
der Grundlage von Kieselerde auf einem Filter aufgefangen und in 150 cm'
Wasser gelöst wird. Die Lösung enthält 200 mg Vitamin B" und Cobalaminanaloge. Diese
werden auf 200 cm3 mit Cyanursäure behandeltem ammonischem quaternärem Anionaustauscher-Kunstharz
adsorbiert und von diesem Harz mit einer 50/,igen Essigsäurelösung eluiert.
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In dieser Stufe, tritt kein Aktivitätsverlust ein. Nach der Extraktion
mit Kresol und Tetrachlorkohlenstoff, Umfällen und Filtrieren mit einem aus Kieselgur
bestehenden Adsorptions- und/oder Filtrationsmittel, wie vorstehend beschrieben,
wird der Niederschlag in Methanol gelöst, die Lösung auf 20 cm3 eingeengt, 48 Stunden
bei 5'C gelagert, filtriert und mit 25 cm3 'Wasser behandeft. Dann wird die
Lösung auf 20 cm3 eingeengt und mit 70 cm3 Azeton versetzt. Von der Lösung
werden 120 mg Kristalle, welch Vitamin B12 und das neue Analog A enthalten,
abgetrennt und zu auf ähnliche Weise erhaltenen 101 mg zugesetzt. Dann werden
sie in einer Einrichtung nach Craig der Gegenstromtrennung unterworfen, wobei in
jedes Rohr je 25 cm3 n-Butanol und 2401/,ige wäßrige (NH,),SO,-Lösung eingesetzt
werden.
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Die Substanz wird in den ersten fünf Rohren gelöst. Nach 334 Durchläufen
wird in den Rohren 81 bis 115 die nur das gewünschte Analog enthaltende
Fraktion und in den Rohren 51 bis 80 ein Gemisch von Vitamin B" und
dem neuen Analog erhalten.
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Der Inhalt der Rohre 81 bis 115 wird zusammengefaßt.
Aus der Alkoholphase wird das Cobalaminanalog durch Zusatz von 1 Volumen
Tetrachlorkohlenstoff und Schütteln mit Wasser extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird
der wäßrigen Phase zugesetzt und das Gemisch auf 1190 cm3 mit einem Gehalt
von 116 mg Cobalamin eingeengt.
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Die Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, Ausfällung und
Umkristallisation des Analogs
A werden nach Verfahren durchgeführt, die den
vorstehend beschriebenen ähneln. Man erhält
80 mg nadelartige rote Kristalle
mit einem Gehalt von
8004 Cobalamin.
| Beispiel 2 |
| Nährsubstrat |
| 4 Oio Glukose, |
| 2 0.;;!o Laktose, |
| 01/0 Pepton, |
| 0,240/,) Hefeextrakt, |
| 0,2 % X H, P 0, |
| 0,5 % NaH,PO4, |
| 1 % NaC1, |
| 10millionstel % CoC1.- |
Die Gärung erfolgt ähnlich, wie im Beispiel
1 beschrieben, wobei jedcch an
Stelle von 2,3-Diaminotetrahydronaphthalin 100y/cm3 2,4,5-Triaminotoluolhydrochlorid
zugesetzt werden.
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Nach vollständigem Vergären der Maische werden alle Cobalamine, nämlich
das Vitamin B" und die Analoge B und C, ähnlich, wie im Beispiel
1 beschrieben, extrahiert.
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Man erhält 129,4 mg Kristalle mit einem Gehalt von 82,7 mg
eines Gemisches von Bl, und den beiden elektropositiven Cobalaminanalogen B und
C. je 40 mg dieses Gemisches werden in 4 cm3 0,5 n-Essigsäure gelöst
und in eine Kolonne zur Elektrophorese auf Papier nach Dellweg (a. a.
0.) eingebracht. Die Einrichtung wird 48 Stunden lang einer EMF von
1000 V ausgesetzt, worauf die die elektropositiven Faktoren enthaltenden
Schichten am Ende der Zellulosekolonne deutlich erkennbar sind. Dann wird der Strom
abgeschaltet und werden die Schichten einzeln mit 0,5 n-Essigsäure eluiert.
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Aus den vereinigten Lösungen aller Elektrophoreseverfahren werden
nach den im Beispiel 1 beschriebenen Methoden die Cobalaminanaloge B und
C mit Kresol extrahiert und aus Wasser und Azeton umkristallisiert. Man erhält
nadelförmige Kristalle, die bei 37'C unter Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet
werden.
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Aus der am stärksten elektropositiven Fraktion gewinnt man
26,8 mg Kristalle (Gehalt 86,5 "/,). Die weniger elektropositive Fraktion
wird erneut der Elektrophorese unterworfen, um die etwa noch darin enthaltenen kleineren
Mengen des stärker elektropositiven Faktors zu beseitigen.
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Schließlich erhält man 39,9 mg Kristalle von 83,040/,.