DE1299797B

DE1299797B - Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Rhi-12-648

Info

Publication number: DE1299797B
Application number: DES97203A
Authority: DE
Inventors: Dr Hans-Peter; Loeffler; Sigg; Dr Wolfgang
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1964-05-20
Filing date: 1965-05-20
Publication date: 1969-07-24
Also published as: SE315858B; AT259762B; US3428526A; NL6506173A; DK110033C; ES313072A1; CH441623A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfah- zeigt stellenweise eine graubraune Färbung, die durch ren zur Herstellung eines Antibioticums, das nach- Massen dunkelbraunerChlamydosporen hervorgerufen stehend mit Rhi-12-648 bezeichnet wird. Das Anti- wird. Die Chlamydosporen entstehen terminal an den bioticum Rhi-12-648 ist mit den bekannten Anti- Hyphen oder häufiger an kurzen Seitenzweigen der biotica Radicicol und Monorden (R. N. M i r r i η g- 5 Hyphen, sie sind anfangs hyalin, rundlich bis birnenton, E. Ritchie, C.W. Shoppee, oder keulenförmig, später meist rund und dickwandig W. C. Taylor, Tetrahedron Letters No. 7, S. 365, mit braungefärbter, etwas rauher äußerer Membran, 1963, und F. McCapra, A. I. Scο 11, Tetra- meist 8 bis 10μ. groß. Eine zweite Konidienform, hedron Letters No. 15, S. 869,1964) identisch. kleinere hyaline Aleuriosporen, tritt sporadisch im

Ferner ist aus Tetrahedron Letters No. 15, S. 869 ίο Luftmycel auf.

bis 875 (1964), auch bereits ein Verfahren zur Herstel- Die Pilzstämme NRRL 3130 und NRRL 3131

lung des Antibioticums Rhi-12-648, bei dem ein lassen sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Stamm von Monosporium bonorden eingesetzt wird, Nährstoffe enthalten, züchten. So verwerten diese bekannt. Außerdem ist vorgeschlagen worden, das Stämme die für kohlenstoffheterotrophe Organismen genannte Antibioticum Rhi-12-648 mit bestimmten 15 üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Rhizoctoniastämmen herzustellen. Die Ausbeuten Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw. dieser bekannten Verfahren lassen jedoch zu wünschen als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische übrig. stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peton, Hefe oder

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist nun ein Fleischextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Rhi- ao Aminosäuren usw. als Stickstoffquelle, sowie die 12-648 mit zufriedenstellenden Ausbeuten. üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Eine Arbeitsweise zur Herstellung des Antibioticums

Herstellung des Antibioticums Rhi-12-648, das da- Rhi-12-648 mit den beiden genannten Stämmen besteht durch gekennzeichnet ist, daß man den Stamm darin, daß ein flüssiges Nährmedium mit einer Kultur NRRL 3130 oder den Stamm NRRL 3131 der Pilz- 25 von einem der zwei Stämme NRRL 3130 oder NRRL species Humicola grisea Traaen in einer üblichen Nähr- 3131 beimpft und 2 bis 25 Tage bei Zimmertemperatur lösung aerob züchtet und hierauf das Antibioticum inkubiert wird. Die Züchtung kann in ruhender Ober-Rhi-12-648 aus der Nährlösung isoliert. flächenkultur oder submers unter Schütteln oder in

Die Isolierung des Antibioticums kann in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff jeder geeigneten, an sich bekannten Weise, z. B. 30 unter Rühren erfolgen. Sobald eine maximale Menge durch Adsorption oder Extraktion, vorgenommen des Antibioticums Rhi-12-648 produziert worden ist, werden. wird filtriert und das Antibioticum aus dem Kultur-

Der Stamm NRRL 3130 wurde aus Dschungelerde medium durch extraktive oder adsorptive Arbeitsvon Ambalamehene (Ceylon) und der Stamm NRRL methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen. — 3131 aus südafrikanischen Bodenproben isoliert. KuI- 35 Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erturen beider Stämme wurden beim United States wiesen hat, ist die Extraktion mit Essigester, jedoch Department of Agriculture (Northern Utilisation können auch andere organische Lösungsmittel, wie Research and Development Division), Peoria, 111., ζ. B. Benzin, Benzol, Butylacetat, Chloroform oder unter den vorgenannten Nummern deponiert. Butanol, verwendet werden. Anschließend werden die

Die Stämme NRRL 3130 und NRRL 3131 bilden 40 Extrakte vom Lösungsmittel befreit, z. B. durch Abauf den meisten Agarnährböden, wie Kartoffel- dampfen oder Destillation und der Rückstand zur Dextrose-Agar oder Malzagar (z. B. 2°/₀ Malzextrakt, Isolierung des gewünschten Antibioticums auf chroma-Schweiz. Ferment AG., Basel, 2% Difco-Bacto-Agar: tographischem Wege an adsorbierenden Mitteln, wie entmineralisiertes Wasser) mit und ohne Hefeextrakt- aktivierte Tonerde, Kieselgel, Magnesiumsilikat u.dgl. zusatz relativ schnell (etwa 70 mm Koloniedurch- 45 oder mittels Gegenstromverteilung gereinigt. Das messer in 7 bis 10 Tagen bei +27⁰C) ein weißes bis Antibioticum Rhi-12-648 kann wie folgt charakterihellgraues, niedriges, filziges Luftmycel; die Rückseite siert werden:

Schmp. 197 bis 199°, im Heizmikroskop bestimmt; nicht korrigiert.
[a]f = +207° (c = 1,57 in CHCl₃).

UV-Spektrum: Maximum bei 265 ΐημ/log = 4,17 in Methanol.
IR-Spektrum: Banden bei 3100, 2980, 1655, 1572, 1430, 1352,

1310, 1245, 1110, 1045, 983, 925, 845 cm-¹ (KBr).
NMR-Spektren: unter anderem Dublett bei

δ = 1,52 ppm (3 Protonen) und ein Singlett bei δ — 6,68 ppm

(1 Proton) [Me₄Si: δ = 0,00 ppm].

Zur Analyse wurde 12 Stunden bei 25° und 0,01 Torr getrocknet.
C₁₈H₁₇O₆Cl (364,8).

Berechnet C 59,3, H 4,7, O 26,3, Cl 9,7%;

gefunden C 59,1, H 4,6, O 25,1, Cl 10,0 %,

C 59,4, H 4,6, O25,6, Cl 9,9%.

Die thermoelektrische Molekulargewichtsbestim- gelbrote, mit konzentrierter H₂SO₄ eine braunviolette mung ergab Werte von 368 bzw. 382 ±2%. 65 Färbung.

Farbenreaktion: die methanolische Lösung von Das Antibioticum Rhi-12-648 zeigt in vitro

Rhi-12-648 färbt sich nach Zusatz von wäßriger FeCl₃- eine ausgeprägte Hemmwirkung gegen Hefen und Lösung stark violett. In 2n-NaOH erhält man eine Pilze.

	3	Plattf Methode	aitest Konzen tration*	4	Verdünnungsts Methode	,st Hemmung**
	Testorganismen	A	2,0 2,5	Hemmung	M	(4,0)
	Saccaromyces cerevisiae ETH M-108 (S 8)	A	2,5 3,0 3,5 4,0	20 14	M	4,5
efen	Candida tropicalis Derm. Universitätsklinik Zürich 169 (S 1256)	A	2,5 3,0 3,5	28 25 15 Spur	M	4,5 (5,0)
	Candida tropicalis (Thailandia Candida Wardanabuti-S 1063)	B	2,0	26 20 13	0	(4,5).
	Cryptococcus neoformans Derm. Universitätsklinik Zürich (S 1257)	A	2,5 3,0 3,5	Spur	M	(4,5)
B I	Mucor pusillus (S 450)	B	2,0 2,5 3,0	25 15 Spur
Phycon	Rhizopus nigricans (S 1345)	A	2,0 2,5 3,0 3,5	30 35	M	4,5
«ti	Aspergillus fumigatus (S 130)	B	2,0 2,5 3,0 3,5 4,0	35 30 23 15	0	(5,0)
I	Endothia parasitica (S 1248)	B	2,0 2,5 3,0	35 28 24 20 9	0	4,0 (5,0)
ites und.	Fusarium anguioides (S 788)	B	2,0 2,5	etwa25 etwa21 Spur	0	4,0 (5,0)
(U I ο	Myrothecium verrucaria (S 833)	B	2,0 2,5 3,0 3,5	etwa20 Spur	0	(4,0)
U w	Penicillium brefeldianum (S 464)		26 23 15 Spur

Plattentest

Auf eine etwa 3 mm dicke, sterile Agar-Grundschicht in einer Petrischale (Malzagar [2°/₀ Malzextrakt Schweiz. Ferment AG]) wurde eine 1 mm dicke Keimschicht (2°/o Difco-Bacto-Agar-Testorganismus als Zeil- oder Keimsuspension) in geeigneter Dichte (Konzentration) gleichmäßig verteilt. Als Maß für die Hemmwirkung diente der Durchmesser von Hemmzonen um Filterpapierrondellen von 6 mm Durchmesser, die in Lösungen des Antibioticums Rhi-12-648 in Aceton getränkt worden waren, nach geeigneter Inkubation der Testplatten. Es sind Hemmhofdurchmesser in Millimetern als Mittelwerte von mehreren Ablesungen angegeben. Weitere Einzelheiten sind in der nachstehenden Legende zur Tabelle vermerkt.

* = Konzentrationsangaben als negative dekadische Logarithmen der Konzentration, d. h. 3,0 = 1:1000.
A = Ablesung nach 16 bis 20 Stunden Inkubation, 37° C.
B = Ablesung nach 24 bis 48 Stunden Inkubation, 27° C.

Verdünnungstest

Beim Verdünnungstest wird die kleinste Konzentration an Substanz, die jegliche sichtbare Entwicklung des Testorganismus in einem geeigneten Nährbouillort verhindert, bestimmt. Hierzu wird eine 1 °/_oige Lösung des Antibioticums Rhi-12-648 in Aceton hergestellt. Diese Lösung wird hierauf stufenweise mit entmineralisiertem Wasser verdünnt und auf diese Weise eine Reihe von Lösungen, die das Antibioticum Rhi-12-648 in fallenden Konzentrationen enthalten, hergestellt. Diese Lösungen werden nun mit der Suspension eines Testkeims beimpft und untersucht, welche Lösung des Antibioticums Rhi-12-648 gerade noch in der Lage ist, das Wachstum eines Testkeims zu hemmen.

Als Suspensionen der Testkeime wurden bei Hefe verdünnte, 2 Tage alte, auf der Schüttelmaschine bei 27° C gewachsene Kulturen, bei mycel- (und konidien-) bildenden Pilzen Konidienaufschwemmungen in sterilern Wasser mit 0,1% Na-Laurylsulfonat verwendet. Weitere Angaben liefert die nachstehende Legende zur Tabelle.

** = Angegebene Konzentration wie*. Zahlen ohne Klammern:: niederste, noch total oder sehr stark hemmende Konzentrationen; Zahlen in Klammern: schwächere, jedoch deutliche Hemmung bis zur angegebenen Konzentration.

M = Test in 2 % Malzbrühe, Ablesung der niedrigsten Konzentration von Rhi-12-648, die das Wachstum des Testkeims noch hemmt, nach 16 bis 20 Stunden Inkubation bei 37° C.

0 = Test wie M, Ablesung nach 24 bis 48 Stunden Inkubationbei 27°C.

Claims

5 6

Rhi-12-648 besitzt auch eine starke Hemmwirkung Chloroform—Äthanol (99:1) eluierten Fraktionen

auf die Vermehrung von Tumorzellen und kann daher vereinigt, im Vakuum eingedampft und der Rückstand

als Antimitoticum Verwendung finden. Diese Wirkung aus Äther oder Aceton—Pentan umkristallisiert wird:

wurde in vivo durch die Hemmung der Vermehrung Das Antibioticum Rhi-12-648 bildet farblose Kristallvon Tumorzellen sowie in vitro (Zellen des Mäuse- 5 rosetten und schmilzt bei 193 bis 194° (nicht korrigiert).

Mastocytoms P 815) bestimmt. _ . . .

In geeigneter Nährlösung vermehren sich diese Beispiel 2

Tumorzellen in 40 Stunden auf das 4- bis 5fache der 101 einer Nährlösung vom pH etwa 5, die als Lö-

Ausgangszahl. Die DE-50 (Konzentration, welche sungsmittel entmineralisiertes Wasser und pro Liter diese Vermehrung um 50% hemmt) von Rhi-12-648 io 20 g Glucose

gegenüber diesen Zellen ist 10~^7>B (g/ml). Die akute 2 σ ΚΗΡο'

Toxizität von Rhi-12-648 bei der weißen Maus beträgt ₂ « MeSO ^4>7TT O

175 mg/kg i.v. Rhi-12-648 wirkt auch sedativ und γ Malzextrakt

krampfhemmend und kann daher zur Behandlung 2 _ε Hefeextrakt'

verschiedener psychischer und neurotischer Störungen, 15 '

darunter z. B. Schlafstörungen, verwendet werden. enthält, werden in einem 10-1-Fermenter mit einer Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen Kultur des Stammes NRRL 3131, ausgehend von weiter erläutert. Die Temperaturen sind in Celsius- einer Suspension von Mycelteilen und Chlamydospograden angegeben. ren aus einer Agarkultur, während 120 bis 144 Stun-. ao den bei 27° unter Rühren und Belüftung (450 Um-B e 1 s ρ 1 e 1 1 drehungen pro Minute, 51 Luft pro Minute) inkubiert. 101 einer Nährlösung vom pH etwa 5, die als Lö- Danach wird die Kulturlösung über einem Sirupfilter sungsmittel entmineralisiertes Wasser und pro Liter filtriert und das Klarfiltrat dreimal mit je 101 Essig-20 g Glucose ^ester ^ 20° extrahiert. Die mit 3 1 Wasser gewasche-2 g KH PO' «5-neu organischen Phasen werden vereinigt und im 2 ε MgSO **7H O Umlaufverdampfer bei 35° im Vakuum vom Lösungs-2 g Malzextrakt² ' mittel befreit. Der Rückstand wird an der 50fachen 2 s Hefeextrakt' Menge Kieselgel (0,2 bis 0,5 mm) im Durchlaufverfah-' ren chromatographiert. Die mit Chloroform eluierten enthält, werden in einem 10-1-Fermenter mit einer 30 Fraktionen werden verworfen, während die mit Kultur des Stammes NRRL 3130, ausgehend von Chloroform—Äthanol (99:1) eluierten Fraktionen einer Suspension von Mycelteilen und Chlamydospo- vereinigt, im Vakuum eingedampft und der Rückstand ren aus einer Agarkultur, während 168 Stunden bei aus Äther oder Aceton—Pentan umkristallisiert wird: 27° unter Rühren und Belüftung (300 Umdrehungen Das Antibioticum Rhi-12-648 bildet farblose Kristallpro Minute, 101 Luft pro Minute) inkubiert. Danach 35 rosetten und schmilzt bei 193 bis 194° (nicht korrigiert), wird die Kulturlösung über einem Sirupfilter filtriert , und das Klarfiltrat dreimal mit je 101 Essigester bei Patentanspruch: 20° extrahiert. Die mit 3 1 Wasser gewaschenen orga- Verfahren zur Herstellung des Antibioticums nischen Phasen werden vereinigt und im Umlauf- Rhi-12-648, dadurch gekennzeichnet, verdampfer bei 35° im Vakuum vom Lösungsmittel 40 daß man den Stamm NRRL 3130 oder den Stamm befreit. Der Rückstand wird an der 50fachen Menge NRRL 3131 der Pilzspecies Humicola grisea Kieselgel (0,2 bis 0,5 mm) im Durchlaufverfahren Traaen in einer üblichen Nährlösung aerob züchtet chromatographiert. Die mit Chloroform eluierten und hierauf das Antibioticum Rhi-12-648 aus der Fraktionen werden verworfen, während die mit Nährlösung isoliert.