DE1229247B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Rhi-12-648 - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C12d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1229 247

Aktenzeichen: S 92157IV a/30 h

Anmelgetag: 21. Juli 1964

Auslegetag: 24. November 1966

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das nachstehend mit Rhi 12-648 bezeichnet wird. Das Antibioticum Rhi 12-648 entsteht bei der Kultur einer Nährlösung eines der drei Stämme S 1440, S. 1476 und S 1484 der Gattung Rhizoctonia (Fungi imperfecti). Die drei Stämme stimmen morphologisch miteinander überein und wurden in Bodenproben von Sardinien isoliert:

S 1440 Teulada-Rio Chia

S 1476 Baunei

S 1484 Teulada-Giba

Die drei Stämme wurden in der Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois/ USA., deponiert. Die Hinterlegungsbezeichnung für die einzelnen Pilzstamme wurden wie folgt festgelegt:

S 1440 NRRL 3183 ,

S 1476 NRRL 3184

S 1484 NRRL 3185

Verfahren zur Herstellung des neuen
Antibioticums Rhi-12-648

Anmelder:

SANDOZ A. G., Basel (Schweiz)

Vertreter:

^Dr-^W·^Schalk' *%*-*>&■ P- Wirth,
^G' * M- Dannenberg

Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Als Erfinder benannt·

_Dr. Peter Gaiser, Riehen;

Dr. Wolfgang Loeffler, Basel (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 23. Juli 1963 (9165)

Sie bilden auf den meisten Agarnährböden (Kartoffel-Dextrose-Agar, Malzagar, andere angereicherte Nährböden) ein hellgraues bis graubraunes oder dunkelgraues Luftmycel aus, die Rückseite der KuI-türen erscheint schwarz. Die Hyphen sind 1,5 bis 3 μ dick, hyalin, septiert, die Hyphenwände sind gelegentlieh rauh. An der Agaroberfläche entstehen braune Chlamydosporen, die meist neun bis zwanzig sklerotiale Strukturen (Zellpakete) bilden. Die einzelnen Zellen (Chlamydosporen) sind braun, unregelmäßig, rund oder abgerundet, polyedrisch und messen je 7,5 bis 13 μ. Nach ihrer Morphologie beurteilt gehören die Stämme in die Gattung Rhizoctonia (Fungi imperfecti).

Die Züchtung kann in ruhender Oberflächenkultur oder submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff unter Rühren erfolgen bei einer Temperatur von 12 bis 30° C.

Die Pilzstämme S 1440, S 1476 und S 1484 lassen sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nährstoffe enthalten, züchten. So verwenden solche Stämme die für kohlenstoffheterotrophe Organismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrin, Lactose, Rohrzucker usw., als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Hefe oder Fleischextrakte, Ammoniumsulf at, Ammoniumnitrat, Aminosäuren usw., als Stickstoffquelle sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.

Diese Nährmedien werden mit einer Kultur eines der drei Stämme S 1440, S 1476 oder S 1484 beimpft und 2 bis 25 Tage bei Zimmertemperatur inkubiert. Sobald eine maximale Menge des neuen Antibioticums Rhi 12-648 produziert worden ist, wird filtriert und der neue antibiotisch wirksame Stoff aus dem Kulturmedium durch extraktive oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise gewonnen.

Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, ist die Extraktion mit Essigester, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B. Benzin, Benzol, Butylacetat, Chloroform oder Butanol, verwendet werden. Anschließend werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand zur Isolierung des gewünschten Antibioticums auf chromatographischem Wege an adsorbierenden Mitteln, wie aktivierte Tonerde, Silicagel, Magnesiumsilikat u. dgl., oder mittels Gegenstromverteilung gereinigt.

Das neue Antibioticum Rhi 12-648 kann wie folgt charakterisiert werden: Schmp. 197 bis 199⁰C, im Heizmikroskop bestimmt; nicht korrigiert. [<x]f = +207° (c = 1,57 in CHCl₃). UV.-Spektrum: Maximum bei 265 ΐημ/log ε = 4,17 in Methanol (s. F i g. 1) IR.-Spektrum: Banden bei 3100, 2980, 1955, 1572, 1430,1352,1310,1245,1110,1045, 983, 925, 845 cm-¹ (KBr) (s. F i g. 2) NMR.-Spektren: unter anderem ein

609 728/354

Dublett bei <5 = 1,52 ppm (drei Protonen) und ein Singlett bei δ = 6,68 ppm (ein Proton). (Me₄Si: «5 = 0,00 ppm).

Zur Analyse wurde 12 Stunden bei 25° C und 0,01 Torr getrocknet.

C₁₈H₁₇O₆CI (364,8)

Berechnet ..."C59,3, H4,7, O26,3, Cl9,7%;

gefunden ... C 59,1, H 4,6, 0 25,1, Cl 10,0%,

_; -59,4, 4,6, 25,6, 9,9%·

Die thermoelektrische Molekulargewichtsbestimmung ergab Werte von 368 bzw. 382 ± 2%.

Farbreaktionen: Die methanolische Lösung von Rhi 12-648 färbt sich nach Zusatz von wäßriger FeCl₃-Lösung stark violett. In 2n-NaOH erhält man eine gelbrote, mit konzentrierter H₂SO₄ eine braunviolette Färbung.

Das neue Antibioticum Rhi 12-648 zeigt in vitro eine ausgeprägte Hemmwirkung gegen Hefen und Pilze, ίο über die die folgende Tabelle orientiert:

Testorganismen

	A	I	A	I	B	f	A	B	1	A	I	B	[	B	1	B	Plattentes	t	Hemmung	Verdünnungstest	1	O	Ϊ ■	1	0	J	0	Hemmung**
Methode	r	■ ι	r			B ί		Konzen tration*	20 - . 14	Methode	\ M	)■ ■ M	1 0		(4,0) .
- {	f			ι	2,0 2,5	28	|- - M	J	J ' ■■-	J.
r		2,5	25 15		)	1	4,5
3,0 3,5	' Spur	• M
4,0	26		J -■
2,5 '■"■	20		(5,0)
3,0	13 -	M
3,5	Spur ..		- (4,5)
2,0	25
2,5	15		(4,5)
3,0	Spur	O
3,5	30
2,0	■ 35·		—
2,5	.7. .
3,0	35
2,0	35 23	4,5
2,5 3,0	15
3,5	35
2,0	28
2,5	24	(5,0)
3,0	20
3,5	9
4,0	etwa 25
2,0	etwa 21	4,0
2,5	Spur	(5,0)
3,0	etwa 20	4,0
2,0	Spur	(5,0)
2,5	26
2,0	23 15	(4,0) .
2,5 3,0	Spur
3,5

Hefen

Saccaromyces cerevisiae ETH M-108 (S 8) ........

• Candida tropicalis Denn. Universitätsklinik Zürich 169 (S 1256)

Candida tropicalis (Thailandia Candida Wardanabuti-S 1063)

Cryptococcus neoformans Derm. Universitätsklinik Zürich (S 1257)

Phycomycetes

Mucor pusillus (S 450)

Rhizopus nigricans (S 1345)

Äscomycetes und Fungi imperfecti

Aspergillus fumigatus (S 130)

Endothia parasitica (S 1248)

Fusarium anguioides (S 788)

Myrothecium verrucaria (S 833)

Penicillium brefeldianum (S 464)

Plattentest

Auf eine etwa 3 mm dicke sterile Agar-Grundschicht in einer Petrischale (Malzagar, 2% Malzextrakt) wurde eine 1 mm dicke Keimschicht (2% Difco-Bacto-Agar-Testorganismus als Zeil- oder Keimsuspension) in geeigneter Dichte (Konzentration) gleichmäßig verteilt. Als Maß für die Hemmwirkung diente der Durchmesser, von Hemmzonen um Filterpapierrondellen von 6 mm Durchmesser, die in Lösungen des Antibioticums Rhi 12-648 in Aceton getränkt worden waren, nach geeigneter Inkubation der Testplatten. Es sind JHerrimhofdurchmesser in Millimetern als Mittelwerte von mehreren Ablesungen angegeben;

Weitere Einzelheiten sind in der nachstehenden Legende zur Tabelle vermerkt.

* = Konzentrationsangaben als Exponenten der negativen dekadischen Logarithmen, d. h.

3,0 = 1:1000.

A = Ablesung nach 16 bis 20 Stunden Inkubation

bei 37⁰C.
B = Ablesung nach 24 bis 48 Stunden Inkubation bei 27° C.

Verdünnungstest

Eine l%ig^e Lösung des neuen Antibioticums Rhi 12-648 in Aceton wurde mit entmineralisiertem Wasser verdünnt. Auf diese Weise wurden Lösungen zum Zehnfachen der Endkonzentration (Werte der Tabelle) hergestellt und pro Reagensglas 10% des Endvolumens (4 ml), also je 0,4 ml Lösung, zugesetzt. Als Suspensionen der Testkeime wurden bei Hefe verdünnte, 2 Tage alte, auf der Schüttelmaschine bei ao 27° C gewachsene Kulturen, bei mycel- (und konidien-) bildenden Pilzen Konidienauf schwemmungen in sterilem Wasser mit 0,1% Na-Laurylsulfonat verwendet. Weitere Angaben liefert die nachstehende Legende zur Tabelle.

** = Angegebene Konzentration wie *;

Zahlen ohne Klammern: niederste, noch total oder sehr stark hemmende Konzentrationen;

Zahlen in Klammern: schwächere, jedoch deutliche Hemmung bis zur angegebenen Konzentration.

M = Test in 2% Malzbrühe, Ablesung nach 16 bis 20 Stunden Inkubation bei 37° C.

35 O == Test wie M, Ablesung nach 24 bis 48 Stunden Inkubation bei 27 ⁰C.

Rhi 12-648 besitzt auch eine starke Hemmwirkung auf die Vermehrung von Tumorzellen und soll daher als Antimitoticum Verwendung finden. Diese Wirkung wurde durch die Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vivo sowie in vitro (Zellen des Mäuse-Mastocytoms P 815) bestimmt.

In geeigneter Nährlösung vermehren sich diese Tumorzellen binnen 40 Stunden auf das 4- bis 5-fache der Ausgangszahl. Die DE₅₀ (Konzentration, welche diese Vermehrung um 50% hemmt) von Rhi 12-648 gegenüber diesen Zellen ist 10-⁷·⁵ (g/ml).

Die akute Toxizität von Rhi 12-648 bei der weißen Maus beträgt 175 mg/kg i. v.

Rhi 12-648 wirkt auch sedativ und krampf hemmend und kann daher zur Behandlung verschiedener psychischer und neurotischer Störungen, darunter z. B. Schlafstörungen, verwendet werden.

Das neue Antibioticum Rhi 12-648 kann als Heilmittel, ζ. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohol, Gummiarabikum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragoes, Pulver, Cremes, Suppositorien oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und J,bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in dem nachfolgenden Beispiel beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel

Antibioticum Rhi 12-648

Eine Nährlösung mit pH etwa 5,6, bestehend aus 2 g KH₂PO₄,
2 g MgSO₄-7H₂O,
2 g Malzextrakt,
2 g Pepton,
20 g Cerelose und
entmineralisiertem Wasser ad 1,01

wurde in einem 10-1-Fermenter mit einer Kultur des Stammes 1440 inkubiert und unter Belüftung (101 Luft pro Minute) bei 27° während 120 Stunden gerührt (300 Umdr./Min.). Danach wurde die Lösung über Sirupfilter filtriert, das Klarfiltrat zweimal mit je 81 Essigester bei Raumtemperatur extrahiert, die vereinigten organischen Phasen mit 51 destilliertem Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der nach Abdampfen des Lösungsmittels im Umlaufverdampfer bei 35° im Vakuum verbleibende gelbe Rückstand wurde an der 35fachen Menge Kieselgel (M e r c k, 0,2 bis 0,5 mm) im Durchlaufverfahren chromatographiert. Die mit einem Benzol-Benzin-Gemisch (1:1) und anschließend mit Chloroform eluierten Fraktionen wurden verworfen, die mit Chloroform—Methanol (995: 5) eluierten Fraktionen aufgefangen, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand zweimal aus Aceton—Pentan umkristallisiert: Antibioticum Rhi 12-648 als farblose Kristallrosetten vom Schmp. 197 bis 199° (nicht korrigiert).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums Rhi 12-648, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der Stämme NRRL 3183, NRRL 3184 und NRRL 3185 der Gattung Rhizoctonia in einer üblichen Nährlösung unter aeroben Bedingungen züchtet und das Antibioticum aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise isoliert.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   609 728/354 11.66 © Bundesdruckerei Berlin