AT257039B - Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotika 
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 geeigneten Fusariumstammes beimpft und die Kultur 3 - 25 Tage inkubiert wird. Sobald die maximale Menge an Anguidin bzw. Monodesacetylanguidin nachgewiesen werden kann, wird die Kulturlösung filtriert und/oder zentrifugiert und aus dem Filtrat durch Extraktion und/oder Adsorption Anguidin und/oder Monodesacetylanguidin gewonnen. 



   Für die Produktion in technischem Massstab wird die Extraktion bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und billiger ist. Zur Extraktion eignen sich vorzugsweise mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel, wie chlorierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Methylenchlorid,   Äthylenehlorid,   Chloroform   u. dgl., fernerAlkohole, z. B. Butanol,   Amylalkohol u. dgl., Alkylester von Fettsäuren, wie Äthylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Amylacetat u. dgl., Ketone, wie Methylisobutylketon, Methylamylketon u. dgl. Der Extrakt aus der Kulturlösung kann vorteilhafterweise im Vakuum zur Trockene eingedampft werden, wobei man Anguidin und/oder Monodesacetylanguidin in roher Form erhält.

   Die Trennung des so erhaltenen Rohgemisches verschiedener Antibiotika in seine Komponenten und Reindarstellung des Anguidins bzw. des Monodesacetylanguidins kann zweckmässigerweise auf chromatographischem Wege bzw. durch Gegenstromverteilung erfolgen. 



   Anguidin kann wie folgt charakterisiert werden : Anguidin hat einen Schmelzpunkt von 162 bis 
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 [ < x] Ber. :   C62, 28%   H   7, 15% 030, 57'lu  
Gef. : C 62,1% H 7,1% O 30,3% 
Die   Molekulargewichtsbestimmung   nach Rast (Campher) hat das Molekulargewicht 359 ergeben. 



  Das Antibiotikum enthält weder N noch S noch Halogen. Das UV-Absorptionsspektrum in Alkohol zeigt Endabsorption bei 192, 5 ne (log e = 4,02). Das IR-Spektrum zeigt Banden bei 3420,2960, 1735,1680, 1450-1458,1370, 1250, 1170,   11] 0,   1090-1078, 1048-1026, 990, 960, 920, 700   cm-1 (in KBr) (Fig. 1).   



  Chemische Untersuchungen, die mit dem kristallisierten Antibiotikum angestellt wurden, ergaben, dass Anguidin bei der Mikrohydrierung (Palladium-Kohle-Katalysator in Äthanol)   1, 18 Mol Wasserstoff   aufnimmt. Die 0-Methyl-Bestimmung nach Zeissel ergab 0, 0%, die 0-Acetyl-Bestimmung (saure Verseifung) ergab 27, 3%. Die Testreaktionen nach Benedict, Fehling, Tollens, Millen sowie mit Eisenchlorid und Kaliumpermanganat in Aceton sind negativ. Brom wird in Tetrachlorkohlenstoff langsam entfärbt. 



  Anguidin ist löslich in Aceton, Äthanol, Dioxan, Chloroform, Methylenchlorid, Pyridin, Toluol. schwer löslich in Wasser, Diäthyläther, Diisopropyläther, Pentan, Hexen und Heptan. 



   Monodesacetylanguidin kann wie folgt charakterisiert werden : Monodesacetylanguidin kristallisiert 
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 (c = 0,48 in Chloroform). Die Analyse ergab für   CH0 :   
Ber. : C 63,0% H 7, 5%
Gef. : C 62, 93% H 7, 46% 
Das Antibiotikum enthält weder N noch S noch Halogen. 



   Das IR-Spektrum einer Lösung der Substanz in Methylenchlorid zeigt Banden bei3590,3440, 2940, 1730,1670, 1450-1430,1390-1365, 1240,1165, 1105,1073, 1040,988, 960, 935-920   cm-1 (Fig. 2).   



  Die Testreaktionen nach Benedict, Fehling, Tollens, Millon sowie mit Eisenchlorid und Kaliumpermanganat in Aceton sind negativ. Brom in Tetrachlorkohlenstoff wird langsam entfärbt. Monodesacetylanguidin ist löslich in Aceton, Äthanol, Dioxan, Chloroform, Methylenchlorid, Pyridin, Benzol, Toluol, schwer löslich in Wasser, Diäthyläther, Diisopropyläther, Pentan, Hexan und Heptan. 



   Die antibiotische Wirksamkeit von Anguidin wurde mittels Verdünnungstests (2% Malzbrühe, Ablesung nach 20stündiger Inkubation bei 370C) geprüft. Durch Anguidin wird das Wachstum von Candida albicans (Stamm S 5) bei einer Konzentration 1 : 1000 total und das von Saccharomyces cerevisiae (Stamm S 8) partiell gehemmt. 



   Die Wirksamkeit von Anguidin gegen tierische Tumore wurde an experimentellen Impftumoren der Maus nachgewiesen. Zu den tierischen Tumoren, die sich als beeinflussbar erwiesen haben, zählen Sarkom 37 und Sarkom 180 der Maus und das Walker-Carcinosarkom der Ratte. Die folgende Tabelle zeigt die Wirkung von Anguidin bei den genannten Tumoren : 

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<tb> 
<tb> Verträglichkeit
<tb> Art <SEP> Dosis <SEP> Dauer <SEP> % <SEP> Hemmung <SEP> singes.) <SEP> gest.
<tb> 



  Ix <SEP> pro <SEP> Tag <SEP> Tiere
<tb> Sarkom <SEP> 37 <SEP> 4,0 <SEP> mg/kg <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 70 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb> Sarkom <SEP> 180 <SEP> 1, <SEP> 33 <SEP> mg/kg <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 50 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Walker-Carcinosarkom <SEP> 0, <SEP> 5] <SEP> mg/kg <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 79 <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 
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Anguidin besitzt auch eine ausgeprägte Wirkung in der Zellkultur. Die Wirkung auf Kulturen von embryonalen Fibroblasten vom Huhn ergab bei Anguidin einen totalen Mitosestop bis zur Konzentration von   10-7, 5 (0,   03 y/ml). Auch in zehnfach höheren Konzentrationen sind keine Ruhezellschäden zu beobachten. Bei einer Konzentration von   10-8, 0 ist   noch eine partielle Störung des Mitoseablaufes festzustellen. 



   Die Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in vitro (Zellen des Mäuse-Mastocytoms P-815) ergab folgende Resultate : In geeigneter Nährlösung vermehren sich diese Tumorzellen innerhalb 40 h auf das 4-5fache der Ausgangszellzahl. Die DE-50 (Konzentration, welche diese Vermehrung um 50% hemmt) von Anguidin gegenüber diesen Zellen ist 0, 002 y/ml. 



   Die akute Toxizität von Anguidin bei der weissen Maus beträgt DL-50 10 mg/kg i. v. 



   Überdies dient Anguidin zur Behandlung von Blutkrankheiten (beispielsweise myeloischer oder lymphatischer Leukämie) und von Krankheiten des lymphatischen Systems (beispielsweise Lymphogranulom Hodgkin, Lymphosarkom). 



   Werden Hunde mit Dosen von 0, 1 bis 0, 2 mg/kg von Anguidin täglich einmal intravenös behandelt, so findet man nach mehrmaliger Injektion eine starke Senkung der Leukozytenzahl im peripheren Blut. 



   Beispiele vor Behandlung nach Behandlung 
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Anguidin und Monodesacetylanguidin können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren,   wie z. B.   Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können   z.   B. als Tabletten, Dragées, Pulver, Cremes, Suppositorien 
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 Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. 



   Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne dass damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. 



  Die Verhältniszahlen bei Lösungsmitteln beziehen sich immer auf Volumina. 



   Beispiel 1 : Anguidin 
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 tend) werden mit Konidiensuspension des Stammes Fusarium anguioides NRRL 3020 (isoliert aus einer Bodenprobe aus der Gegend von Marseille) beimpft und 25 Tage lang unbewegt bei   270C   bebrütet und danach bei Raumtemperatur (zirka 20 C) durch Baumwollgewebe filtriert. Das sofort   bei-22 C   eingefroreneFiltratwird sechs Wochen später bei 500C Badtemperatur aufgetaut. Zirka 8 1 der gelblich-trüben Lösung (PH 7,2) werden sukzessive mehrmals mit Benzin, Essigester und wassergesättigtem n-Butanol extrahiert ; die Extrakte werden zweimal mit je 1,   5 I   Wasser nachgewaschen und dann im Vakuum bei 500C eingedampft. Der Rückstand des Essigester-Extraktes wiegt 0,60 g ; er wird an 30 g Kieselgel 

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 chromatographiert.

   Die mit Benzol und Chloroform eluierten Teile werden verworfen. Die Fraktionen, die mit Chloroform-Methanol (99 : 1) eluiert wurden, können nach Wegdampfen dieses Lösungsmittelgemisches und Zugabe von wenig Benzol kristallisiert werden ; in den Mutterlaugen verbleiben grössere Mengen eines gelben Öls. Durch Umkristallisieren aller kristallinen Fraktionen aus Benzol-Hexan wird Anguidin gewonnen. Smp.   162 - 1630C. Die   Substanz lässt sich am Hochvakuum (0, 01 mm Hg) bei 1200C Badtemperatur sublimieren ; das Sublimat zeigt den gleichen Smp. und Rf- Wert im DünnschichtChromatogramm wie das Kristallisat. 



   Beispiel 2 : Anguidin
Der gleiche Stamm wie im Beispiel 1 wird in einem Fermenter (New Brunswick Co., New Brunswick, U. S. A., Typ FS 314) ebenfalls von einer Konidiensuspension ausgehend, in 10   l   einer Nährlösung, welche von der im Beispiel 1 erwähnten nur dadurch abweicht, dass das Natriumnitrat durch 4   g NH4NC\ p. a.   pro Liter ersetzt worden ist, 113 h lang unter Rühren (450 Umdr/min) und Belüftung (5   l   Luft/min bei 27 C) inkubiert. Das Mycel wird durch Filtration abgetrennt und das klare, gelbe Filtrat (PH 5, 0) mit Essigester mehrmals extrahiert. Die Extrakte wrden zweimal mit 11 Wasser nachgewaschen und gemeinsam in einem Umlaufverdampfer stark eingeengt. Das Konzentrat wird in einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft.

   Der Rückstand (1, 94 g) wird zwischen gleichen Volumina Petroläther und   90'1obigem   wässerigem Methanol verteilt ; in der Methanol-Wasser-Phase verbleiben 1,68 g Material, welches an 85 g Kieselgel chromatographiert wird. Mit Chloroform-Methanol (99 : 1) wird das Material eluiert. 



  Kristallisation aus Benzol-Heptan ergibt 0, 39 g Anguidin vom Smp. 162-164 C. 



     Beispiel 3 :   Anguidin und Monodesacetylanguidin
Mit einer Kultur von Fusarium sambucinum, Stamm   ATCC 11852,   werden in einem Fermenter   101   einer Nährlösung, die pro Liter 20 g Glucose (Cerelose Sandoz), 2 g Pepton (Cudahy), 2 g Malzextrakt 
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 (450 Umdr/min) und Belüftung (5 1 Luft/min) inkubiert. 



   Die dunkelrote Kulturbrühe wird filtriert und das Filtrat der Reihe nach je dreimal mit 10   l   Benzin, 10   l   Äthylacetat und 10 1 n-Butanol extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird mit   21   Wasser nachgewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt. 



   Der Eindampfrückstand wird in Chloroform gelöst und an 4,18 g Kieselgel chromatographiert. Die mit Chloroform eluierten Anteile werden verworfen. Die mit Chloroform-Methanol   (199 : 1)   eluierten Fraktionen geben   aus Äther-Hexan kristallines Anguidin.   In den   mit Chloroform- Methanol (1 : 1)   eluierten Fraktionen kann Monodesacetylanguidin dünnschichtchromatographisch nachgewiesen werden. 



   Beispiel 4 : Anguidin und Monodesacetylanguidin
Eine Kultur von Fusarium scirpi (Stamm S 1497) wird in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit je 100 ml der gleichen Nährlösung wie bei Beispiel   1,   jedoch ohne Bacto yeast extract (Difco) 25 Tage lang bei   270C   inkubiert. 37 solcher Kulturen werden durch Filtration vom Mycel getrennt und das Kulturfiltrat mit dreimal je 2   l   Äthylacetat extrahiert, die Extrakte mit wenig Wasser nachgewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird an 30 g Kieselgel chromatographiert. Die mit Benzol und Chloroform eluierten Teile werden verworfen. Die mit Chloroform-Methanol   (199 : 1)   eluierten Fraktionen geben aus Äther-Hexan kristallisiertes Anguidin vom Smp. 155-1620C.

   In den mit Chloroform-Methanol (199 : 1) eluierten Fraktionen kann Monodesacetylanguidin dünnschicht-chromatographisch nachgewiesen werden. 



   Beispiel 5 : Monodesacetylanguidin
Mit einer Kultur von Fusarium anguioides (Stamm NRRL 3020) werden in einem Fermenter 10 l einer Nährlösung, die pro Liter 30 g Glucose   (Cerelose Sandoz), 2 g Malzextrakt (Schweiz. Ferment A. G.),   2 g Bacto yeast extract (Difco), 4 g Ammoniumnitrat p. a., 2 g Kaliumdihydrogenphosphat p. a., 2 g    Magnesiumphosphat. 7 Hp p.   a., 28 mg   Eisen- (II) -sulfat. 7 HzO   p. a., 3 mg   Zinksulfat. 7 HzO   p. a. und entmineralisiertes Wasser ad 1   l   enthält, 135 h lang bei   270C   unter Rühren (1450 Umdr/min) und Belüftung (5   l   Luft/min) inkubiert.

   Die Kulturbrühe wird in einer Becherzentrifuge in einen festen Schlamm und eine schwach trübe Lösung getrennt. 7,0 1 der überstehenden Lösung werden zweimal mit dem gleichen Volumen Essigester und anschliessend dreimal mit demselben Volumen n-Butanol extrahiert. 



   Die organischen Lösungsmittel werden je zweimal mit Wasser gewaschen und einzeln im Umlaufverdampfer am Wasserstrahlvakuum eingeengt. Der aus dem Essigester-Extrakt nach gründlicher Trocknung im Hochvakuum verbleibende Rückstand wird zweimal zwischen je 100 ml Petroläther und 100 ml   90%igem wässerigem Methanol   verteilt. Der   nach Einengen und Trocknen des Methanol- Wasser- Extraktes   

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