DE1017329B - Herstellung und Gewinnung eines pilzwirksamen Antibiotikums - Google Patents

Description

• Herstellung und Gewinnung eines pilzwirksamen Antibiotikums Während die bisher bekannten und therapeutisch verwendeten Antibiotika, z. B. die Penicilline, Tetracyline, Chloramphenicole und Erythromycine, durch eine in der Hauptsache gegen Bakterien gerichtete Aktivität gekennzeichnet sind, fehlt es noch immer an geeigneten Antibiotika, die gegen pathogene Hefen und Pilze wirksam sind. Da besonders in letzterer Zeit durch die häufige Anwendung von Breitspektrumantibiotika die Zahl der auftretenden Pilzinfektionen (Soorinfektionen) ständig im Ansteigen ist, erscheint es angebracht, bevorzugt nach solchen Substanzen zu suchen, die hier eine spezifische Wirksamkeit besitzen.
• Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung und Gewinnung eines neuen pilzwirksamen Antibiotikums, das bei der gelenkten Kultivierung einer bisher nicht beschriebenen Streptomycesart, im folgenden Streptomyces sanguineus nov. spec. 1762 genannt, gebildet wird und aus dem Mycel isoliert werden kann. Das neu aufgefundene Antibiotikum, das sich hinsichtlich seiner chemischen und physikalischen Merkmale eindeutig von den in der Literatur beschriebenen pilzwirksamen Substanzen abgrenzen lädt, besitzt bereits in niederen Konzentrationen eine ausgezeichnete Wirksamkeit sowohl gegen humanpathogene als auch phytopathogene Hefen und Pilze, so daß es sich besonders zur Bekämpfung dieser Erreger eignet.
• Der zur Bildung des neuen Antibiotikums befähigte Mikroorganismus, der aus einer indischen Bodenprobe isoliert wurde, gehört nach dem Bestimmungsschlüssel in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (6. Auflage) zur Gruppe der Actinomycetales und zur Gattung Streptomyces. Der neue Stamm Streptomyces sanguineus nov. spec. 1762 (Sammlung des Erfinders) unterscheidet sich in zahlreichen Eigenschaften von den in dem obengenannten Bestimmungsschlüssel aufgeführten Streptomycesarten. Die morphologischen und physiologischen Merkmale des neuen Stammes sind in der Tabelle I zusammengestellt. Als Hauptmerkmal des Streptomyces sanguineus ist die blutrote bis eosinrote Farbe seines vegetativen Mvcels zti nennen, die fast auf allen diagnostischen Nährböden vorherrscht und zur Namensgebung (sanguineus = blutrot) führte. Eine Gegenüberstellung der in Bergeys Manual aufgeführten und der in der sonstigen Antibiotikaliteratur beschriebenen rotgefärbten Stämme erfolgt in Tabelle Il.
• Aus der Tabelle 1I ist ersichtlich, daß sich der beanspruchte Stamm deutlich in seinen kulturellen Eigenschaften von den bisher bekannten und beschriebenen rotgefärbten Streptomycesarten unterscheidet, wodurch eine Abgrenzung als nov. spec. gerechtfertigt erscheint.
• Zur Produktion des neuen, pilzwirksamen Antibiotikums wird der Stamm Streptomyces sanguineus nov. spee. 1762 unter subinersen Bedingungen bei Zuführung von Luft vorzugsweise in einem Nährmedium gezüchtet, das als Stickstoffquelle Sojamehl und als Kohlenstoffquelle Stärke und/oder Glukose und verschiedene pflanzliche und tierische Öle, wie Sojaöl oder Ölsäure, sowie als Puffersubstanz Calciumcarbonat enthält. Die Fermentation erfolgt bei 26 bis 32° und ist in der Regel nach 3 bis 5 Tagen beendet. Die pii-Kurve zeigt einen sehr flachen Verlauf, der Anfangswert beträgt p$ 6,6 bis 6,8, der Endwert darf 7,4 nicht überschreiten. Die antibiotische Aktivität des Mycels wird nach vorhergehender Extraktion im Reihenverdünnungstest gegen Candida albicans ermittelt.
• Nach Erreichen maximaler Aktivität erfolgt die Abtrennung des Mycels von der Kulturlösung mit Hilfe einer Filterpresse oder Zentrifuge. Für die nachfolgende Extraktion ist es vorteilhaft, wenn das Mycel vorher mit einer Mahlvorrichtung zerkleinert wird. Als Extraktionsmittel eignen sich vor allem niedere aliphatische Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol und Butanol. Bei den mit Wasser mischbaren Alkoholen darf ein gewisser Wassergehalt nicht überschritten werden, da sonst die Löslichkeit des Antibiotikums in dem Gemisch aus Wasser und Alkohol zu gering wird. Man befreit die erhaltenen Extrakte im Vakuum vom organischen Lösungsmittel und schüttelt den wäßrigen Rückstand mit Chloroform oder Äther aus. Die aktive Substanz scheidet sich in der Zwischenschicht in fester Form ab; nach dem Abtrennen aus dieser Zwischenschicht wird das Antibiotikum getrocknet und durch Auflösen in heißem Methanol und Einengen zur Kristallisation gebracht. Führt man die Extraktion des Mycels mit Butanol durch, so kann man die aktive Substanz aus der Butanollösung durch Zugabe von Äther oder Petroläther direkt ausfällen und durch Umkristallisieren aus Methanol kristallin erhalten.
• Ist der Gehalt der anfallenden Rohprodukte an Antibiotikum unter 30°/o., so ist eine weitere Reinigung und Anreicherung erforderlich. Dies kann nach mehreren Methoden geschehen, z. B. durch Adsorption aus der methanolischen Lösung an Aluminiumoxyd oder Tierkohle oder durch erneute Abscheidung in der Zwischenschicht aus Chloroform-' 1lethanol-Wasser-1.Iischungen oder Chloroform- Propylenglykol-Wasser-Mischungen.
• Bei der Gewinnung des Antibiotikums aus dem Mycel kann man auch so vorgehen, daß man das Mycel trocknet und finit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, z. B. - Äther, Petroläther oder Benzol, Fettsubstanzen und farbige Verunreinigungen herauslöst. Aus dem Rückstand gewinnt man das Antibiotikum durch Extraktion mit einem Lösungsmittel, in dem es gut löslich ist, z. B. einem niederen aliphatischen Alkohol, Dimethylformamid oder Pyridin.
• Eine weitere Möglichkeit zur Anreicherung und Reinigung des Antibiotikums aus den Mycelextrakten besteht darin, daß man .es mit einem Adsorptionsmittel, z. B. Aluminiumoxyd, einer anderen Erde oder Aktivkohle, behandelt und das Antibiotikum mit einem Lösungsmittel aus dem Adsorbat eluiert. Als Eluierungsmittel sind besonders Mischungen aus Butanol und Wasser geeignet.
• Das Antibiotikum kristallisiert aus heißem Methanol in langen, farblosen bis schwachgelb gefärbten Nadeln. Es ist eine neutrale Substanz, in der die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthalten sind. Seine Analyse ergibt folgende Werte: C 62,05%, H 9,15% und 0 28,85%.
• Der Schmelzpunkt ist von der Art des Erhitzens abhängig. Im Schmelzpunktsblock erfolgt ein Erweichen und Zusammenbacken im Bereich von 190 bis 210°, während auf der Kofler-Bank ein scharfes Schmelzen bei 248 bis 250° eintritt. Die spezifische Drehung beträgt [a]ti -175°.
• Das Antibiotikum ist gut löslich in Dimethylformamid, N-Methylformamid und Pyridin, löslich in Methanol, Äthanol, Propylalkohol und Butanol, wenig löslich in Aceton und schwerlöslich oder unlöslich in Äther, Benzol, Methyl-, Äthyl-, Butyl-, Amylacetat. Chloroform und Petroläther, ebenfalls schwerlöslich in Wasser.
• Das UV-Spektrum ist durch die folgenden Absorptionsmaxima gekennzeichnet:

  335 m#t; (E i m =1563)

  338 m#t; (E i m =1568)

  322 m#t; -(Ei 1 = 954)

  Eine weitere Schulter =liegt bei 305 bis 307 mit.
• Das Ultrarotspektrum ist in der Anlage beigefügt. Antibiotisches Wirkungsspektrum: Die Auswertung der kristallisierten Reinsubstanz ergibt im Reihenverdünnungstest folgende Werte:

  Teststamm Hemmung bei y/ml

  Candida albicans 504 . . . . . . . . . . . . . . 1

  Microsporum gypseum 323 . . . . . . . . 0,25 bis 0,5

  Epidermophyton rubrum 325 ...... 0,25

  Trichophyton mentagrophytes 526 .. 2

  Alternaria spec. 71 . .. .. .. .. . . .. .. . 1

  Beispiel 1 Gewinnung des Impfmaterials Das Impfmaterial wird unter Verwendung des nachfolgend aufgeführten Nährbodens in 2000-ccm-Erlenmeyerkolben bei einer Füllung von 400 ccm durch Züchtung in Schüttelkultur (200 Umdr./Min.) bei 26° gewonnen. Die Beimpfung erfolgt mit der Abschweminung einer 6 bis 8 Tage alten Schrägagarkultur des Streptomyces sanguineus nov.spec. 1762. Nährboden für das Impfmaterial Pepton ........................... 20 g Glukose ........................... 10 g Hefextrakt ........................ 5 g Na Cl ........... . . ........... 5 g Mg S 04 .......................... 1 g Zn S 04 ........................... 0,01 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . ... 10 g Aq.dest. .......................... 11 Fermentation Von dem Nährboden folgender Zusammensetzung: Sojamehl ........................... 10 g Glukose .. .. .. ...................... 10 g Na C1 .............................. 5 g Leitungswasser ..................... 11 werden 501 in einem 1001 fassenden Fermenter angesetzt und 45 Minuten bei 121' autoklaviert. Nach dem Abkühlen beimpft man bei einem pH von 6,6 bis 6,8 mit einer 48stündigen Schüttelkultur, wobei die Impfmenge etwa 1 bis 2% des Fermenterinhaltes beträgt. Die Kultivierung erfolgt bei 26° unter Rühren (360 Umdr./Min.) und kräftiger Belüftung (301 Luft pro 1 Flüssigkeit/Stunde). Das Abernten erfolgt nach 92 Stunden bei einem End-PH von 7,0. Von diesem Ansatz wird mit Hilfe einer Filterpresse das Mycel abgetrennt und in feuchtem Zustand bei Zusatz von 750g Seesand im Mörser zerrieben, danach mit 5 1 Methanol versetzt und 12 Minuten auf einer Schüttelmaschine extrahiert. Mit Hilfe einer Becherzentrifuge werden die Mycelrückstände abgetrennt und einer weiteren 5stündigen Extraktion mit 3 1 Methanol unterworfen.
• Nach der Abtrennung des Mycels werden die Methanolextrakte vereinigt und im Vakuum auf 11 eingeengt. Danach setzt man 500 ccm Chloroform und 11 Wasser hinzu, mischt das ganze gut durch und trennt die Schichten in einer Zentrifuge.
• Die Zwischenschicht wird isoliert, mit Chloroform und Äther ausgewaschen und im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wiegt 2,3 kg bei einem Gehalt von 60°/a Antibiotikum. Zur Kristallisation wird das Produkt mit 50 ccm Methanol erwärmt, der unlösliche Anteil nochmals mit 10 ccm Methanol extrahiert und die methanolische Lösung im Vakuum auf 20 ccm eingeengt. Nach 12stündigem Stehen im Kühlschrank wird das ausgeschiedene Kristallisat abgesaugt und mit Methanol und Äther ausgewaschen. Es werden 1,1 g des kristallinen Antibiotikums erhalten. Beispiel 2 13 kg Mycel werden mit Hilfe einer Schlagscheibenmühle unter Zusatz von etwas Wasser zerkleinert, hierauf wird die Mischung nach Zusatz von 8 1 `Nasser und 18 1 Butanol 12 Stunden bei guter Durchinischuug extrahiert. _-#Iit Hilfe einer Zentrifuge wird der feste Rückstand abgeschleudert, die Phasen werden getrennt, und der fest Rückstand wird nochmals finit 101 Bntanol und 81 Wasser einer Nachextraktion unterworfen. Die erhaltene Butanolphase wird mit der ersten vereinigt und das Butanol mit 51 Wasser ausgewaschen. Anschließend wird der Butanolextrakt iisi Vakuum auf 11 eingeengt und mit 51 Äther die aktive Substanz ausgefällt, abzentrifugiert, finit Äther nachgewaschen und getrocknet.
• Es werden 25 g eines Produktes erhalten, das einen Gehalt von 454/a an aktiver Substanz aufweist.
• Zur weiteren Reinigung und Anreicherung wird dieses Trockenprodukt in 11 Propylenglykol unter gelindem Erwärmen gelöst, der unlösliche Anteil durch Zentrifugieren entfernt, die klare Lösung mit 1,3 1 Chloroform und 650 ccm Wasser versetzt und 15 Minuten auf der Schüttelmaschine geschüttelt. llan trennt die Schichten in einer Becherzentrifuge und isoliert die Zwischenschicht. Sie wird zweimal mit je 40 ccm Aceton gewaschen und mit Äther getrocknet. Die Ausbeute an gereinigtem Produkt beträgt 11 g.
• Nach dein mikrobiologischen Test besitzt das Produkt einen Gehalt von 85"/o des Antibiotikums. Durch Verdünnung der Wasser-Propylenglykol-Schicht mit etwa 3 Teilen Wasser scheidet sich ein weiterer Teil des Antibiotikums ab. Die getrocknete Menge beträgt 1,5 g, sein Reinheitsgrad 55°/o.
• Die Hauptmenge des gereinigten Antibiotikums wird nach dem Beispiel 1 aus heißem Methanol zur Kristallisation gebracht, wobei 7,5 g des kristallinen Antibiotikums erhalten werden. Beispiel 3 50 ccm eines Methanolextraktes, gewonnen durch Extraktion des Mycels mit Methanol, mit einem Gehalt von 53 mg des Antibiotikums, werden mit 250 mg Aktivkohle 30 Minuten geschüttelt. Die Kohle wird aus der methanolischen Lösung durch Zentrifugieren entfernt und zweimal mit je 5 ccm Wasser ausgewaschen. Die mit Kohle behandelte methanolische Lösung enthält noch 2,3 mg des Antibiotikums. Zur Eluierung behandelt man die Kohle mit 25 ccm Butanol und 10 ccm Wasser 2 Stunden auf einer Schüttelmaschine und trennt die entstandenen Schichten voneinander. In der butanolischen Phase befinden sich 43 mg des Antibiotikums. Es kann, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, zur Kristallisation gebracht werden. Beispiel 4 501 der nachfolgend aufgeführten Kulturlösung werden nach dem Sterilisieren mit 2 Volumprozent einer 48 Stunden alten Vorkultur beimpft und 4 Tage bei 26° und 601 Luft/1 Flüssigkeit/Std. im 100-1-Fermenter kultiviert. Zusammensetzung der Nährlösung Sojamehl ....................... 20 g Glukose ......................... 15 g Specköl oder Sojamehl . .. . . . . . . . . 15 g Na C1 ... .. .. .................... 5 g Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ccm Nach Beendigung der Fermentation wird das Mycel mit einer Zentrifuge abgetrennt, wobei 3,5 kg feuchtes Mycel erhalten werden. Dieses wird im Anschluß daran mit einer Schlagscheibenmühle zerkleinert und dann mit 10 1 Methanol 12 Stunden bei Raumtemperatur unter Rührest extrahiert. Danach trennt man das Mycel ab und wäscht nochmals mit 41 Methanol nach. Die methanolischen Lösungen werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Die zurückbleibende wäßrige Suspension wird mit 1 1 Chloroform versetzt und gut durchmischt. Man trennt die Schichten in einer Zentrifuge, isoliert die Zwischenschicht, wäscht diese mit Chloroform und Äther aus und trocknet sie im Vakuum. Erhalten werden 44 g eines Rohproduktes mit einem Gehalt an Antibiotikum von 79,3%. Die Weiterreinigung dieser Substanz wird nach Beispiel l durchgeführt, wobei 34,5g des kristallisierten Antibiotikums erhalten werden.

  Tabelle I

  Stamm 1762 Streptomyces sanguineus nov. spec.

  Xv°Jachs- Kolonie- Kolonie-

  Nährboden tums- Farbe des Luftmycels Lösliches rückseite oberfläche Bemerkungen

  grad und der Sporen Pigment (Farbe) (vegetat. Mycel)

  1. Synthetischer Agar sehr gut Luftmycel grau- rotbraun eosinrot, im karminrot

  weiß-weißrosa, Alter rotbraun

  Sporenbelag meh-

  lig hellrosa bis

  Maßerika, hell-

  braune Tränen

  2. Synthetische gut- Deckenbildung, rotbraun- rosa- untergetaucht, Trommsdorff

  Nährlösung sehr gut Luftmycel zunächst dunkelbraun karminrot Mycel creme- negativ

  weißrosa, später rosa (keine Nitrat-

  blaßbraun reduktion)

  3. Glukose-Brühe gut Ringbildung, Luft- dunkelbraun blaßeosinrot creme,

  mycel weiß, später am Rand

  rosarot zentral

  eosinrot

  Wachs- Kolonie- Kolonie-

  Nährboden tums- Farbe des Luftmycels Lösliches rückseite oberfläche Bemerkungen

  grad und der Sporen Pigment (Farbe) (vegetat. Mycel)

  4. Glukose-Agar sehr gut anfänglich weiß sehr intensiv burgunderrot

  mit rosa Tönung, braun bis rotbraun

  später zentral

  bräunlich-grau-

  braun

  5. Glukose- sehr gut weißes-blaß- hellbraun eosinrot

  Asparagin-Agar braunes samtiges (spärlich), bei

  Luftmycel, Sporen 37° fast ganz

  mehlig rosarot fehlend

  6. Calcium sehr gut Luftmycel weiß, braunrot eosinrot-, vor Luft-

  Malat-Agar später grauweiß, (intensiv) später mycel-

  eosingetönt, zentral schwarzbraun entwicklung

  hellbraun eosinrot,

  metallisch

  glänzend

  7. Stärke-Agar gut Luftmycel weiß, fehlt rosarot rostrot mäßige

  später blaßbraun Stärke-

  hydrolyse,

  Durchmesser

  Kolonie

  38 mm,

  Durchmesser

  Hydrolyse-

  zone 60 mm

  B. Nähr-Agar gut weiß, mehlig braun braunrot- braimrot-

  kupferrot kupferrot

  9. Cellulose-Agar spärlich Luftmycel weiß, fehlt blaßeosin- rosa-

  nur spärlich ent- farben fleischfarben

  wickelt

  10. Milch-Agar sehr gut fehlen dunkelbraun, dunkelbraun zentral kein Kasein-

  sehr intensiv rotbraun, abbau

  Randzone

  creme, gefaltet

  11. Emerson-Agar sehr gut anfänglich weiß mit braun, rotbraun radial gefaltet,

  rosa Tönung, später sehr intensiv Sektoren-

  bräunlich Bildung, bevor

  Luftmecyl ge-

  bildet, zentral

  dunkelrot-

  eosinfarben,

  Rand creme

  12. Bouillon-Gelatine mäßig, spärlich, weiß, blaß- braun rotbraun stark spärliche

  sehr rosa, Sporen rosa gekräuselt Gelatine-

  langsam verflüssigung

  13. Gelatine- mäßig, fehlen braun- rotbraun rotbraun langsames

  Stichröhrchen sehr schwarzbraun Einsinken der

  langsam Kolonie

  (mäßige

  Gelatine-

  v erflüssigung)

  sehr gut Sporen rosa, spär- eosinrot eosinrot weder

  14. Lackmusmilch liches Luftmycel (starke Koagultion

  Decken- noch Peptoni-

  bildung) sierung

  15. Kartoffelscheibe sehr gut mehlig, rosa- schwarzbraun runzelig,

  erikafarben, später creme

  Lavendel, zentral

  starkes, bräunliches

  Luftmycel (samtig)

  16. Möhrenscheibe sehr gut weiß, zentral bräun- zentral blaß-

  lich, am Rande rosa- eosin, Rand

  gefärbt cremefarben

  Tabelle II

  Vergleich des Streptomyces sanguineus nov. spec. 1762 mit den in der Literatur beschriebenen,

  rotgefärbten Streptomycesarten

  Unterscheidungs- Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces

  merkmale sanguineus ruber rubescens rubrireticuli purpurascens

  Lackmusmilch weder koaguliert Koagulierung -I- weder Koagulierung -f- keine

  noch peptonisiert Peptonisierung Koagulierung Peptonisierung Peptonisierung

  noch

  Peptonisierung

  Gelatine Verflüssigung keine Verflüssigung

  Verflüssigung

  Nitratreduktion fehlt vorhanden ? vorhanden ?

  Glukose-Agar weiß bis rosa, korallenrot weiß rosenrot kreideweiß

  später bräunlich opaleszierend

  getönt

  Kartoffelscheibe rosa bis lavendel, grünliches ? cremefarben, schneeweißes

  später bräunliches Wachstum später dunkelrot Luftmycel

  Luftmycel

  Synthetische creme bis rosa, scharlachpurpur,

  Nährlösung Luftmycelweißrosa, Luftmycel weiß

  später. bräunlich

  Luftmycel niemals reinweiß, stets schneeweiß

  sondern stets rosa, oder kreideweiß

  grauweiß oder

  blaßbraun

  Lösliches Pigment braunrot bis dunkel- nie braunrot bis

  braun dunkelbraun,

  sondern orange

  ° bis karminrot

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von Streptomyces sanguineus nov. spec. 1762 zur Herstellung eines pilzwirksamen Antibiotikums auf biologischem Wege und Gewinnung des Antibiotikums, gegebenenfalls in kristalliner Form, durch Extraktion des Mycels und Ausfällung, gegebenenfalls nach Adsorption des Extraktes mit anschließender Elution.