Verfahren zur Herstellung eines fungiciden Antibiotikums Es wurde gefunden, dass eine aus Wüstensand isolierte Streptomyces-Species, von welcher in dem pharmazeutischen Institut der Medizinischen. Fakul tät der Universität in Debrecen ein Stamm unter der Bezeichnung Streptomyces SA-IX hinterlegt wurde, ein fungicid wirkendes Antibiotikum erzeugt.
Zudem hat sich gezeigt, dass eine natürliche, beständige Vari- ante des genannten Stammes, welche bei obigem In stitut hinterlegt und als SA-IX-3 registriert wurde und welche morphologisch von dem obenbezeich- neten Stamm SA-IX abweicht, das .gleiche fungi- cid wirkende Antibiotikum in noch grösserem Masse erzeugt. Dieses Antibiotikum wurde mit dem Namen Flavofungin bezeichnet.
Die neue Variante SA-IX-3 hat den Namen Streptomyces Flavofungini n. sp. er halten.
Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung des .neuen Antibiotikums Flavofungin, welches dadurch ,gekennzeichnet ist, dass man den Flavofungin produzierenden Streptomyces-Stamm SA-IX oder eine Mutation oder Variation davon aerob in einem wässrigen Nährmedium kultiviert und das gebildete Antibiotikum von dem Gärungsmedium abtrennt. Das so erhaltene Antibiotikum ist ein gel bes kristallines Produkt.
Das erfindungsgemäss erhal tene Flavofungin besitzt in verhältnismässig niedrigen Konzentrationen eine wachstumsverhindernde Wir kung auf pathogene und nichtpathogene Hefen und hefeartige Pilze, Dermatophytes und Fadenpilze. Die oharakteristischen,
morphologischen und biochemi schen Eigenschaften von Streptomyces SA-IX und SA-IX-3 sind aus der nachfolgenden Tabelle er sichtlich:
EMI0001.0054
SA-IX <SEP> SA-IX-3
<tb> Luftmycelien <SEP> gerade <SEP> abgezweigte, <SEP> weisse <SEP> Sporen <SEP> grün, <SEP> keine <SEP> Sporen
<tb> Pigmentbildung <SEP> gelbgrün <SEP> dunkelgrün
<tb> Geruch <SEP> erdartig, <SEP> muffig <SEP> erdartig, <SEP> muffig
<tb> Czapek- Dox <SEP> Glucose-Agar <SEP> gutes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> weissem <SEP> gutes <SEP> Wachstum, <SEP> gelbgrüne,
<tb> Luftmycel <SEP> runzelige <SEP> Hyalin-Kolonien,
<tb> keine <SEP> Sporen
<tb> Czapek- Dox -Agar <SEP> mit <SEP> schneeweissen <SEP> Luftmycelen <SEP> grüngelbe <SEP> Kolonien <SEP> mit <SEP> fleckigen
<tb> mit <SEP> Saccharose <SEP> bedeckte <SEP> Kolonien <SEP> weissen <SEP> Luftmyceden
<tb> Czapek- Dox -Agar <SEP> grüngelbe <SEP> Hyalin-Kolonien, <SEP> lebhaft <SEP> grüne, <SEP> runzelige <SEP> Hyalin glyzerinhaltig <SEP> Luftmycelen <SEP> weiss,
<SEP> fleckig <SEP> Kolonien, <SEP> keine <SEP> Sporen
<tb> Asparagin-Glucose-Agar <SEP> gelbes, <SEP> runzeliges, <SEP> hyalines <SEP> Wachs- <SEP> grüngelbe, <SEP> trockene <SEP> Kolonien,
<tb> tum <SEP> mit <SEP> weissen <SEP> Luftmycelen <SEP> gekraust
EMI0002.0001
SA-IX <SEP> SA-IX-3
<tb> Hefe-Glucose-Agar <SEP> Gelbe <SEP> Hyalnn-Kolonien, <SEP> :
grössten- <SEP> Blassgelbes <SEP> Wachstum, <SEP> trockene,
<tb> teils <SEP> mit <SEP> Luftmycelen <SEP> gedeckt <SEP> runzelige <SEP> Kolonien
<tb> Nähragar <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> blassgelbe <SEP> Blassgelbes, <SEP> hyalines <SEP> Wachstum,
<tb> Hyalin-Kolonien <SEP> gelblichbraunes <SEP> Exopigment
<tb> Blutagar <SEP> grünlichgr.aue <SEP> Hyalin-Kolonien, <SEP> bräunliche <SEP> Hyalin-Kolonien,
<tb> verdauen <SEP> kein <SEP> Blut <SEP> verdauen <SEP> kein <SEP> Blut
<tb> Loefflers <SEP> Serum <SEP> blassgelb, <SEP> feuchtes <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> gelbes, <SEP> feuchtes <SEP> Wachstum <SEP> mit
<tb> braunpigmentiertem <SEP> Hof <SEP> ausgiebiger, <SEP> brauner <SEP> Pigment erzeugung, <SEP> mässige <SEP> Verflüssigung
<tb> Stärkeagar <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> grünliche, <SEP> schwaches <SEP> Wachstum,
<SEP> blassgelbe
<tb> weisse <SEP> und <SEP> rosafarbene <SEP> Kolonien <SEP> Hyalin-Kolonien, <SEP> wenige <SEP> weisse
<tb> Sporen
<tb> Sabouraud-Agar <SEP> sehr <SEP> schönes <SEP> zitronengelbes <SEP> schönes <SEP> grüngelbes <SEP> Wachstum,
<tb> Wachstum <SEP> trockene, <SEP> runzelige <SEP> Kolonien
<tb> Calcium-Maltose-Agar <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum, <SEP> gelbliche <SEP> mittelmässiges <SEP> Wachstum,
<tb> Kolonien, <SEP> weisse, <SEP> fleckige <SEP> Sporen <SEP> grüngelbe <SEP> Kolonien
<tb> Sojamehl-Agar <SEP> schönes <SEP> Wachstum, <SEP> auf <SEP> den <SEP> Ausgiebiges <SEP> Wachstum, <SEP> grüngelbe
<tb> Rändern <SEP> grünliche, <SEP> anderswo <SEP> runzelige <SEP> Kolonien
<tb> weisse, <SEP> ,rosafarbene <SEP> Luftmycelen
<tb> Comsteep-Agar <SEP> blasses, <SEP> graugelbes, <SEP> hyalnes <SEP> blassgel.bes,
<SEP> hyaiines <SEP> Wachstum
<tb> Wachstum
<tb> Kartoffel-Agar <SEP> gelbliche <SEP> Kolonien, <SEP> in <SEP> dünner <SEP> grünliches, <SEP> hyalines <SEP> Wachstum
<tb> Schicht <SEP> mit <SEP> gräulichen
<tb> Luftmycelen <SEP> bedeckt
<tb> Maische-Agar <SEP> grünliche, <SEP> runzelige, <SEP> trockene <SEP> grünliche, <SEP> starkrunzelige,
<tb> Kolonien, <SEP> mit <SEP> fleckig <SEP> weissen <SEP> und <SEP> bröckelige <SEP> Kolonien
<tb> rosafarbenen <SEP> Luftmycelen
<tb> Bouillon <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> submerse, <SEP> dasselbe
<tb> farblose <SEP> Kolonien
<tb> Glucose-Bouillon <SEP> schwaches <SEP> Wachstum, <SEP> submerse, <SEP> dasselbe
<tb> farblose <SEP> Kolonien
<tb> Kartoffelschnitzel <SEP> gräuliches, <SEP> feuchtes, <SEP> bröckeliges <SEP> grünlichgraues, <SEP> bröckeliges,
<tb> Wachstum,
<SEP> braungerändertes <SEP> feuchtes <SEP> Wachstum,
<tb> Pigment <SEP> braungerändertes <SEP> Pigment
<tb> Gelbrübensohnitzel <SEP> keines, <SEP> oder <SEP> sehr <SEP> schwaches <SEP> schwaches, <SEP> gelbliches, <SEP> bröckeliges
<tb> Wachstum <SEP> Wachstum
<tb> Koagulierte <SEP> Eier <SEP> Verdauung <SEP> verdaut <SEP> nicht <SEP> verdaut <SEP> nicht
<tb> Milch <SEP> Koagulation <SEP> schwach, <SEP> lange <SEP> Zeitdauer <SEP> dasselbe
<tb> Lackmusmilch <SEP> wird <SEP> koaguliert, <SEP> sodann <SEP> wird <SEP> etwas <SEP> langsamer <SEP> koaguliert,
<tb> peptonisiert <SEP> sodann <SEP> peptonisiert
<tb> Gelatine-Verflüssigung <SEP> wird <SEP> verflüssigt <SEP> wird <SEP> verflüssigt
<tb> N03 <SEP> Reduktion <SEP> reduziert <SEP> nicht <SEP> reduziert <SEP> nicht
<tb> Indol-Bildung <SEP> keine <SEP> keine
<tb> Hämolyse <SEP> hämolisiert <SEP> rote <SEP> Schafsblutzellen <SEP> dasselbe
<tb> rasch
EMI0003.0001
SA-IX <SEP> SA-IX-3
<tb> H2S-Bildung <SEP> bildet <SEP> nicht <SEP> bildet <SEP> nicht
<tb> Cellulose-Verdauung <SEP> verdaut <SEP> nicht <SEP> verdaut <SEP> nicht
<tb> Tirosinase-Reaktion <SEP> negativ <SEP> negativ
<tb> Casein <SEP> Hydrolyse <SEP> stark <SEP> und <SEP> .rasch <SEP> dasselbe
<tb> Die <SEP> antibiotische <SEP> Wirkung <SEP> des <SEP> erfindungsgemäss <SEP> erhaltenen <SEP> Flavofungins <SEP> auf <SEP> verschiedene <SEP> Pilze <SEP> zeigt
<tb> die <SEP> folgende <SEP>
Tabelle:
<tb> Inhibitionskonzentration
<tb> I. <SEP> Hefen <SEP> und <SEP> hefeartige <SEP> Pilze <SEP> gamma/ml
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 5
<tb> <B>JD <SEP> 39</B> <SEP> 4
<tb> <SEP> <B><I>93</I></B> <SEP> 4
<tb> " <SEP> Krusei <SEP> 6
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 3
<tb> " <SEP> niger <SEP> 2
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 2
<tb> Rhodotorula <SEP> species <SEP> 2
<tb> Torulopsis <SEP> pulcherrima <SEP> 2
<tb> II. <SEP> Fadenpilze
<tb> Aspergillus <SEP> elavatus <SEP> 15
<tb> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 10
<tb> " <SEP> <B>31</B> <SEP> 20
<tb> Scopulariopsis <SEP> sp. <SEP> 15
<tb> Öphalosporium <SEP> sp. <SEP> 15
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP> 20
<tb> Monosporium <SEP> apiospermum <SEP> 15
<tb> Helm.inthosporium <SEP> sp.
<SEP> 10
<tb> Tricheteceum <SEP> roseum <SEP> 15
<tb> Mastigocladium <SEP> 10
<tb> Geotrichum <SEP> sp. <SEP> 20
<tb> 11I. <SEP> Pathogene <SEP> Pilze
<tb> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 20
<tb> " <SEP> tonsurans <SEP> 30
<tb> " <SEP> rubrum <SEP> (2 <SEP> Stämme) <SEP> 10
<tb> " <SEP> gypseum <SEP> (2 <SEP> Stämme) <SEP> 20
<tb> " <SEP> purp <SEP> reum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> " <SEP> cerebriphorme <SEP> unterhalb <SEP> <B>10</B>
<tb> " <SEP> sulphureum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Epidermophyton <SEP> K.-W- <SEP> (2 <SEP> Stämme) <SEP> 20
<tb> " <SEP> <B>13</B> <SEP> 15
<tb> " <SEP> inguinale <SEP> 10
<tb> Microsporum <SEP> canisunterhalb <SEP> 10
<tb> " <SEP> gypseum <SEP> (von <SEP> Menschen) <SEP> 10
<tb> <B>32</B> <SEP> (aus <SEP> Erde)
<SEP> 50
EMI0004.0001
Inhibitionskonzentration
<tb> gamma/ml
<tb> Achorion <SEP> Quinkeanum <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Keratinomyces <SEP> unterhalb <SEP> 10
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> 10
<tb> Sporotrichum <SEP> schenkii <SEP> 10
<tb> Nocardia <SEP> asteroides <SEP> 20
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> unterhalb <SEP> 10 Die Aktivität des Flavofungins wurde zusammen mit Nystatin durch die Pfizer Corporation gegen 47 verschiedene Pilze untersucht.
Aus dem Resultat ist es ersichtlich, dass das Flavofungin ein breites fungi- cides Spektrum gegen verschiedene Pilze besitzt. Die folgende Tabelle führt die fungistatische Inhibitions- konzentration an, ti5> bedeutet, dasseine teilweise Inhibitionswirkung :erzielt wurde.
Es sei bemerkt, dass, da das Nystatin 4000 Einheiten pro mg besitzt und die Mengen des Nystatins in Einheiten angeführt sind, die ;gleichen Zahlen bei Flavofungin die vier fache Menge derjenigen :der bei Nystatin angeführten bedeuten. So bedeutet z.
B. die Zahl 10 bei Flavo- fungin ein Inhibitionswirkung von 10 meg/ml, wäh rend dieselbe Zahl 10 bei Nys.tati.n eine Inhibitions- wirku:ng von 2,5 mcg/ml bedeutet.
EMI0004.0034
Pilzart <SEP> Nystatin <SEP> Flavofungin
<tb> Einheiten/ml <SEP> mcgiml
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitidis <SEP> 1000 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> sulfureum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Sporotrichum <SEP> schenkii <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Hormodendrum <SEP> compactum <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans <SEP> 10 <SEP> ti <SEP> 10
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 8 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Trichophytun <SEP> gypseum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> metagri <SEP> 1000 <SEP> 100
<tb> Pityrosporum <SEP> ovale- <SEP> Traub <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb>
Pityrosporu:m <SEP> ovale- <SEP> 12078 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Torulopsis <SEP> albida <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Botyrytis <SEP> allii <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Neocosmospora <SEP> vasinfecta <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Fusariu@m <SEP> oxysporum <SEP> 1000 <SEP> 10
<tb> Helminthosporium <SEP> victoriae <SEP> 100 <SEP> ti <SEP> 100 <SEP> ti
<tb> Pythium <SEP> debaryanum <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 10 <SEP> ti <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> steoklii.
<SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> frequentans <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> citrinum <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> finiculosum <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> nidulans <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> soppi <SEP> 100 <SEP> 10
<tb> Aspergillüs <SEP> terrous <SEP> 100 <SEP> 100
EMI0005.0001
Pilzart <SEP> Nystatin <SEP> Flavofungin
<tb> Einheiten/ml <SEP> mcg/ml
<tb> Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Paecilomyces <SEP> varioti <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Aspergillus <SEP> flavus-oryzae
<tb> Gruppe <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Hormodend:
ron <SEP> sp. <SEP> (Wehmyer) <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Mucor <SEP> Mucedo <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicilliu.m <SEP> oxalicum <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Schizosaccharomyces <SEP> octosporus <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Pullularia <SEP> pullulans <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Byssochlamys <SEP> fulva <SEP> 10 <SEP> ti <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Cladosporium <SEP> herbarum <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> ti
<tb> Cladosporium/Honmodendron/
<tb> cladosporcides <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Endomyces <SEP> fibuliger <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Margarinomyces <SEP> bubaki <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Oospora <SEP> lactis <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Penicillium <SEP> digitatum <SEP> 100 <SEP> 100 Toxizität auf Mäusen a) In subkutaner wässriger Suspension 250 mg/kg, verursacht weder akute noch nachträgliche Sym ptome.
b) Per os: in wässriger Suspension mit Magensonde eingeführt 250 mg/kg, verursacht weder akute noch nachträgliche Symptome.
c) Intraperitoneal in wässriger Suspension LD5o - 25 mg/kg.
Therapeutisches Experiment Mäuse wurden mit Candida albicans und gleich zeitig mit Oxytetracyclin gefüttert. Das Flavofungin wurde per os 100 mg/kg zweimal verabreicht. Nach dieser Behandlung wurde im Faeces :der Mäuse gar keine oder nur wenige Kolonien der Candida albicans gefunden.
Der Streptomyces-Stamm SA-IX, vorteilhaft der Stamm SA-IX-3, wird zweckmässig unter Rühren und Belüftung submers in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenhydratquelle, wie z. B. Zucker, Stärke, weiter eine organische Stickstoff quelle, ferner anorganische Salze, enthält.
Die Zubereitung des Impfstoffes und die Gärung wird vorteilhaft wie folgt ausgeführt: Der angewandte Stamm wird an einem festen Nährboden eingeimpft, z. B. an einem asparaginhalti- gen Nährboden. Die Kultur wird mehrere Tage lang bei 27 C gezüchtet und dann zum Einimpfen eines flüssigen Nährbodens, welcher ebenfalls Aspangin enthält, verwendet.
Der Nährboden besteht vorteil haft aus Hefeextrakt, welcher neben Asparagin an- organische Nitrate, Phosphate, ferner Magnesiumsul- fat und Kaliumchlo:rid enthält. Diese Kultur verwen- det man zum Impfen in Schüttelkolben, in welchen diese für 3-4 Tage bei 27 C gezüchtet wird. Das Kulturmedium hat eine lebhaft grünlichgelbe Farbe.
Der bei der Gärung verwendete Impfstoff wurde von diesem Zwischenimpfstoff in einem Nährboden gezüchtet, der als :organische Stickstoffquelle Pepton, als Köh lenhydratquelle Zucker oder Glycerin, weiter anorganische Salze enthält. Das Züchten wurde bei 27 C 36-46 Stunden lang :durchgeführt, wobei eine blassgelbe, dicke Mycedlummasse gebildet wurde.
Von diesem Impfstoff wurden 5-1001 auf den Nährboden verwendet. Die Gärung wurde bei 27 C unter Rühren und Belüftung durchgeführt. Nach 48 Stunden wurde die Gärflüssigkeit gelb, was auf die Bildung von Flävofungin zeigt. Die Gärung wurde 80-90 Stunden lang fortgesetzt.
Die Erzeugung von Flavofungin kann .biologisch durch Candida Albicans oder durch das Ultraviolett-Spektrum oder ansonst in einer indirekten präparativen Weise kontrolliert wer den.
Die oben angeführten Gärzeiten und Tempera turen bezeichnen die optimalen Bedingungen, von welchen Abweichungen vorkommen können, wie dies bei biologischen Vorgängen oft der Fall ist. Im Laufe der Gärung - falls nötig - kann ein schaum- bildungsverhinderndes Mittel, z. B. Pflanzenöl, zu gefügt werden.
Falls die Gärflüssigkeit grössere Mengen schaum- bildungsverhindernde Stoffe enthält, wird nach Be endigung der Gärung zweckmässig ein Chlorkohlen- wasserstoff, z. B. Chloroform, hinzugefügt, um den schaumhindernden Stoff zu lösen, wonach die Gär- flüssigkeit filtriert wird.
Das erzeugte Antibiotikum, zusammen mit dem Mycelium, verbleibt auf dem Filter. Falls die Gärflüssigkeit keine oder ganz ge- ringe Mengen schaumhindernder Stoffe enthält, so braucht man keine organischen Lösungsmittel hinzu zufügen, sondern es kann die Gärflüssigkeit unmittel bar filtriert werden.
Die beim Filtrieren erhaltene nasse Mycelium- masse wird zweckmässig mit einem heissen Ester, vorteilhaft mit Äthylacetat, extrahiert. Aus diesem Lösungsmittel erhält man nach Abtreiben des Lö sungsmittels das Antibiotikum als sehr reine Kri stalle.
Analyse des auf diese Weise erhaltenen kristal linen Produktes: C = 64,3 %, H = 8,4'0/0, O = 27,7 0/a als Differenz.
Wahrscheinliche empirische Formel: C30H48010. Wahrscheinliches Molekulargewicht: 568.
Der erfindungsgemäss erhaltene Stoff ist gelb, in konz. Salzsäure oder konz. Schwefelsäure gelöst, hat er eine rote Farbe, welche in das Bräunliche über geht.
Er ist gut löslich in Eisessig, Pyridin und Di- methylformamid, ziemlich gut löslich in niederen Alkoholen, in Ä.thylacetat und anderen Estern, sehr schlecht löslich in Wasser und Chloroform, praktisch unlöslich in Äthern, in Petroläther, in Schwefelkoh lenstoff, in Hexan und in Benzol.
Die ultravioletten Absorptionsmaxima in Athanollösung sind 262 und 368 mu. Plateau bei 233 ma. Das Maximum bei<I>262</I> mit ist niedrig und bei 368 m,u charakteristisch breit und hoch. Fig. 1 stellt ein Ultraviolett- und Fig. 2 ein Infrarotabsorp- tionsspektrum dar. Das Antibiotikum entfärbt die Kaliumpermanganat- und Bromlösung und kann katalytisch hydriert werden.
Bei der Hydrierung ver liert das Antibiotikum seine Farbe und seine biolo gische Aktivität. Das Antibiotikum kann acyliert und bromiert werden. Es enthält vier .oder fünf Doppel bindungen und zwei Methylgruppen, die zu Kohlen- stoffatomen gebunden sind. Das Molekulargewicht des bromierten, weissen, amorphen Derivates beträgt etwa 892.
Man erhält dieses Produkt, wenn man zu der Ätherlösung des Flavofungins unter Eiskühlung und Rühren Brom in Ätherlösung tropfenweise hin- zufügt. Aus wasserhaltigem Äthanol umgelöst, erhält man ein amorphes, weisses Produkt,
dessen optische Drehung in abs. Äthanollösung [a]D -h 4,7 ist.
Die antibiotische Aktivität des erfindungsgemäss erhaltenen kristallinen Flavofungins wird in An- wesenheit von Sauerstoff und insbesondere in An wesenheit von Sauerstoff und Feuchtigkeit allmählich vermindert. Der freien Luft ausgesetzt, verliert es binnen 2 Wochen 50,1/o seiner Aktivität.
In einer Stickstoff- oder Kohlensäureatmosphäre kann es ge lagert werden, ohne seine Aktivität einzubüssen. <I>Beispiel 1</I> a) Herstellung des preliminären Impfstoffes Zu 50 ml Hefenextrakt werden 1 .g NaN03, 0,5 g Asparagin, 2,5g Na2HP04, 0,25g KH2P04, 0,25 g KCl und 0,25g M9S04 - 7H20,
weiter 400 ml Was- ser hinzugefügt. Der pH-Wert des so erhaltenen Nährbodens wird auf 7 eingestellt. Die Lösung wird sterilisiert und von einer ebenfalls sterilisierten 40o/oigen Glukoselösung so viel hinzugefügt, bis der Glucosegehalt des Nährbodens 2 %, beträgt. Die Lösung wird sodann mit sterilem Wasser zu 500 ml aufgefüllt.
Dieser Nährboden wird mit Streptomyces Flavofun:gini n. sp. eingeimpft, welche man auf einem Schrägnährboden gezüchtet hat. Die Züchtung erfolgt dann bei 27 C während 80 Stunden in geschüttelten Kalben.
b) Herstellung des Impfstoffes Zu 4 Liter Wasser werden 40 g Pepton, 16 g Glycerin, 2 g MgS04 ' 7H20, 20g Na2HP04 und 2 g KH2P04 hinzugefügt. Man erhält ungefähr 4,5 Liter Nährflüssigkeit, deren pH auf 7,2 eingestellt wird. Dieser Nährboden wird sterilisiert und sodann mit etwa 500 ml des obenerwähnten Impfstoffes ein geimpft und bei 25 C 36 Stunden lang in geschüttel ten Kolben gezüchtet.
Nach 36 Stunden wurde die Farbe der Flüssigkeit Massgelb und enthielt eine grosse Menge Mycelien; der pH-Wert blieb unver ändert.
c) Gärung Sechs Glasfermentoren von je 12 Liter Nutz raum wurden mit einem sterilisierten, wässrigen Nährboden folgender Zusammensetzung gefüllt:
EMI0006.0135
Glucose <SEP> (l00 <SEP> %) <SEP> 2,0 <SEP> 4)/o
<tb> Pepton <SEP> <B>0,250/0</B>
<tb> MgS04 <SEP> ' <SEP> 7H20 <SEP> <B><I>0,05010</I></B>
<tb> Na2HP04 <SEP> <B><I>(),5()010</I></B>
<tb> KH2P04 <SEP> <B><I>0,05010</I></B> Nach Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 7 ein gestellt.
Der in obiger Weise hergeistellte Impfstoff wurde in sechs gleiche Teile geteilt und zu den Fer- mentoren hinzugefügt. Die Gärung wurde bei 2711C durchgeführt unter Rühren (Drehzahl 240). Die ein geführte Luft betrug auf 1 Liter Nährboden berech net 0,5 Liter pro Minute.
Um das Schäumen zu ver hindern, wurde am Anfang der Gärung je 20-20 ml Sonnenblumenöl in jeden Fermentor eingeführt und dann gegen Ende der Gärung weitere 20 ml in klei neren Portionen hinzugefügt. Schon nach 48 Stunden wurde die Farbe der Gärflüssigkeit lebhaft gelb, und ,die Flüssigkeit verdichtete sich stark.
Die in den 36, 60 und 84 Stunden entnommenen Proben zeigten 0,55 g/Liter, <B>1,25</B> g/Liter bzw. 1,55 g/Liter reinen Flavofungingehalt. Die im Laufe der Gärung alle 12 Stunden vollzogene Sterilitätsprüfung bezeugte, dass die Gärung durchgehend steril abläuft.
Der Zuk- kergehalt des Nährbodens verminderte sich in der 84. Stunde bereits auf 0,2 %i; das Fortsetzen der Gärung war danach .nicht begründet.
d) Aufarbeitung der Gärflüssigkeit 70 Liter myceliumhaltige Gärflüssigkeit wird fil triert, wobei auf dem Filter 4 kg feuchtes, grünlich gelbes, festes Material zurückbleibt. Dieses wird unter Rückfluss 1/2 Stunde lang mit 4 Liter Athylacetat ge- kocht, danach .das Äthylacetat vom Mycelium abfil- triert und das Kochen mit je 4 Liter Äthylacetat fünfmal wiederholt.
Das vereinigte Filtrat wird in Vakuum bei 40-50 C bis zur Trübung eingeengt; man erhält etwa 5 Liter konzentrierte Lösung. Auf Zimmertemperatur abgekühlt, scheidet das Flavofun- gin in kristalliner Form aus. Die Kristalle werden fil triert, mit kaltem Aceton und kaltem Äther @ge- waschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 104 g gelbes, kristallines Produkt. Nach weiterem Einengen der Mutterlauge kann noch 6 g Flavofun- gin gleicher Reinheit gewonnen werden.
<I>Beispiel 2</I> 40 Liter Gärflüssigkeit werden laut Beispiel 1 hergestellt, .mit dem Unterschied, dass als schaum- bildungshinderndes Mittel eine grössere Menge Son nenblumenöl im Laufe der Gärung hinzugefügt wird. Die Gärflüssigkeit wird filtriert. Zu dem Filtrat, das keine Mycelien, aber Sonnenblumenöl ,enthält, werden 5 Vol:0/a Chloroform hinzugefügt und gerührt. Nach Absonderung der zwei Flüssigkeitsphasen fällt das Flavofungiin am Rand der Chloroformphase aus.
Diese Chloroformphase wird abgesondert und ge schleudert. Von der so erhaltenen festen Flavofungin- masse wird das noch verbliebene Chloroform im Vakuum abgetrieben und der trockene Rückstand mit 400 ml Aceton verrieben. Das im warmen Aceton aufgelöste Flavofungin scheidet nach Abkühlen kri stallin :aus.
Es wird filtriert, mit kaltem Aceton ge waschen und aus 5 Liter wässrigem Äthylacetat um- kristallisiert. Man erhält 38 g reines, kristallines Flavofungin.
Das durch Filtrieren erfaltene Mycelium - des sen Nassgewicht ungefähr 2,5 kg beträgt - wird zehn.- mal mit je 2 Liter kaltem Methanol verrieben und jede:smal filtriert. Die vereinigten Filtrate werden zu etwa 5 Liter eingedampft, woraus das rohe Flavo- fungin kristallin ausfällt.
Aus Äthylacetat umkristal- lisiert, erhält man 16 g reines Flavofungin, Um weiteres Flavofungin zu erhalten, wird die methanolhaltige Mutterlauge auf etwa 2 Liter ein geengt, 300 ml Wasser hinzugefügt und das Ge misch auf 200 ml eingeengt.
Nach Kühlen wird die ses Konzentrat mit 1 Liter Butanol :extrahiert und der Butanolextrakt zu :einer .sirupartigen Masse konzen- triert, dessen Volumen etwa 200 ml beträgt. Nach Hinzufügen von 800 ml Äthylacetat werden die be gleitenden Verunreinigungen ausgefällt.
Der Nieder schlag wird durch Schleudern abgesondert, die Äthyl- acetatlösung zu einer sirupartigen Masse eingeengt, und es werden 600 ml Petroläther hinzugefügt.
Das ausgefällte, rohe, nichtkristalline Flavofungin wird aus Aceton und dann aus Äthylacetat umkristal lisiert, wobei man weitere 16 g reines Flavofungin erhält.
So erhält man insgesamt 70 g Flavofungin. <I>Beispiel 3</I> Man verfährt wie in Beispiel 1, mit dem Unter schied, dass zu 70 Liter myceliumhaltiger Gärflüs- sigkeit - deren pH mit Phosphorsäure auf 5-6 ein- gestellt wurde - 3,5 Liter 5 % iges Chloroform hinzu- gefügt werden.
Nach kräftigem Rühren wird das Ge misch filtriert. Das feuchte Mycelium (4 kg) wird nach Beispiel 1 bearbeitet. Ausbeute: 110 g gelbes, kristallines Produkt. Nach Konzentrieren der Mut- terIauge erhält man weitere 5 g kristallines Produkt gleicher Reinheit.