-
Herstellung eines neuen Antibiotikums Die vorliegende Erfindung betrifft
das Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, insbesondere ein neues
Antibiotikum, das AA368 bezeichnet wurde. Unter diesem Namen wird auch in der vorliegenden
Beschreibung darauf Bezug genommen. Dem erfindungsgemäß hergestellten Antibiotikum
wurde auch der Name »Venturicidin« gegeben.
-
Das neue Antibiotikum AA368 kann aus einer Anzahl von Streptomycesarten
erhalten werden, die in drei Gruppen zu fallen scheinen. Kulturen dieser Organismen
sind auf Anforderung vom Erfinder erhältlich.
-
Die vorliegende Erfindung wird unter folgenden vier hauptsächlichen
Gesichtspunkten beschrieben, nämlich (1) Die Merkmale und Eigenschaften des neuen
Antibiotikums AA368; (II) die Merkmale der AA368-produzierenden Organismen; (11I)
die Kultivierung von AA368-produzierenden Organismen zur Herstellung des Antibiotikums;
(IV) die Isolierung und Reinigung von AA368 und die Herstellung von Zusammensetzungen,
die es enthalten.
-
(I) Die Merkmale und Eigenschaften von AA368 (1) Physikalische Eigenschaften
Die folgenden physikalischen Eigenschaften wurden am reinsten bis jetzt erhaltenen
Material bestimmt. AA368 kann als kristallines Material mit einem Schmelzpunkt (unkorrigiert)
von 140 bis 142°C nach Umkristallisieren aus Äthylacetat-Petroläther (1 :3 Volumteile)
erhalten werden. Die Substanz hat eine spezifische Drehung von [a] 11
= -f-114° (c = 10/,) in Chloroform). Bei der Analyse wurde die Abwesenheit von Schwefel
und Halogenen festgestellt, die Mikroanalyse von AA368 ergab folgende angenäherte
Werte: C = 64,89 °/o, H 8,95 °/o, N = 1,75 °/o. Die Molekulargewichtsbestimmung
nach der Methode von R a s t ergab Werte von 633 und 712. Diese Analyse würde mit
der Formel C"H"O"N und einem Molekulargewicht von 793 übereinstimmen.
-
Das UV-Spektrum einer Lösung von AA368 in Methanol zeigt peaks bei
280 und 200 m#t. Die IR-Analyse zeigte die Gegenwart von zwei Carbonylgruppen im
AA368-Molekül sowie zwei Doppelbindungen, die möglicherweise aromatisch sind. Das
Infrarot-Adsorptionsspektrum einer Probe in Nujol mull von AA368 wird in der Kurve
gezeigt und enthält die folgenden hauptsächlichen Banden: 3450 (2,90 3220 (3,11
1712 (5,84 a),1624 (6,16.), 1466 (6,82 P.,), 1410 (7,09a),1384 (7,22 a),1328 (7,53a),1274
(7,85 p,), 1258 (7,95 1230 (8,13 a),1208 (8,28a),1174 (8,52 #t), 1150 (8,70
1082 (9,24 a),1046 (9,56 990 (10,10 #t), 972 (10,29 960 (10,42 #t), 920 (10,87 #L),
904 (11,06 V.), 876 (11,42 p,), 860 (11,63 #L), 828 (12,08 #t), 800(12,50 V.) und
778 cm-1(12,85 V.).
-
(2) Chemische Eigenschaften AA368 ist eine neutrale Substanz, die
in Butanol, Äthylacetat und Chloroform löslich ist. In wäßriger Suspension ist es
bei Raumtemperatur beim pH-Wert 7 stabil. Das Antibiotikum ergab eine Rotfärbung
mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin, reduzierte jedoch kein ammonialkalisches Silbernitrat
und ergab keine Färbung beim Ferrichlorid-, Dianisidin- und Anthron-Test.
-
(3) Biologische Aktivität des Antibiotikums AA368 Kristallines AA368
besitzt wertvolle antifungide Eigenschaften, wobei es ..offensichtlich eher »fungistatisch
«
als »fungizid« ist, scheint jedoch keine bedeutende antibakterielle Aktivität zu
besitzen.
-
Das mikrobiologische Spektrum von AA368 wurde mit Bezug auf die Minimumkonzentration
bestimmt, die nötig war, um lnhibierungszonen im Petrischalentest zu erzeugen. Die
Ergebnisse waren wie folgt:
| Minimale |
| Spezies inhibierende |
| Konzentration |
| in pg/ml |
| Cercospora melonis . . . . . . . . . . . . . . . . 1,25 |
| Phoma betue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 |
| Thielaviopsis basicola . . . . . . . . . . . . . . 20,0 |
| Tricothecium roseum . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 |
| Glomerella cingulata . . . . . . . . . . . . . . . 10,0 |
| Aspergillus niger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 |
| Alternaria tenuis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 |
| Didymella lycopersici . . . . . . . . . . . . . . 2,5 |
| Botrytis cinerea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 |
| Ascochyta pisi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40,0 |
| Pythium de Baryanum . . . . . . . . . . . . . . 5,0 |
| Penicillium expansum . . . . . . . . . . . . . . 10,0 |
| Ustilago maydis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0 |
| Verticillium albo-atrum . . . . . . . . . . . . . 2,5 |
| Heiminthosporium avenae . . . . . .. . . . 2,5 |
| Fusarium vinale . ............ ...... 2,5 |
| Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . |
| Sclerotinia sclerotiorum . . . . . . . . . .. . keine Zone |
| Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . bei 40 |
| Exobasidium vexans ............... |
Weiter wurden In-vitro-Versuche nach dem Verfahren der Agarschrägschnittverdünnungsprobe
durchgeführt, bei der das Antibiotikum Agar einverleibt wurde und der Testfungus
auf die schräge Oberfläche des Agar inoculiert wurde. Folgende Ergebnisse wurden
bei den angegebenen Konzentrationen des Antibiotikums erhalten: Venturia inaequalis
Totale Inhibierung bei 0,98 l.Lg/ml; fast totale Inhibierung bei 0,33 l.g/ml; teilweise
Inhibierung bis zu 0,11 #tg/ml. Phytophthora infestans Totale Inhibierung bis zu
etwa 9 l.g/ml. Betrytis cinerea und Sclerotinia fructigens Totale Inhibierung bis
herunter zu wenigstens
0,31 V,g/ml.
-
Aspergillus niger, Glomerella cingulata, Cercospora melonis und Fusarium
nivale Bemerkenswerte Inhibierung des Wachstums bis herunter zu 0,31 l.g/ml. Thielaviopsis
basicola Geringe Aktivität.
-
Aspergillus fumigatus Teilweise Inhibierung des Wachstums bei Konzentrationen
zwischen 20 und 1,25 #tg/ml. Die Wirkung von AA368 gegen einige für den Menschen
pathogene Fungi wurde ebenfalls untersucht, nämlich seine Wirkung gegen eine Anzahl
von dermatophytischen Fungi.
-
Es wurden untersucht: Blastomyces dermatitidis, der Organismus, der
die somatische (systemic) Pilzkrankheit »North American Blastomycosis« bewirkt,
und Nocardia rubra, was als Indikator für die Wirkung gegen pathogene Actinomyeeten
verwendet wurde. Alle außer dem letzten dieser Organismen wurden nach einer Modifikation
des Biotests für Griseofulvin untersucht, wie er von G r u t t e r und Mitarbeitern
in Bact. Proc., A46 (1959), »Microbiological assay of griseofulvin using Neurospora
crassa« beschrieben wurde, wobei das radiale Wachstum des Testorgani4-mus auf der
Oberfläche des Agarmediums, das periodische Verdünnungen von AA368 enthielt, gemessen
wurde. Die erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt: Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton
persicolor, Microsporum canis, Trichophyton interdigitale, Trichophyton rubrum und
Epidermophyton floccosum Geringe Inhibierung. Blastomyces dermatitidis Nicht fungizid
bei Konzentrationen bis zu 20 lg/ml. Vollständige Inhibierung des Wachstums bei
Konzentrationen bis herunter zu 1,25 #Lg/ml für 13 Tage und 69«/oige Inhibierung
des Wachstums bei 20 Tagen. Die Inhibierungswirkung wird in Gegenwart von Blut etwas
vermindert.
-
Nocardia rubra Vollständige lnhibierung des Wachstums bei 0,01 #tg/ml
nach 3 Tagen und bei 0,078 l.g/ml nach 7 Tagen unter Verwendung der herkömmlichen
Agarschrägschnittverdünnungsprüfung in flüssiger Kultur unter Verwendung von Sabourauds-
und Malzmedium.
-
Zusätzlich zu den oben angegebenen In-vitro-Tests wurde AA368 In-vivo-Treibhaustests
über den antifungiden Schutz gegen eine Anzahl von Pflanzenkrankheitserregern unterzogen.
Die Ergebnisse waren wie folgt: Apfelschorf (Venturia inaequalis) 20 #tg/ml kristallines
AA368 ergaben etwa den gleichen Schutz wie 200 #tg/nd captanaktive Beimischung.
-
Gerstenmehltau (Brand) (Erysiphe graminis) 20 #tg/ml kristallines
AA368 ergaben den gleichen Schutz wie 250 #tg/ml karathaneaktive Beimischung.
-
Apfelmehltau (Podosphaera leucotricha) 10 #tg/ml kristalliner Feststoff
ergab annähernd 50°/@ge Verminderung der Krankheit.
-
Botrytis cinerea an Tomaten 20 #tg/ml AA368 ergaben annähernd 50 bis
78°/o Verminderung der Krankheit.
-
Botrytis cinera an Wein 20 #tg/ml AA368 ergaben 70 bis 850/, Verminderung
der Krankheit.
-
Bei Versuchen auf kleinen Versuchsfeldern bewirkten 40 #tg/ml kristallines
AA368 annähernd 668/oige Verminderung von Apfelschorf.
-
Bei Versuchen in großem Maßstab ergaben 200 und 100 #tg/ml AA368 als
mischbare Formulierung einen kommerziell annehmbaren Schutz gegen Apfelschorf (Venturia
inaequalis) auf Cox's Orange Pippin, der vergleichbar zu dem war, wie er mit 0,1
°/o captanaktiver Beimischung (als benetzbares Pulver) erhalten wird.
-
Bei keinem der obigen Tests zeigte das Antibiotikum AA368 Phytotoxizität,
so daß geschlossen
werden kann, daß das Antibiotikum praktisch nicht
phytotoxisch ist.
-
Die Toxizität von AA368 für Säugetiere wurde an Mäusen getestet. Wäßrige
Suspensionen von AA368 wurden auf ihre akute Toxizität durch intravenöse und intraperitoneale
Anwendung auf männliche Mäuse vom G.F.F.-Stamm (Körpergewicht zwischen 16 und 22
g) untersucht. Die Mortalität wurde 4 Tage nach der intravenösen Anwendung und 7
Tage nach der intraperitonealen Anwendung aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden in
der folgenden Tabelle gezeigt:
| Ergebnisse |
| Suspensions- |
| Anwendung konzentration Dosis Anzahl an Todesfällen Faso |
| Anzahl an behandelten Mäusen |
| Gew./Vol. mg/20 g I mg/kg mg/kg |
| 0,24 12 1:5 |
| 0,3 15 0: 5 |
| Intravenös 0,1 0,36 18 3 : 5 20 |
| 0,4 20 2 : 5 |
| 0,46 23 5:5 |
| 0,05 6,25 0:1- |
| 0,1 12,5 0: 1 |
| Intraperitoneal 0,25 0,2 25 0:1 |
| 0,4 50 0-1 |
| 400 |
| 0,8 100 0.1 |
| 0,9 112 0 : 1 |
| 1,0 0,4 200 0:1 |
| 0,8 400 0 : 1 |
Es ist daraus zu ersehen, daß AA368 bei Mäusen eine LDso (intravenös) von 20 mg/kg
aufweist und daß AA368 keine Todesfälle bei der maximalen Dosis, die 400 mg AA368
pro Kilogramm (intraperitoneal) entspricht, ergab.
-
(1I) Die Merkmale der AA368 produzierenden Organismen Es wurde festgestellt,
daß eine Anzahl von Streptomycesstämmen das neue Antibiotikum AA368 produzieren.
Sie wurden aus Bodenproben isoliert und scheinen wie folgt in drei Spezies zu fallen,
die eine allgemeine Ähnlichkeit mit S. griseolus, S. xanthopaeus oder S. halsteddi
besitzen, jedoch von S. halsteddi dadurch unterschieden werden können, daß sie bei
37°C nicht wachsen.
-
Spezies A Diese enthält einen Stamm von Streptomyces, der im allgemeinen
durch die folgenden morphologischen Züge gekennzeichnet wird: Kichererbsen-Agar
Vegetatives Mycel weiß getöntes Grau. Luftmycel milchweiß. Unterseite des vegetativen
Mycels grauschwarz. Produziert kein lösliches Pigment. Kolonie zottig. Geruch erdig.
Kartoffeldextrose-Agar Vegetatives Mycel senfgelb. Luftmycel grauweiß. Unterseite
des vegetativen Mycels senfgelb. Produziert gelbbraunes lösliches Pigment. Kolonie
zottig, Geruch muffig.
-
Calcium-gluconat-Agar Vegetatives Mycel weißgrau. Luftmycel kreideweiß.
Kolonie verfilzt. Geruch erdig. Saccharose-Agar Vegetatives Mycel weißgrau. Palmöl-Agar
Vegetatives Mycel aschgrau. Kolonie verfilzt. Geruch erdig. Glucose-Agar Vegetatives
Mycel weißgrau Luftmycel grauweiß. Raffinose-Agar Kein Wachstum. Cellulose-Agar
Kein Wachstum.
-
Stärkehydrolyse-Test ergab Hydrolyse. Peptierungs-Test Peptonisiwcf
Busmilch.
-
Ein Stamm dieser Spezies wut* i r »National Collection of Industrial
Bacteriae in Abe niert und N.C.I.B. 9199 bezeichnet. Diese Spezies wird Streptomyces
N.C.I.B. 9199 bezeichnet werden. Spezies B Diese Spezies ist charakterisiert durch
die folgenden morphologischen Merkmale: Kartoffel-Dextrose-Agar Vegetatives Mycel
grüngrau. Luftmycel grüngrau. Art der Kolonie glatt. Geruch erdig und süß. Produziert
kein lösliches Pigment.
-
Kichererbsen-Agar Vegetatives Mycel holzkohlengrau. Luftmycel aschgrau.
Unterseite des vegetativen Mycels holzkohlengrau. Produziert ein grauschwarzes lösliches
Pigment. Kolonie zottig oder raub. Geruch muffig. Hafermehl-Agar Vegetatives Mycel
aschgrau. Luftmycel grauweiß. Unterseite des vegetativen Mycels grüngrau. Kolonie
glatt oder struppig. Geruch muffig oder fruchtartig.
-
Ein Stamm dieser Spezies wurde bei der »National Collection of Industrial
Bacteriaa deponiert und N.C.I.B. 9200 bezeichnet. Diese Spezies wird Streptomyces
N.C.I.B. 9200 bezeichnet werden.
Spezies C Fünf Stämme wurden in
dieser Spezies identifiziert. Ein solcher Stamm wurde durch das »Centraalbureau
voor Schimmel Cultures« in Baarn/Holland folgendermaßen charakterisiert: Morphologie
(auf Stärke-Agar nach 10 Tagen) spurenbildende Fäden sympodisch (sympodially) verzweigt,
unregelmäßig gewellt mit einer Neigung, kurze Spiralen zti erzeugen (auf Hafermehl-Agar
wurden einige kurze Spiralen beobachtet). Sporen kurz zylindrisch, nach der Trennung
etwas aufgerundet, 1,5 bis 2,2 - 1,0 bis 1,3 #t. Vegetative Hyphen 0,3 bis 0,7 #t
dick, stark verzweigt. Kultur-Merkmale Glucose-nitrat-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich.
Kolonie ausbreitend, schwach erhöht, uneben, am Boden des Rohres gesprungen, gelblichgrau.
Unterseite bräunlichgelb, nach 15 Tagen blaßbraun. Luftmycel ziemlich reichlich,
weiß, samtig und blaßgrau pulverig-samtig. Lösliches Pigment blaßbraun.
-
Tyrosin-Agar (10 Tage) Wachstum gut. Kolonie klein, etwas erhöht,
kreisförmig, blaßgrau. Unterseite hellrötlichgrau. Luftmycel nach 15 Tagen kärglich,
sehr dünn, weiß, samtig. Lösliches Pigment hellrötlichgrau. Glucose-Separagin-Agar
(10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie ausbreitend, etwas uneben an einigen Stellen,
gräulichgelb. Unterseite gräulichstrohgelb mit dunklen, grauen, kreisförmigen Flecken.
Luftmycel reichlich, weiß bis blaßgrau, pulverig. Lösliches Pigment blaßgräulichbraun.
-
Glycerin-Glycokoll-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie. erhöht,
uneben, gräulichgelb. Unterseite gelblichgrau und dunkelbraun. Nach 15 Tagen gräulichlachsfarben
mit bräunlichen schwarzen Flecken und Ringen. Luftmycel ziemlich reichlich, dünn,
gräulich, pulverig-samtig mit weißem samtigem Rand. Lösliches Pigment blaßrötlich,
graubraun.
-
Hafermehl-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich, Kolonie sich ausbreitend,
gelblichgrau. Unterseite gräulichgelb, gelblichgrau und dunkelgrau. Luftmycel sehr
reichlich, pulverig-samtig, grau mit kleinen samtigen gräulichweißen Büscheln. Lösliches
Pigment grau.
-
Czapek --f- Saccharose-Agar (10 Tage) Wachstum ziemlich reichlich.
Kolonie überwiegend im Agar, blaßgrau, nach 20 Tagen tiefdunkelgrau. Unterseite
blaßgrau, nach 20 Tagen dunkelgrau. Luftmycel reichlich, sehr dünn, pulverig, gräulichweiß.
Kein lösliches Pigment. Czapek + Glucose-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie
etwas erhöht, unregelmäßig uneben und knollig, gelblichgrau, wird an den erhöhten
Teilen gräulichgelb. Unterseite blaßrötlichgraubraun, mit schmalen tiefgräulichbraunem
Rand, nach 15 Tagen braun mit dunkelgrauem Rand. Luftmycel reichlich, samtigpulverig,
weiß mit schmalem grauem Rand, klare blasse gelblichbraune Tröpfchen absondernd,
nach 20 Tagen fast völlig graupulverig. Calcium-Malat-Agar + Glycerin (10 Tage)
Wachstum reichlich, Kolonie sich ausbreitend, etwas erhöht, etwas uneben, gräulichgelb.
Unterseite blaßzitronengelb; rmch 15 Tagen blst8-grünlichstrohgelb. Luftmycel reichlich,
samtigpulverig, weiß, blaßgrau und grau, lösliches Pigment sehr blaßzitronengelb.
-
Kartoffelpfropfen (Potato plug) (10 Tage) Wachstum reichlich, Kolonie
erhöht, uneben, knollig werdend, gelblichgrau und gräulichgelb. Unterseite nicht
sichtbar. Luftmycel reichlich, jedoch dünn, weiß, samtig. Farbe des Stopfens gräulichbraun.
-
Emerson-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie mäßig uneben und
knollig. Gräulichgelb und gelblichgrau. Unterseite olivfarbig, gelblichbraun. Nach'
20 Tagen roh-umbrafarben. Luftmycel reichlich, dünn, weiß, samtig. Lösliches Pigment
roh-umbrafarben.
-
Gehirn-Herz-Infusion-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie etwas
erhöht mit unregelmäßigen flachen Vertiefungen am Boden des Rohrs, gelblichgrau,
gräulichgelb in den erhöhten Teilen. Unterseite ockergelb. Luftmycel reichlich,
sehr dünn, weiß, samtig. Lösliches Pigment sehr blaßgelblichbraun.
-
Nähragar -I- Glycerin (10 Tage) Wachstum reichlich, Kolonie unregelmäßig
vertieft und gehirnförmig, gelblichgrau und gräulichgelb. Unterseite roh-umbrafarben.
Luftmycel reichlich, dünn, weiß oder gräulichweiß, samtig, elfenbeingelbe Tröpfchen
absondernd. Lösliches, Pigment dunkel-roh-umbrabraun.
-
Nähragar ohne Glycerin (10 Tage) .
-
Wachstum reichlich, Kolonie etwas erhöht, sich ausbreitend, gehirnförmig,-
am Boden des Rohres, gelblichgrau, Unterseite olivgelb. Luftmycel reichlich, dünn,
samtig, gräulichweiß. Kein lösliches Pigment.
-
Trypton-Agar (2 bis 4 Tage) Kein Meianoidpigment. Eisen-pepton-Agar
(2 bis 4 Tage) Keine HgS-Erzeugung. Gelatine-Brühe (10 Tage) Wachstum mäßig. Kolonie
als Anzahl vors kleinen Flocken in der verflüssigten Gelatine, gelblichgrau. Unterseite
gelblichgrau. Kein Luftmycel, nach 20 Tagen spärlich, weiß, pulverigsamtig. Verflüssigung
ziemlich rasch. Kein lösliches Pigment. `-2°/oiger Agar (10 Tage) Wachstum langsam,
gehemmt. Kolonie sich ausbreitend, vor allem im Agar eingetaucht, blaßgrau. Unterseite
blaßgrau. Kein Luftmycel. Kein lösliches Pigment.
-
Lackmusmilch (10 Tage) Gräulichweißer bis gräulichgelber Ring an der
Oberfläche. Koagulierung kann vorhanden sein oder nicht. Beginnende Peptonisierung.
Kein Wechsel der Farbe der Milch. Die Peptonisierung ist nach 22 Tagen vollständig.
Peptonisierte Milch blaßkastanienbraun. Kleine Flocken der Kolonie nach 50 Tagen
am Boden des Rohres.
-
Stärke-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich, Kolonie sich ausbreitend,
etwas erhöht in der Mitte, gräulichgelb. Unterseite grau mit strohgelben Flecken
und Rand. Luftmycel reichlich, pulverig und pulverig-s=ti& .
grau
mit weißen samtigen Flecken. Diastasewirkung gut.
-
Glycerin-Asparagin-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie sich
ausbreitend, etwas in der Mitte erhöht. Gelblichgrau. Unterseite strohgelb und grau.
Luftmycel reichlich, gräulichweiß und blaßgrau, pulverig-samtig.
-
Glycerin-KN03-Agar (10 Tage) Wachstum ziemlich schnell. Kolonie sich
ausbreitend, klein, kreisförmig, etwas uneben, gräulichgelb. Unterseite strohgelb
mit gelblichbrauner Mitte. Luftmycel reichlich, pulverig, blaßgrau mit blässerem
Rand. Lösliches Pigment blaßbräunlich, rotgrau, nach 20 Tagen blaßbraungrau.
-
Natriumnitrat-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Einzelne Kolonien
in der Mitte etwas erhöht, einander berührend unter Bildung einer etwas unebenen,
Maßgrauen und gelblichgrauen Kolonie. Unterseite gelblichgrau. Luftmycel gräulichweiß
bis hellgrau, pulverigsamtig. Kein lösliches Pigment.
-
Sabourand-Glucose-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich, Kolohie etwas
erhöht, uneben, am Grunde des Rohrs knollig werdend, an den Falten aufreißend, gräulichgelb.
Unterseite blaßgelblichbraun, nach 15 Tagen orangebraun. Luftmycel reichlich, weiß,
samtig, nach 15 Tagen mit kleinen, blaßgrauen, pulverigen Flecken. Lösliches Pigment
blaßbraun.
-
Sabouraud-Maltose-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie etwas
erhöht und uneben, gelblichgrau. Unterseite blaßgelblichbraun. Luftmycel ziemlich
reichlich, weiß, samtig. Lösliches Pigment blaßbraun.
-
Kartoffel-Glucose-Agar (10 Tage) Wachstum reichlich. Kolonie sich
ausbreitend, etwas erhöht, blaßgrau. Unterseite gelblichgrau mit dunklen grauen
Flecken. Luftmycel reichlich, aschgrau mit kleinen, blaßgrauen, samtigen Büscheln.
Kein lösliches Pigment. Nach 15 Tagen eine Spur eines hellgräulichgrünen Pigments.
Glucose-Brühe (10 Tage) Wachstum mäßig. Kleine gelblichgraue Flocken in der Lösung,
einige flache Kolonien an der Oberfläche mit dünnem, weißem, samtigem Luftmycel.
Nach 20 Tagen Wachstum ziemlich gut, mit gelblichweißem Luftmycel. Kein lösliches
Pigment.
-
Eine Kultur dieser Spezies wurde bei der »National Collection of Industrial
Bacteria« deponiert und N.C.I.B. 9198 bezeichnet. Diese Spezies wird Streptomyces
N.C.I.B. 9198 bezeichnet werden. (III) Die Kultivierung von AA368 erzeugenden Organismen
AA368 wird durch aerobe Kultur der verschiedenen oben beschriebenen Streptomycesstämme
erzeugt.
-
Geeignete Kulturmedien sind die im allgemeinen für die Kultur von
Schimmelpilzen der Genus Streptomyces verwendeten. Sie sollten im allgemeinen eine
oder mehrere assimilierbare Stickstoffquellen, eine assimilierbare Kohlenstoff und
Energiequelle und Nährsalze enthalten. Die Kultur wird vorzugsweise bei aeroben
Submersbedingungen durchgeführt.
-
Die Stickstoffquelle kann anorganischen Charakters sein, liegt jedoch
vorzugsweise in der Form von komplexem organischem Material wie Hafermehl, Pepton,
Sojamehl, Maismehl, Maisquellflüssigkeit, Fleischextrakt oder einem Caseinauszug
vor. Das Medium. enthält vorzugsweise 0,025 bis 0,3 °/o assimilierbaren 'Stickstoff.
Die Kohlenstoff und Energiequelle kann beispielsweise ein durch den Organismus assimilierbares
Kohlehydrat sein, z. B. Glucose, Dextrose, Lactose oder Stärke. Solche Verbindungen
können schon in der Stickstoffquelle vorliegen oder zum Kulturmedium getrennt zugefügt
werden. Eine geeignete Kohlehydratkonzentration im Medium liegt bei 0,5 bis 7,5
°/o.
-
Glyceridöle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs wie Walöl und Maisöl
haben sich ebenfalls als günstig erwiesen.
-
Das Fermentationsmedium wird vorzugsweise vor der Inoculation auf
einen pH-Wert zwischen 6 und 7,5, vorzugsweise 6,8, eingestellt, was bequem durch
die Zugabe von Kreide geschehen kann. Die Fermentation wird bequemerweise bei 25
bis 30°C, beispielsweise bei 28°C durchgeführt. Antischaummittel können, falls notwendig,
verwendet werden.
-
Es wurde festgestellt, da-ß ein Hafermehl-Fermentationsmedium, das
Dextrose oder Glucose, Kreide und Walöl oder Maisöl enthält, besonders geeignet
für die Produktion von AA368 ist. Wenn Öle verwendet werden, liegen sie vorzugsweise
in einer Menge von 0,25 bis 5 °/o vor.
-
Im allgemeinen findet die hauptsächliche Produktion des Antibiotikums
nach etwa 48 Stunden statt, und eine geeignete Ernte beträgt 96 bis 160 Stunden.
-
Es ist im allgemeinen wünschenswert, das Fermentationsmedium mit kräftig
wachsendem vegetativem Mycel zu inoculieren, das in getrennten Keim- und Entwicklungsstufen
entwickelt wurde, wobei ein geeignetes Medium für solche Stufen beispielsweise Malzextrakt,
Glucose und Pepton enthält. (IV) Die Isolierung und Reinigung von AA368 Das neue
Antibiotikum AA368 ist im Mycel in der Erntebrühe enthalten. So kann das Mycel von
der Brühe abfiltriert und das Antibiotikum mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise
Aceton, Butanol, Äthylacetat, Butylacetat oder Amylacetat extrahiert werden. Das
Lösungsmittel wird dann entfernt, beispielsweise durch Konzentrieren im Vakuum,
wobei, soweit notwendig, etwas Wasser zugefügt wird. Die wäßrige Lösung von AA368
wird dann noch einmal mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert,
z. B. mit einem Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel wie Benzin, um alle vorhandenen
Antischaumöle zu extrahieren. Manchmal (besonders, wenn ein hoher Spiegel dieser
Öle vorhanden ist) kann auch das Antibiotikum selbst in die organische Lösungsmittelschicht
extrahiert werden. Auf jeden Fall wird, um das Antibiotikum, das in diesem organischen
Lösungsmittel enthalten ist, abzutrennen, dies vorzugsweise mit einem wäßrigen organischen
Lösungsmittel für das Antibiotikum, beispielsweise mit 90°/aigem Methanol extrahiert.
Nach Entfernen dieses organischen Lösungsmittels bleibt eine wäßrige Lösung, die
einen Anteil des Antibiotikums AA368 enthält, und diese wird dann mit der wäßrigen
Lösung vereinigt, die das AA368 enthält, das nicht zusammen mit den Antischaumölen
extrahiert wurde. Die vereinigten wäßrigen Lösungen können dann noch einmal extrahiert
werden, um eine Lösung von AA368 in einem flüchtigen organischen
Lösungsmittel,
beispielsweise Äthylacetat, Butylacetat oder Amylacetat zu ergeben, und der rohe
Feststoff kann nach Entfernen des Lösungsmittels z. B. in Vakuum erhalten werden.
-
Das Antibiotikum kann, falls gewünscht, aus der ganzen Brüte ohne
Filtrieren durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel
wie Äthylacetat, Butylacetat oder Amylacetat abgetrennt werden.
-
Rohes AA368, das in Form eines öligen Feststoffes vorliegen kann,
kann durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel wie beispielsweise
Tetrachlorkohlenstoff und Methanolmischungen, Chloroform- und Hexanmischungen und
Äthylacetat- und Petroläthermischungen gereinigt werden.
-
Ein wahlweises Verfahren zum Reinigen von rohem AA368 besteht darin,
eine Lösung des Antibiotikums der Chromatographie zu unterwerfen, beispielsweise
an einer Aluminiumoxydsäule.
-
Das Antibiotikum AA368 findet besonders Anwendung in der Landwirtschaft
und Gärtnerei zur Kontrolle von pflanzlichen Pilzkrankheiten, wofür es in verschiedene
Arten von Zusammensetzungen mit Hilfe von geeigneten Trägern oder Verdünnern gebracht
werden kann. Zu solchen Zusammensetzungen gehören besonders Lösungen, Dispersionen,
mit Wasser mischbare Flüssigkeiten, benetzbare Pulver und Stäube. Das Antibiotikum
wird auch bei Früchten angewandt, um Pilzinfektionen zu verhindern, die sich während
der Lagerung entwickeln.
-
Die folgenden Beispiele der Herstellung und Reinigung von AA368 dienen
zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken. Beispiel l Fermentation
zur Herstellung von AA368 Vier Schüttelkolben (250 ml), jeder 60 ml Sabouraud-Malzmedizin
(2,08 °/o Oxoidmalzextrakt, 4,0 °/o Glucose, 1,0°/a Oxoidpepton) enthaltend, wurden
aus einem Schrägagar inoculiert und bei 28'C incubiert, um gutes Wachstum zu ergeben
(2 bis 3 Tage). Je 50 bis 60 ml des gut gewachsenen vegetativen lnoculums wurden
dann in zwei kleine Aspiratoren übergeführt. Der Inhalt der Aspiratoren wurde dann
zum Inoculieren von zwei 5-1-Fermentatoren benutzt, wobei der Inhalt eines Aspirators
für jeden 5-1-Fermentator verwendet wurde. Die Brühe von einem 5-1-Fermentator wurde
nach 28 laufenden Stunden zur Inoculierung des Fermentationsmediums ausgewählt.
-
Die Fermentation wurde in einem Fermentationsgefäß von 22,71 Inhalt
durchgeführt unter Verwendung von 3 % Hafermehl, 10/, leichter gefällter
Kreide und 0,75 °/o Glucose als Fermentationsmedium. Während der Fermentation wurde
das Medium auf 28'C gehalten, und es wurde nach 72 Stunden geerntet. Die Fermentationsbrühe
und die Extraktionsfraktion wurden mittel der Cup-plate-Prüfung (Petrischalentest)
gegen Cercospora melonis geprüft.
-
Extraktion Die Erntebrühe wurde beim pH-Wert 6 filtriert und das Filtrat
verworfen. Das Mycel wurde bei Raumtemperatur mit Aceton extrahiert und der Acetonextrakt
durch Konzentrieren in Vakuum vom Aceton befreit, wobei, soweit notwendig, etwas
Wasser zugesetzt wurde. Die wäßrige Lösung wurde in neutralem Zustand mit Benzin
extrahiert. Die Benzinschicht wurde dann mit 90°/oigem Methanol extrahiert und die
wäßrige Methanollösung im Vakuum von Methanol befreit, der wäßrige Rückstand mit
dem Hauptanteil der wäßrigen Lösung vereinigt und dann mit Äthylacetat extrahiert.
Die Äthylacetatextrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und in Vakuum zur Trockne
gebracht, was einen öligen festen Stoff ergab. Beispiel 2 (a) Reinigung durch Kristallisieren
25 ml Tetrachlorkohlenstoff wurden zu 2,48 g des rohen öligen Feststoffes zugesetzt.
Das Öl löste sich, es trat jedoch sofortige Ausfällung von halbkristallinem Material
auf. Dieses Material wurde abfiltriert und mit Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und
ergab 610 mg fast farblosen Materials. Dieser feste Stoff wurde dann in 7 ml heißem
Methanol aufgelöst und 2 ml Wasser zugefügt. Beim Abkühlen fielen 590 mg nadelförmiger
Kristalle (F. = 128 bis 132°C).
-
Umkristallisieren aus Methanol-Wasser allein schien nicht auszureichen,
um reines Material zu erhalten. Endlich wurde abwechselndes Umkristallisieren aus
Methanol-Wasser undÄthylacetyl-Petroläther angewandt, um reines kristallines, festes
Material mit einem F. = 140 bis 142°C (unkorrigiert) zu ergeben. (b) Reinigung durch
Chromatographie Eine Säule mit 15 g neutralem Aluminiumoxyd Grad 1 in Chloroform
wurde hergestellt. 57 mg von rohem, kristallinem Material wurden in 5 ml Ohiorclform
zugefügt. Die Ergebnisse aus der Kolonne waren wie folgt:
| Frön- Lösungsmittel |
| Volumen |
| Gewicht |
| 1 Chloroform 50 - t45 |
| 2 Chloroform 25 4 |
| 3 Chloroform/Äthylacetat (1 : 1) 25 0 |
| 4 Äthylacetat 25 0 |
| 5 Äthylacetat + 5 °/o Methanol 25 3 |
| 6 Äthylacetat + 51)/,Methanol 25 95 |
| 7 Äthylacetat + 501, Methanol 25 24 |
| 8 Methanol 25 26 |
| 29'i' |
Fraktion 6 ergab nach zweimaligem Umkristalllsieren aus Methanol-Wasser einen Schmelzpunkt
der festen Substanz von 135,5 bis 137,5°C. Beispiel 3 Ein Schüttelkolben, der 50
ml Sabouraudnaedium (s. Beispiel 1) enthielt, wurde vom Schrägagarinoculieri und
3 Tage lang bei 28°C incubiert. Diese Kultur wurde verwendet, um 3 1 desselben Mediums
- zu inoculieren, das unter sterilen Bedingungen bei 28°C incubiert wurde, wobei
mit einer Geschwindigkeit von 750 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit steriler
Luft bei einer Geschwindigkeit von, 61 pro Minute 44 Stunden lang belüftet wurde.
Diese Kultur wurde verwendet, um ein Fermentationsgefäß ,aqs
rostfreiem
Stahl zu inoculieren, das 1501 des folgenden Mediums enthielt:
| 0 |
| Calciumcarbonat (gefällt). . . . . . . . . . . . . . . 10/0 |
| Glucose ............................. 1,5% |
| Maisöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 0,10/0 |
Die Glucose wurde getrennt sterilisiert. Der anfängliche pH-Wert (nach dem Sterilisieren)
betrug 7,2. Die Fermentation wurde 116 Stunden lang bei 28°C unter Rühren mit 350
Umdrehungen pro Minute und einem Luftstrom von 2831 (10 cubik feet) pro Minute aufrechterhalten,
bis ein Titer von 400 #tg/ml gegen C. melonis erreicht war. In Zwischenräumen von
jeweils 1 Stunde wurden jeweils 0,25 0/0 Glucose (als 50%ige sterile Lösung) nach
24stündiger Fermentation zugesetzt, was die gesamte Zuckerzugabe auf 3 % brachte.
-
Die Erntebrühe wurde filtriert und das Filtrat verworfen. Das Mycel
wurde dreimal mit Aceton extrahiert, zuerst mit 301, das zweite und dritte Mal mit
251 700/0igemAceton. Die vereinigten Extrakte wurden im Vakuum verdampft, bis alles
Aceton entfernt war, was eine wäßrige Suspension von halbkristallinem rohem Antibiotikum
hinterließ. Das rohe Material wurde durch Filtrieren getrennt, mit Benzin (Kp. 60
bis 80°C) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Gewicht: 29 g.
-
Das rohe feste Material wurde in 65 ml heißem Äthylacetat gelöst und
filtriert, was eine klare Lösung ergab. 1,5 g aktivierter Holzkohle wurden zugesetzt,
die Lösung erhitzt und filtriert. Während die klare Lösung unter Rückfluß gekocht
wurde, wurden 300 ml Benzin (Kp. 100 bis 120°C) langsam zugesetzt, was eine schwach
trübe Lösung ergab. Beim Stehen über Nacht bei Raumtemperatur trennte sich das Produkt
in farblosen Nadeln ab, die abfiltriert und im Vakuum getrocknet wurden, um 20,2
g des gereinigten Antibiotikums zu ergeben.
-
Beispiel 4 2001 der Erntebrühe, hergestellt nach Beispie13, wurden
ohne Filtrieren durch Rühren mit 501 Butylacetat extrahiert. Die zwei Phasen wurden
durch Zentrifugieren getrennt und die Butylacetatschicht unter Vakuum konzentriert.
2,3 g des Antibiotikums trennten sich ab, die sich bei der Prüfung als 84%ig rein
erwiesen. Die Mutterlauge ergab beim Eingießen in 4 Volumen Benzin weitere 40 g,
die 430/0ig rein waren. Diese zweite Ausbeute wurde in 175 ml 900/0igem Methanol
gelöst und die Lösung dreimal mit 50 ml Benzin (Kp. 100 bis 120°C) extrahiert. Die
methanolische Lösung wurde auf 130 ml eingeengt und in der Hitze 70 ml Wasser zugefügt.
Beim Abkühlen trennten sich 23 g 910/0iges Material als farblose Nadeln ab.
-
Beispiel s Herstellung einer echten Lösung von 200 #tg/ml AA368 als
Pflanzenschutz-Zusammensetzung (a) 400 mg AA368 werden in 5 ml Äthylenglycolmonoäthyläther
(Äthylcellosolve) gelöst, was eine 80/0ige Lösung ergibt. Die Lösung erfolgt rasch
bei Raumtemperatur.
-
(b) 0,8 ml Texofor F 15 (Glovers Chemicals, Wortley Low Mills, Leeds
12), ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel mit Octylphenol als hydrophobe
Gruppe in Kombination mit einer Polyoxyäthylenkette werden zugesetzt. (Allgemeine
Formel: R0 - CH, - CH, - (OC,H4)n - OH wobei R = Octylphenol bedeutet.)
Das Texofor F 15 wird zuerst durch Erwärmen auf 47°C verflüssigt und ist dann in
der 80/0igen Lösung von AA368 in Äthylcellosolve vollständig löslich.
-
(c) Die nach (a) und (b) hergestellte mischbare Zusammensetzung wird
dann im Verhältnis 1 Teil mischbare Zusammensetzung zu 345 Teilen Wasser (das zusätzlich
0,040/0 Texofor F 15 enthält) verdünnt. Beispiel 6 100/0ige mit Wasser mischbare
Zusammensetzung von AA368, geeignet zur Verwendung gegen Apfelschorf (Venturia inaequalis).
-
Die Zusammensetzung enthält:
| AA368 .............................. 10 g |
| Texofor F15 ......................... 27,6 g |
| Äthylcellosolve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 68 ml |
Die Zusammensetzung kann auf ähnliche Weise wie die im Beispiel 5 beschriebene hergestellt
werden.