DE1090379B - Herstellung und Gewinnung von Flavofungin - Google Patents

Description

• Herstellung und Gewinnung von Flavofungin Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung eines neuen fungicid und antibiotisch wirkenden Stoffes.
• Es wurde gefunden, daß eine aus Wüstensand isolierte Streptomyces Species, welche in dem pharmazeutischen Institut der Medizinischen Fakultät der Universität in Debrecen unter der Bezeichnung »Streptomyces SA-IX-3« hinterlegt wurde, ein fungicid wirkendes Antibiotikum erzeugt. Diese Species hat den Namen Streptomyces Flavofungini n. sp. erhalten.
• Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Züchtung des Streptomyces-Flavofungini-Stammes oder seiner Mutanten oder Varianten in wäßrigem Nährmedium sowie die Gewinnung des Antibiotikums aus der Fermentationsbrühe. Das erhaltene Antibiotikum ist ein gelbes kristallines Produkt und wurde mit dem Namen Flavofungin bezeichnet. Das Flavofungin besitzt bei verhältnismäßig niedrigen Konzentrationen eine wachstumhindernde Wirkung auf pathogene und nichtpathogene Hefen und hefeartige Pilze, Dermatophytes und Fadenpilze. Die charakteristischen, morphologischen und biochemischen Eigenschaften des Streptomyces Flavofungini (n. sp.) sind aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich:

  Streptomyces Flavofungini n. sp.

  Luftmycel grün, keine Sporen

  Pigmenthildung dunkelgrün

  Geruch erdartig, muffig

  Czapek-Dox gutes Wachstum, gelbgrüne,

  Glucose-Agar runzlige hyaline Kolonien,

  keine Sporen

  Czapek-Dox-Agar mit grüngelbe Kolonien mit

  Saccharose fleckigen iycißen Luft-

  mycelen

  Czapek-Dox-Agar, lebhaft grüne runzlige

  glyzerinhaltig hyaline Kolonien,

  keine Sporen

  Asparagin-Glucose- grüngelbe, trockene Kolo-

  Agar nien, gekraust

  Hefe-Glucose-Agar blaßgelbes Wachstum,

  trockene runzlige

  Kolonien

  Näh_ ragar blaßgelbes hyalines Wachs-

  tum, gelblichbraunes

  Exopigment

  Blutagar grünlich hyaline Kolonien,

  verdauen kein Blut

  Streptomyces Flavofungini n. sp.

  Loefflers Serum gelbes, feuchtes Wachstum

  mit ausgiebiger brauner

  Pigmenterzeugung,

  mäßige Verflüssigung

  Stärkeagar schwaches Wachstum, blaß-

  gelbe hyaline Kolonien,

  wenige weiße Sporen

  Sabouraudagar schönes grüngelbes Wachs-

  tum, trockene runzlige

  Kolonien

  Calcium-Maltose-Agar mittelmäßiges Wachstum,

  grüngelbe Kolonien

  Sojamehlagar ausgiebiges Wachstum,

  grüngelbe, runzlige

  Kolonien

  Cornsteepagar blaßgelbes hyalines Wachs-

  tum

  Kartoffelagar grünliches hyalines Wachs-

  tum

  Maischeagar grünliche, stark runzlige,

  bröcklige Kolonien

  Bouillon schwaches Wachstum,

  submerse farblose

  Kolonien

  Streptomyces Flavofungini n. sp.

  Glucosebouillon schwaches Wachstum,

  . submerse farblose

  Kolonien

  Kartoffelschnitzel grünlichgraues, bröckeliges,

  feuchtes Wachstum,

  braungerändertes Pigment

  Gelberübenschnitzel schwaches, gelbliches,

  bröckeliges Wachstum

  Koagulierte Eier,

  Verdauung keine

  Milchkoagulation schwach, lange Zeitdauer

  Lakmusmilch wird etwas langsamer

  koaguliert, sodann

  peptonisiert

  Gelatineverflüssigung wird verflüssigt

  N 03 Reduktion keine

  Indolbildung keine

  Haemolyse haemolysiert rote Schafs-

  blutzellen rasch

  H2 S-Bildung keine

  Celluloseverdauung keine

  Tyrosinasereaktion negativ

  Casein-Hydrolyse stark und rasch

  Die folgende Tabelle zeigt die antibiotische Wirkung des Flavofungins auf verschiedene Pilze:

  Pilze

  Flavofungin

  Mcg/ccm

  Histoplasma capsulatum ............. 10

  Biastomyces brasiliensis ........... 10

  Blastomyces dermaticidie ............ 10

  Trichophyton sulfureum ............. 10

  Trichophyton violaceum ............. 10

  Sporotrichum schonkii ............... 10

  Hormodendrum compactum .......... 10

  Cryptococcus neoformans ............ 10

  Phialphora verrucosa ................ 10

  Candida albicans 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

  Trichophyton rubrum ................ 10

  Trichophyton gypseum .............. 10

  Trichophyton metagri . . . . . . . . . . . . . . . . 100

  Alternaria solani .................... 10

  Botyrytis allii ....................... 10

  Neocosmospora vasinfecta . . . . . . . . . . . . 10

  Fusarium oxysporum ................ 10

  Pythium debarynum ................. 10

  Rhizopus nigricans .................. 100

  Penicillium steoklii .................. 100

  Aspergillus niger .................... 100

  Penicillium frequentans ............. 100

  Penicillium citrinum ... .... . . . . .. .... 100

  Penicillium finiculosum .............. 100

  Aspergillus nidulans ................. 100

  Penicillium soppi ... .. .. .. . . .. . . .. .. . 10

  Aspergillus terrous .................. 100

  Aspergillus fumigatus ..... ......... 100

  Paecilomyces varioti . . ... . .. . . . . .. 100

  Aspergillus-flavus-oryzae-Gruppe ..... 100

  Hormodendron sp. (Wehmayer) ...... 100

  Pilze Flavofungin

  Mcg/ccm

  Mucor Mucedo ...................... 100

  Penicillium oxalicum ................ 100

  Saccharimyces cerevisiae ............. 100

  Schisosaccharomyces octosporus ...... 100

  Pullularia pollulans . . . .. . . . . . . . . . . . . . 100

  Cladosporium (Hormodendron)

  cladosporoides .................... 100

  Endomyces fibuliger ................. 100

  Margarinomyces bubaki .............. 100

  Oospora lactis ....................... 100

  Penicillium digitatum ... ......... . .. . 100

  Toxizität bei Mäusen: a) In subkutaner wäßriger Suspension: 250 mg/kg, verursachte weder akute noch nachträgliche Symptome.
• b) per os: in wäßriger Suspension mit Magensonde eingeführt: 250 mg/kg, verursachte weder akute noch nachträgliche Symptome.
• c) Intraperitoneal in wäßriger Suspension LD5o 25 mg/kg.
• Therapeutisches Experiment: Mäuse wurden mit Candida albicans und gleichzeitig mit Terramycin gefüttert. Das Flavofungin wurde per os 100 mg/kg zweimal verabreicht. Nach dieser Behandlung wurden im Faeces der Mäuse gar keine oder nur wenige Kolonien der Candida albicans gefunden.
• Klinisch-therapeutische Untersuchungen ergaben, daß die oberflächlichen Kolonien der Candida albicans, die oberflächlichen thrychophytischen Hautveränderungen, wie auch die epidermophytischen Hautveränderungen, die Erythrasmen, die Tinea versicolor, ferner die Candidiasen des Mundes und der Scheide unter der Einwirkung des Flavofungins in kürzester Zeit geheilt werden.
• Chemische Eigenschaften des Flavofungins: Analyse des kristallinen Produktes: C = 64,907o, H=8,4%, 0=26,7% als Differenz.
• Empirische Formel nach den jetzigen Untersuchungen: C30 H49 09' Wahrscheinliches-Molekulargewicht: 553,4.
• Die optische@Drehung des Flavofungins beträgt in Pyridinlösurig (c=4) : [a] 'D' = -93 bis 94o.
• Der erhaltene Stoff ist gelb und weist, in konz. Salzsäure oder konz. Schwefelsäure gelöst, eine rote Farbe auf. Er ist gut löslich in Eisessig, 'Pyridin und Dimethylformamid, ziemlich gut löslich in niederen Alkoholen, in Äthylacetat und anderen Estern, sehr schlecht löslich in Wasser und Chloroform, praktisch unlöslich in Äther, in Petroläther, in Schwefelkohlenstoff, in Hexan und in Benzol. Die ultravioletten Absorbtionsmaxima in Äthanollösung liegen bei 262 und 368 m[. (Fig. 1). Das Maximum bei 262 m[. ist niedrig und das bei 368 m[, charakteristisch breit und hoch. Das Infrarotspektrum ist in Fig. 2 dargestellt. Das Flavofungin stellt wahrscheinlich eine mehrere Doppelbindungen enthaltende Verbindung vom Pentaentyp dar, ferner enthält sie zwei Methylgruppen, die an Kohlenstoffatome gebunden sind. Das Flavofungin entfärbt Kaliumpermanganat- und Bromlösung und kann katalytisch hydriert werden. Bei der Hydrierung verliert das Antibiotikum seine Farbe und seine biologische Aktivität. Das Antibiotikum kann acyliert und bromiert werden. Die so erhaltenen Produkte sind biologisch inaktiv.
• Die antibiotische Aktivität des kristallinen Flavofungins nimmt in Anwesenheit von Sauerstoff und insbesondere in Anwesenheit von Sauerstoff und Feuchtigkeit allmählich ab. An der Luft verliert es binnen einiger Wochen 50% seiner Aktivität. In einer Stickstoff- oder Kohlensäureatrriosphäre kann es gelagert werden, ohne seine Aktivität einzubüßen.
• Zur Herstellung des Flavofungins wird der Stamm Streptomyces Flavofungini auf einem organischen Nährboden gezüchtet, der eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und zur Entwicklung des Mikroorganismus notwendige Mineralsalze enthält. Der Stamm Streptomyces Flavofungini wird auf einen festen Nährboden geimpft, sodann damit eine asparaginhaltige Nährflüssigkeit. Diese besteht vorteilhaft aus Hefeextrakt, welcher neben Asparagin auch Nitrate, Phosphate,. ferner Magnesiumsulfat und Kaliumchlorid enthält. Die Züchtung erfolgt in Schüttelkolben während 3 bis 4 Tagen bei 27° C. Die Farbe des Wachstums nimmt eine lebhaft grünlichgelbe Farbe an. Der auf diese Weise unter Schütteln vermehrte Mikroorganismus wird in einem flüssigen Nährboden weitergezüchtet, der als organische Stickstoffquelle z. B. Pepton, als Kohlenhydratquelle Zucker oder einen Zuckeralkohol, z. B. Glycerin, und anorganische Salze enthält. Die Züchtung wurde bei 27° C 36 bis 48 Stunden unter Belüftung und Rühren durchgeführt, wobei eine blaßgelbe, dicke Mycelmasse entsteht.
• Von diesem Impfstoff wurde zumindest 10% auf den Nährboden berechnet verwendet. Die Gärung wurde zweckmäßig bei 27° C unter Belüftung und Rühren durchgeführt. Nach etwa 48 Stunden zeigte die gelbe Farbe der Gärflüssigkeit den Beginn der Flavofunginbildung an. Die Gärung wird im allgemeinen 80 bis 100 Stunden fortgesetzt. Die Flavofunginbildung kann biologisch durch Candida Albicans oder durch das ultraviolette Spektrum oder auf einem präparativen Wege kontrolliert werden. Falls während der Gärung eine bedeutende Schaumbildung zu beobachten ist, kann ein Antischaummittel, z. B. ein Pflanzenöl, zugefügt werden.
• Nach Beendigung der Gärung wird die mycelhaltige Fermentationsflüssigkeit mit einem Lösungsmittel, z. B. Chloroform, gut vermischt, um das Antischaummittel zu lösen und danach die Gärflüssigkeit filtriert. Das Antibiotikum wird zusammen mit dem Mycel abgetrennt. Enthält die Gärflüssigkeit kein Pflanzenöl, braucht man lein organisches Lösungsmittel hinzuzufügen und kann die Gärflüssigkeit unmittelbar filtrieren.
• Die beim Filtrieren erhaltene nasse Mycelmasse wird dann mit einem heißen Ester, vorteilhaft mit Äthylacetat, mehrmals extrahiert. Das Flavofungin wird gelöst und fällt beim Eindampfen der esterhaltigen Lösung in kristalliner Form aus. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt kann durch Umkristallisation aus wasserhaltigen Estern oder niedrigeren Alkoholen gereinigt werden.
• Nachstehend sind einige Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens angeführt.
• Beispiel 1 a) Herstellung des Impfstoffes als Ausgangs$tqff-Zu 50 ccm Hefeextrakt werden 1 g Na N 03, 0,5 g Asparagin, 2,5 g Nag H P 043 0,25 g K H2 P 041 0,25 g K Cl und 0,25 g Mg S 04 - 7 H2 0 sowie 400 ccm Wasser hinzugefügt. Der pH-Wert des so erhaltenen Nährbodens wird auf 7 eingestellt. Die Lösung wird sterilisiert und von einer ebenfalls sterilisierten 40%igen Glucoselösung so viel hinzugefügt, bis der Glucosegehalt des Nährbodens 2% beträgt. Die Lösung wird sodann mit sterilem Wasser auf 500 ccm aufgefüllt. Dieser Nährboden wird mit Streptomyces Flavofungini n. sp. beimpft, das .auf einem Schrägnährboden gezüchtet worden ist. Die Züchtung wird bei 27° C während 80 Stunden in einem Schüttelkolben durchgeführt. b) Herstellung des Impfstoffes Zu 41 Wasser werden 40 g Pepton, 16 g Glycerin, 2 g Mg S O4 * 7 H2 O, 20g Nag H P O4 und 2 g KH2 P O4 hinzugefügt. Man erhält ungefähr 4,51 Nährflüssigkeit, deren pH-Wert auf 7,2 eingestellt wird. Dieser Nährboden wird sterilisiert, dann mit etwa 500 ccin des obenerwähnten Impfstoffes beimpft und bei 25° C 36 Stunden in einem Schüttelkolben gezüchtet. Nach 36 Stunden wurde die Farbe der Flüssigkeit blaßgelb und enthielt eine große Menge l@2ycel; der p$ Wert blieb unverändert.
• c) Gärung Sechs Glasfermentationsgefäße von je 121 Fassungsvermögen wurden mit einem sterilisierten Nährboden folgender Zusammensetzung gefüllt: Glucose (100%) .................. 2,0% Pepton . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . ....... 0,250/0 Mg S 04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,050/0 Nag H P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,50% K H2 P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05% Nach dem Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 7 eingestellt. Der in obiger Weise hergestellte Impfstoff wurde in sechs gleiche Teile geteilt und in die Fermentationsgefäße gegeben. Die Gärung wurde bei 27° C unter Rühren (Drehzahl 240) durchgeführt. Die durchgeleitete Luft betrug für 1 1 Nährboden 0,5 1 pro Minute. Um das Schäumen zu verhindern, wurden zu Beginn der Gärung je 20 ccm Sonnenblumenöl in jedes Fermentationsgefäß gegeben und gegen Ende der Gärung weitere 20 ccm in kleineren Portionen zugefügt. Schon nach 48 Stunden wurde die Farbe der Gärflüssigkeit lebhaft gelb, und die Flüssigkeit trübte sich stark. Die in den 36, 60 und 84 Stunden entnommenen Proben zeigten 0,55 g/1, 1,25 g/1 bzw. 1,55 g/1 reinen Flavofungingehalt. Die im Laufe der Gärung alle 12 Stunden vollzogene Sterilitätsprüfung bezeugte, daß die Gärung durchgehend steril verläuft. Der Zuckergehalt des Nährbodens verminderte sich in der 84. Stunde bereits auf 0,2% - ein Fortsetzen der Gärung war danach nicht begründet.. d) Aufarbeitung der Gärflüssigkeit 70 1 mycelhaltige Gärflüssigkeit -werden filtriert, wobei auf dem Filter 4 kg feuchtes, grünlichgelbes, festes Material zurückbleibt.- Dieses wird am Rückfluß 1/2 Stunde lang mit 41 Äthylacetat erhitzt, danach das Äthy lacetat vom Mycel abfiltriert und das Erhitzen mit je 41 Äthylacetat fünfmal- wiederholt. Das vereinigte Filtrat wird im Vakuum bei-.40 bis 50° C bis zur Trübung eingeengt. Man erhält etwa 5 1 konzentrierte Lösung. Beim Abkühlen auf Zimmertemperatur scheidet sich das Flavofungin in kristalliner Form ab. Die Kristalle werden filtriert, mit kaltem Aceton und kaltem Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 104g gelbes, kristallines Produkt. Nach weiterem Einengen der Mutterlauge können noch 6 g Flavofungin gleicher Reinheit gewonnen werden.
• Beispiel 2 401 Gärflüssigkeit werden nach der im Beispiel l beschriebenen Weise hergestellt mit der Abweichung, daß als Antischaummittel eine größere Menge Sonnenblumenöl während der Gärung zugefügt wird. Die Gärflüssigkeit wird filtriert. Zu dem Filtrat, das kein Mycel, aber Sonnenblumenöl enthält, werden 5 Volumprozent Chloroform hinzugefügt und gerührt. Nach Absonderung der zwei Flüssigkeitsphasen fällt das Flavofungin am Rand der Chloroformphase aus. Diese Chloroformphase wird abgetrennt und zentrifugiert. Aus der so erhaltenen festen Flavofunginmasse wird das restliche Chloroform im Vakuum entfernt und der trockene Rückstand mit 400 ccm Aceton verrieben. Das in warmem Aceton gelöste Flavofungin scheidet sich nach Abkühlen kristallin ab. Es wird filtriert, mit kaltem Aceton gewaschen und aus 5 1 wäßrigem Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 38 g reines, kristallines Flavofungin.
• Das abfiltrierte Mycel - dessen Naßgewicht ungefähr 2,5 kg beträgt - wird zehnmal mit je 21 kaltem Methanol verrieben und jedesmal filtriert. Die vereinigten Filtrate werden auf etwa 51 eingeengt, wobei das rohe Flavofungin kristallin ausfällt. Bei Umkristallisation aus Äthylacetat erhält man 16 g reines Flavofungin.
• Um weiteres Flavofungin zu erhalten, wird die methanolhaltige Mutterlauge auf etwa 21 eingeengt, 300 ccm Wasser hinzugefügt und das Gemisch auf 200 ccm eingeengt. Nach Kühlen wird dieses Konzentrat mit 1 1 Butanol extrahiert und der Butanolextrakt zu einer sirupartigen Masse konzentriert, dessen Volumen etwa 200 ccm beträgt. Nach Hinzufügen von 800 ccm Äthylacetat werden die begleitenden Verunreinigungen ausgefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, die Äthylacetatlösung zu einer sirupartigen Masse eingeengt und 600 ccm Petroläther hinzugefügt.
• Das ausgefällte, rohe, nicht kristalline Flavofungin wird aus Aceton und dann aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei man weitere 16 g reines Flavofungin erhält. So gewinnt man insgesamt 70 g Flavofung in. Beispiel 3 Man verfährt analog dem Beispiel 1, mit der Abweichung, daß zu 701 mycelhaltiger Gärflüssigkeit - deren p11-Wert mit Phosphorsäure auf 5 bis 6 eingestellt wurde - 3,51 So/oiges Chloroform hinzugefügt -,verden. Nach kräftigem Rühren wird das Gemisch filtriert und das feuchte Mycel - 4 kg -,wie im Beispiel 1 beschrieben, bearbeitet. Ausbeute: 110 g gelbes, kristallines Produkt. Nach Konzentration der Mutterlauge erhält man weitere 5 g kristallines Produkt gleicher Reinheit. Beispiel 4 Katalytische Hydrierung des Flavofungins 2,5 g Palladium-Kohle-Katalysator werden in 50 ccm abs. Äthanol suspendiert und mit Wasserstoff gesättigt, 5,0 g kristallines Flavofungin werden in einem Gemisch von 315 ccm abs. Äthanol und 20 ccm Wasser gelöst. Die beiden Lösungen werden vereinigt und Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Binnen 20 Minuten werden 429 ccm Wasserstoff bei 22,1° C und 764 mm Druck verbraucht. Bei weiterem Hydrieren während 72 Minuten werden noch 54,4 ccm Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung im Vakuum bei 45° C zur Trockne eingedampft. Man erhält 5,19 g glasartigen Rückstand. Bei Umkristallisation aus einem Gemisch von 100 ccm Methanol und 150 ccm Wasser erhält man 3,95 g weiße Nadeln. lach weiterem zweimaligem Umkristallisieren erhält man ein reines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 149 bis 151° C. Bei der Hydrierung werden etwa 5 Mol Wasserstoff, berechnet auf 1 Mol Flavofungin, verbraucht. Die optische Drehung in Pyridin liegt zwischen WD - 5,6 und - 9,1.
• Analyse: C = 63,(1°/o, H =10,3 %, O = 26,7 0/0 (als Differenz).
• Wahrscheinliche empirische Formel: C3, H58 01o. Beispiel 5 0,2 Flavofungin (Schmelzpunkt 149 bis 151°C) werden in einem Gemisch von 5 ccm Essigsäureanhydrid und 5 ccm Pyridin gelöst, das Gemisch 2 bis 3 Tage lang stehengelassen und zur Trockne eingedampft. Die Lösungsmittelspuren werden durch Destillation mit viermal 5 ccm Äthanol im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird aus wäßrigem Alkohol umkristallisiert; wobei man ein grünlichblaßgelbes Produkt mit einem Schmelzpunkt von 141 bis 142° C erhält. Optisches Drehungsvermögen in Pyridin [o;] D = - 184. Acetylgruppengehalt 3512/o. Die empirische Formel ist etwa C44H82017. Diese Angaben zeigen, daß in das Flavofunginmolekül sieben Acetylgruppen eingeführt wurden. Daraus kann man schließen, daß das Flavofunginmolekül sieben alkoholische Hydroxylgruppen enthält. Das acetylierte Produkt ist gegen Sauerstoff nicht empfindlich.
• Das acetylierte Produkt kann folgenderweise desacetyliert werden: 1,5 acetyliertes Flavofungin werden in 90 ccm heißem abs. Äthanol gelöst, der abgekühlten Lösung 60 ccm 25°/o Kaliumhydroxyd zugefügt und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach wird mit 10o/oiger Salzsäure bei Eiskühlung neutralisiert. Die erhaltene Lösung wird auf zwei Drittel ihres Volumens eingeengt. Nach Kühlen scheidet sich das Flavofungin in kristalliner Form ab. Es zeigt dieselben biologischen und physikalischen Eigenschaften wie vor der Acetylierung.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verwendung von Streptomyces Flavofungini novum species sowie seiner Mutanten und Varianten zur Erzeugung des Antibiotikums Flavofungin auf biologischem Wege, unter üblichen Bedingungen, vorzugsweise im submersen Verfahren, Isolierung des Antibiotikums mittels bekannter Maßnahmen wie Extraktion oder Adsorption aus der Nährflüssigkeit und/oder aus dem Mycelium.