CH475352A

CH475352A - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Olivomyzin

Info

Publication number: CH475352A
Application number: CH830366A
Authority: CH
Inventors: Frantsevich Gauze Georgy; Sergeevna Ukholina Roza; Alexanddrovna Sveshn Margarita; Georgievna Brazhnikova Marijy; Borisovna Kruglyak Elena; Nikolaevna Kovsharova Iyda; Vasilievna Konstantino Nadezda; Vasilievna Proshlyak Valentina; Alexandrovich Shorin Vitaly; Efimovna Goldberg Liya; Sergeevna Stanislavskav Mariya; Petrovna Vertogradova Tatyana; Konstantinovna Rossolimo Olga; Konstantinovna Kovale Viktorya
Original assignee: Nii Izyskaniju Novych Antibiot
Priority date: 1966-06-09
Filing date: 1966-06-09
Publication date: 1969-07-15

Description

Verfahren zur llerstellung des Antibiotikums Olivomyzin
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Olivomyzin. Das Olivomyzin ist ein Produkt der Biosynthese des Aktinomyzets Actinomyces olivoreticuli var. olivomycini und weist eine antitumorale Wirkung auf. Das Olivomyzin ist ein neues Antibiotikum, demzufolge ein Verfahren zu dessen Herstellung bisher nicht bekannt war.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Olivomyzin besteht in der Kultivierung von Actinomyces olivoreticuli var. olivomycini auf einem Nährboden, welcher Quellen von Kohlenstoff, organischem Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, und in der Gewinnung des Olivomyzins aus der Kulturflüssigkeit.

Als Stickstoffquellen können Fisch-, Erbsenmehl oder Hefeautolysat verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle verwendet man zweckmässig Glukose.

Der bevorzugte Nährboden für die Bildung von Olivomyzin ist der Boden, welcher Sojamehl, Glukose, Natriumchlorid und Kalziumkarbonat enthält.

Das Olivomyzin kann aus- der Kulturflüssigkeit durch Extraktion oder durch Ausfällen mit neutralen Salzen gewonnen werden.

Die Extraktion der Kulturflüssigkeit erfolgt zweckmässig mit organischen Lösungsmitteln, die sich mit Wasser nicht vermischen, z. B. mit Butanol oder Essigsäureestern, wie Äthylazetat, Butylazetat oder Amylazetat. Der gewonnene Extrakt wird vorzugsweise mit wässriger Alkalilösung behandelt, angesäuert, das niedergeschlagene Olivomyzin in Form von Säure getrennt und aus wässrigen organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise aus 50 obigem Methanol, zur Kristallisation gebracht.

Das Olivomyzin kann, wie oben erwähnt, aus der Kulturflüssigkeit durch Ausfällen mit neutralen Salzen im sauren Medium ausgeschieden werden. Der entstehende Niederschlag kann getrennt und mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. mit Azeton oder Methylenchlorid oder mit deren Gemisch, behandelt werden.

Dann wird der Extrakt gewöhnlich durch Hindurchleiten durch eine Schicht von Aluminiumoxyd Al203 gereinigt. Zur Herstellung des kristallinen Präparates kann das Olivomyzin vorher in einer organischen Lösung, vorzugsweise in Äthylazetat, gelöst und mit dem Natriumhydrosulfit (Na2S204. 2H2O) behandelt und dann aus wässriger organischer Lösung, vorzugsweise aus 50 0/obigem Methanol, zur Kristallisation gebracht werden. Das Olivomyzin erhält man in Form einer Säure. Zur Herstellung des Natriumsalzes kann die Olivomyzin-Säure in einem aliphatischen Alkohol, z. B. Butylalkohol gelöst und die erhaltene Lösung mit alkoholischer Lösung von Ätznatron behandelt und das Natriumsalz mit dem Petroleumäther ausgefällt werden.

Beispielsweise wird die Herstellung von Olivomyzin wie- folgt ausgeführt. Zuerst wird das Sporenmaterial bereitet. Dazu wird die Ausgangskultur Actinomyces (Streptomyces) olivoreticuli var. olivomycini auf einem agarisierten Nährboden, welcher Stärke sowie anorganische Salze enthält, während 2-3 Wochen gezüchtet.

Dann wird ein Stückchen Agar mit der Kultur - von Actinomyces (Streptomyces) olivoreticuli var; olivomy- cini in einen Kolben mit dem Nährboden eingebracht, welcher Stärke, Glukose, Sojamehl sowie anorganische Salze enthält, und das Inoculum bei einer Temperatur von 26-28 C während 48 Stunden gezüchtet. Dabei bildet sich Myzel.

Mit dem erhaltenen Myzel wird der Nährboden besät, welcher Stärke, Glukose, Sojamehl sowie anorganische Salze enthält, und die Züchtung des Inoculumseim Inoculator während 36-48 Stunden bei vorgegebenem Regime durchgeführt. Dann wird mit dem gewonnenen Inoculum der Nährboden besät, welcher Sojamehl, Glukose, Natriumchlorid und Kalziumkarbonat enthält.

Die Fermentation dauert 120-144 Stunden. Aus der erhaltenen Kulturflüssigkeit wird das Olivomyzin, wie oben beschrieben, gewonnen.

Das Inoculum kann auf einem festen Substrat, z. B. auf Hirse, bereitet werden. Dazu wird die Hirse mit Dampf aufgeweicht, in sterile Fläschchen eingebracht und in einem Autoklaven während 30 Minuten bei einem Druck von 1-1,2 at sterilisiert. Danach wird diese mit der Myzelmasse aus den Kolben besät, geschüttelt und in einen Thermostaten bei einer Temperatur von 26-28 C eingebracht. Nach 18-25 Tagen wird die Hirse vom sporentragenden Myzel verhüllt.

Das Inoculum wird bei einem Druck von 10-12 Torr während 48 Stunden getrocknet.

Das Olivomyzin weist eine starke antitumorale Wirkung auf und stellt ein Gemisch dar, welches aus drei Komponenten mit verschiedener biologischer Wirksamkeit gegenüber der Test-Mikrobe Bac. subtilis 6633 besteht. Die erste Komponente (Olivomyzin 1) ist dreimal so wirksam wie die zweite Komponente (Oli- vomyzin II) und zehnmal so wirksam wie die dritte Komponente (Olivomyzin III) bei einem Gehalt im gesamten Präparat von 75 Gew.-%.

Das kristalline, chromatographisch reine Olivomycin I ist hellgelb, in Alkoholen, Estern, Azeton, Chloro- form, Methylenchlorid und Methyl-äthylketon gut, in Äthern und Benzol schlecht löslich, und in Wasser, ge sättigten Kohlenwasserstoffen und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich. Das Olivomycin I weist saure Eigenschaften auf, Fp. 162-165 C, [&alpha;]D27-41,7 (CH3OH). Im Ultraviolettspektralbereich Agar in CH5OH 225, 275, 318 und 408 mmk (E:m - 230, 420, 62, 95) (graphische Darstellung 1). Im Infrarotspektralbereich (in KBr) gibt es folgende Absorptionsmaxima - 3450, 2990, 2950, 1736, 1640, 1585, 1440, 1230, 1050cm-1 (graphische Darstellung 2). Das Molekulargewicht beträgt 1213.

Chemisch stellt das Olivomyzin ein Glukosid dar, welches sich aus dem Aglykon-Olivin und ungewöhnlichen 2, 6-Dideoxyzuckern: O-Isobutyrylolivomykose, Olivomose, Olivose und -Azetyloliose zusammensetzt.

Die Strukturformel hat folgende Gestalt:
EMI2.1

Das Olivomyzin ist durch folgende Kennwerte gekennzeichnet : a) die Absorption im Ultraviolett- und im sichtbaren Spektrum bei 227, 277, 315-20, 410 mmk Et ém beo trägt 160 bzw. 410, 46, 112; b) Fp. 158-165 C unter Zersetzung; c) löslich in Alkoholen, Erestern, Chloroform und Methylenchlorid.

Die antibiotischen Eigenschaften des Olivomyzins sind in der Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1
Das Spektrum der Antimikrobenwirkung des Olivomyzins in vitro Mikroorganismen minimale unterdrückende
Konzentration (in ylml) 1 2 Staphylococcus aureus LA 0,5 Staphylococcus aureus P 209 0,5 Staphylococcus aureus, mutant UV3 0,004 Bacterium coli > 100
Tabelle 1 (Fortsetzung) Mikroorganismen minimale unterdrückende
Konzentration (inrlml) 1 2 Bacterium paracoli > 100 Bacterium paracoli, mutant 52-1 0, 004 Aerobacter aerogenes > 100 Bacillus mycoides S 0,05 Bacillus subtilis 0,05 Bacillus cereus 0,2 Sarcina flava 0,

2 Candida aibicans > 100 Saccharomyces cervisiae > 100 Penicillium granulatum > 100
Für die Bestimmung der Antimikrobenwirkung des Olivomyzins wurden dessen wässrige Lösungen verschiedener Konzentration mit dem Nähragar in Petrischalen vermischt und auf die Agaroberfläche eine Suspension verschiedener Mikroorganismen aufgebracht. Die Antimikrobenwirkung des Olivomyzins ist der antitumoralen proportional.

Der LDs0-Wert des Olivomyzins bei intravenöser Injektion bei weissen Mäusen schwankt von 7 mg/kg bis 10 mg/kg. Eine kumulative Toxität weist das Olivomyzin nicht auf. Bei parenteraler und lokaler Verwendung unterdrückt das Olivomyzin die Blutbildung nicht.

Bei viermaliger intravenöser Einspritzung in maximal verträglicher Dosis hemmt das Olivomyzin die Entwicklung folgender Tumoren bei Mäusen: Sarkom 180, Harding-Passey-Melonom, Lymphosarkom (der Stamm L10-1) und die Myeloleukose (die Stämme ZOLYPK-1) zu 60-85 0/0; bei Ratten: Walker-Sarkom, Karzinom SSK, Guerin-Karzinom und Sarkom 45 zu 65-85 o/o.

In der Klinik wird für die systematische Heilbehandlung von Blastom-Erkrankungen das Natriumsalz des Olivomyzins parenteral (intravenös, durch Infusionen und Perfusionen) sowie lokal in Form von Salben oder feuchten Kühlverbänden zur Behandlung von Krebsgeschwüren verwendet.

Die intravenöse Verwendung des Olivomyzins ist bei Hodengeschwulsten (Seminome, Embryonalkarzinome, Teratome im Stadium der Generalisierung), tonsillaren Geschwulsten (Lymphoepitheliome, Retikulozytome, Krebs aus den Zellen des Übergangsepithels, Zytoblastome), Retikulosarkomen, Lymphogranulomatose, Melanomen und anderen angezeigt. Die Olivomyzindosis beträgt 10 bis 20 mg je Injektion. Die Injektionen werden alle 24 oder alle 48 Stunden wiederholt.

Für eine Kur werden 300-500 mg Olivomyzin verbraucht. In günstigen Fällen ist bei den Kranken eine teilweise oder vollständige Resorption der Geschwülste und Metastasen festzustellen. Nach klinischen Angaben werden die Kuren mit Unterbrechungen von 3 oder 4 Wochen wiederholt.

Im Hinblick darauf, dass das Antibiotikum keine unterdrückende Wirkung auf die Blutbildung ausübt, kann das Olivomyzin in Vereinigung mit anderen antitumoralen Mitteln mit den Derivaten der Chloräthylamine, der Äthylenimine, den Antimetaboliten, der Röntgen- und Strahlentherapie verwendet werden. Das Olivomyzin kann als Mittel, welches die vorhergehende Behandlung bei den Kranken mit entwickelter Leukopenie, z. B. nach der Röntgen- oder Strahlentherapie, der Anwendung alkylierender Mittel, der Antimetabolite, usw. ergänzt, sowie in den Fällen verwendet werden, in denen eine Behandlung mit anderen antitumoralen Mitteln infolge der Leukopenie oder Thrombozytopenie unmöglich ist.

Der Stamm Actinomyces (Streptomyzes) olivoreticuli var. olivomycini bildet ein weisses bis schwachrosa oder fliederfarbenes Luftmyzel oder ein farbloses bis grünlich-graues oder schmutzig-grünes Substratmyzel; Melanoidpigmente fehlen. Die Sporenträger sind gerade und die Sporen in den sekundären Quirlen glatt, oval und länglich. Näheres über die physiologischen und anderen Eigenschaften des Olivomyzin-Produzenten enthält die Tabelle 2. Der Stamm Actinomyces olivoreticuli var. olivomycini ist in aktiver Form vom öffentlichen Institut Nauchno-Issledovatelsky institut po izyskaniju novych antibiotikov in Moskau zu beziehen.

Tabelle 2
Morphologie: Sporenträger gerade, in sekundären Quirlen Sporen glatt, oval und länglich Nährboden Luftmyzel Substratmyzel Farbe des Anmerkung
Nährbodens 1 2 3 4 5 Mineralischer schwach rosa bis farblos bis keine Gause-Nährboden fliederfarben grünlich-grau mit mineralischer Stickstoffquelle Czapek-Nährboden weiss farblos keine schlechtes mit Saccharose Wachstum
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Nährboden Luftmyzel Substratmyzel Farbe des Anmerkung
Nährbodens
1 2 3 4 5 Glukose- weiss,

spärlich schwach grünlich keine
Asparogin-Nährboden
Organischer cremefarben schmutzig-grün schwach
Gause-Nährboden bis rosig oder grünlich mit organischer braun- grünlich
Stickstoffquelle Wachsman-Näurboden weisslich farblos keine schlechtes
Wachstum
Hafer-Nährboden rosa-cremefarben grünlich keine
Milch farblos keine peptonisiert manchmal unter
Koagulation
Gelatine graubraungelblich schwach braun verflüssigt
Nitrate weisslich graubräunlich graubräunlich reduziert nicht
Saccharose farblos keine invertiert nicht
Zellulose wächst nicht
Stärkeagar schwach rosig schmutzig-grünlich keine schwache
Hydrolyse Kartoffel weiss mit einem grünlich grünlich
Stich ins Grüne,

dann schwach rosig Nährboden mit weiss-fliederfarben schmutziggrün keine zitronensaurem Eisen
Verwendung von Kohlenstoffquellen
Kontrolle - kein Wachstum Rhamnose - benutzt nicht d-Fruktose-benutzt nicht d-Xylose - benutzt nicht
Raffinose - geringe Benutzung 1-Arabinose - benutzt nicht d-Mannitol-benutzt nicht
Die antibiotischen Eigenschaften der Kultur, die das Olivomyzin bildet, sind gut ausgeprägt gegenüber E. coli, St. aureus 209 und dessen Mutanten UV-3; Bac. mycoides, Candida albicans und Euglena gracilis.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden nachstehend folgende Beispiele angeführt.

Beispiel 1 a) Bereitung von Sporenmaterial. Die Ausgangskul tur des Olivomyzinproduzenten wird auf einem agari sierten Nährboden folgender Zusammensetzung (in o/o) gezüchtet:
Stärke -2
KNO3-0, 1
K2HPO4 - 0,05 MgSO4 - 0,05 NaCl - 0,1 FeSO4 - 0,001
Agar-Agar - 3 pH des Nährbodens 7,2-7,4 (nach der Sterilisation).

Die Züchtung erfolgt bei einer Temperatur von 26-280 C während 2-3 Wochen. Die Kultur behält bei der Lagerung in einem Kühlschrank (2-4 C) die Wirksamkeit während eines Jahres. b) Bereitung des Inoculums im Kolben. Ein 1-1,5 mm2 grosses Stückchen Agar mit der Kultur Actinomyces (Streptomyces) olivoreticuli var. olivomycini wird in einen 750 ml-Kolben mit 200 ml Saatnährboden folgender Zusammensetzung (in o/o) eingebracht: Stärke - 1
Glukose -1 Sojamehl - 1
Kalziumkarbonat - 1,3
Natriumchlorid - 0,5 pH-Wert - 6,9-7 (nach der des Nährbodens Sterilisation)
Das Inoculum im Kolben wird auf einer Schüttelanlage bei 180 um und einer Temperatur von 26-280 C während 48 Stunden gezüchtet.

Das gewonnene Myzel verwendet man unmittelbar zum Besäen des Nährbodens in den Inoculatoren. c) Züchtung des Inoculums im Inoculator. Zur Züchtung des Inoculums verwendet man einen Nährboden, welcher die folgende Zusammensetzung (in %) aufweist:
Stärke -1
Glukose - 1
Sojamehl - 1
Kalziumkarbonat - 0,3
Natriumchlorid - 0,5
Der Nährboden wird während 45 Minuten bei einer Temperatur von 120 C sterilisiert. Die Inoculation nimmt man mit dem in den Kolben erhaltenen Myzel vor.

Die Züchtung des Inoculums erfolgt wäh- rend 36-48 Stunden unter folgenden Bedingungen:
Temperatur 27-290 C
Druck 0,2-0,5 at zugeführte 0,5 Volumen auf ein
Luftmenge Volumen Nährboden pro Minute kontinuierlicher 360 Ulm
Betrieb des
Rührwerkes
Die Schaumlöschung erfolgt unter Zusatz von Pottwalfett. d) Biosynthese des Olivomyzins.

In einen 5001-Fermenter bringt man 3001 Nährboden folgender Zusammensetzung (in %) ein: Sojamehl - 2
Glukose -3
Natriumchlorid - 0,5
Kalziumkarbonat - 0,3
Die Inoculation nimmt man mit dem in dem Inoculator erhaltenen Inoculum vor, das 7-15 o/o vom Volumen des Fermentationsnährbodens ausmacht.

Die Fermentation erfolgt während 120-144 Stunden unter folgenden Bedingungen:
Temperatur 26-29 C
Druck 0,2-0,5 at zugeführte 1 Volumen auf ein
Luftmenge Volumen Nährboden pro Minute kontinuierlicher 360 Ulm
Betrieb des
Rührwerkes
Die Schaumlösung erfolgt unter Zusatz von Pottwalfett.

Die Wirksamkeit der Kulturflüssigkeit am Ende der Fermentation beträgt 400-600 mkg/ml.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit, gewonnen in diesem Falle in einer Menge von 170 1, wird auf einer Filterpresse unter Verwendung von festem Treibriemengewebe als Filtiermaterial filtriert. Man erhält 130 1 durchsichtiges Kulturfiltrat mit einem Olivomyzingehalt von 400 mkg/ml. Zu dieser Lösung gibt man 250 ml konzentrierte Salzsäure (pH-Wert der Lösung 2,8) und 1 Gew.-% Natriumchlorid binzu und teilt in 3 Teile zu 40, 40 und 501. Den ersten Teil der Lösung zu 401 extrahiert man mit 101 Butylazetat. Man erhält 8,5 1 Extrakt. Mit demselben Extrakt wird der zweite Teil der Lösung zu 401 extrahiert. Man erhält 7,2 1 Extrakt, mit dem das Olivomyzin aus dem dritten Teil des Kulturfiltrats (501) herausgezogen wird. Man erhält im Ergebnis 6,5 1 Extrakt.

Der letztere wird mit 0, 5 /o neutraler Aktivkohle behandelt und mit 1,3 1 5%iger Natriumbikarbonatlösung gewaschen. Dann kühlt man den Extrakt auf eine Temperatur von 3 C an und behandelt mit 340 ml 0,1 n-KOH-Lösung bis zum pH-Wert = 9,5. (Der pH-Wert des Reextraktes darf 10 nicht übersteigen. Danach wird der Reextrakt mit 0,1 n-Salzsäure unter Rühren bis zum pH-Wert = 4,0 angesäuert, auf einem Wasserbad auf eine Temperatur von 400C erwärmt und das niedergeschlagene Olive myzin getrennt und in einemVakuumexsikkator getrocknet. Man erhält 19,5 g Olivozymin, welches kristallisiert wird.

Dazu werden 6 g Präparat in 20 ml Methanol gelöst, allmählich 20ml Wasser hinzugegeben und auf einem Wasserbad auf eine Temperatur von 600 C erwärmt. Dann wird die Beheizung abgeschaltet und die Lösung während 4 Stunden stehengelassen. Danach bringt man die Lösung für einige Stunden in einen Kühlwagen ein. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und in einemVakuumexsikkator beiZimmertemperatur getrocknet. Man erhält 5 g kristallines Olivomyzin gelber Farbe, dessen E1cm1% bei 227 mmk 160, bei 277 mmk 410, bei 315-320 mmk 46 und bei 410 mmk 112 beträgt. Fp. 158-165 C (unter Zersetzung). Es ist in Alkoholen, Estern, Chloroform und Methylenchlorid löslich.

Die Angaben der Gegenstromverteilung im Kreig-Apparat auf 100 Röhren im System Athylazetat- Wasser-Athanol-Hexan (8:7,5:6:4,5) ergeben, dass das Olivomyzin ein Gmeisch von drei Komponenten - Oll- vomyzin 1, Olivomyzin II und OlivomyzinIII - mit den Verteilungskonstanten 1,7 bzw. 0,35 und 0,1 darstellt.

Dabei sind im Gemisch gegen 72 ovo Olivomyzin I, gegen 15 O/o Olivomyzin II und etwa 8 o/o Olivomyzin III enthalten.

Beispiel 2
Alle Massnahmen der Herstellung des Olivomyzins bis zu dessen Isolierung aus der Kulturflüssigkeit werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das Isolieren des Olivomyzins aus der Kulturflüssigkeit wird durch Ausfällen mit neutralen Salzen vorgenommen. Dazu werden in die abfiltrierte Kulturflüssigkeit, die in einer Menge von 2401 gewonnen wird, 36 kg festes Natriumchlorid eingeführt und nach dessen Auflösung 1,3 1 konzentrierte Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 3,0 hinzugefügt. Der entstandene Niederschlag wird auf einer Zentrifuge getrennt. Im Ergebnis erhält man 1,3 kg Niederschlag. Dieser Niederschlag wird mit dem fünffachen Volumen (6,51) des Gemisches von Azeton und Methylenchlorid (1:1) vermischt. Der Extrakt mit dem gelösten Olivomyzin wird getrennt und die nochmalige Extraktion von 2,6 1 Gemisch durchgeführt.

Die Extrakte werden vereinigt (8,6 1) und mit 25 1 destilliertem Wasser bei einem pH-Wert des Wassers von 5,0 gewaschen. Man erhält 3,5 1 gewaschenen Extrakt und leitet diesen durch eine Schicht von neutralem Aluminiumoxyd durch, welches 10 ovo Wasser enthält. Das Aluminiumoxyd wird dann mit 1 1 Methylenchlorid gewaschen, welches 5 0/o Methanol enthält. Das Filtrat (4,5 1) wird im Vakuum bis zur Trockene eingedampft. Der gewonnene Niederschlag wird in 700 ml Äthylazetat gelöst und mit t/5 Volumen 10 O/oiger wässriger Natriumhydrosulfitlösung vermischt. Die Behandlung mit frischen Portionen der Hydrosulfitlösung erfolgt, bis die Lösungsfarbe von grün zu gelb geworden ist.

Danach wird die Lösung 3 Mal je mit t/4 Volumen Wasser gewaschen, mit durchgeglühtem Natriumsulfat getrocknet, um das Zweifache eingedampft und das Olivomyzin mit dem fünffachen Volumen Petroläther ausgefällt. Man erhält 58 g Olivomyzin, welches kristallisiert wird. Dazu werden 6 g des mit einer Hydrosulfitlösung behandelten Präparates in 20 ml Methanol gelöst, 20 ml Wasser hinzugegeben und auf einem Wasserbad auf 600 C erwärmt.

Danach wird die Lösung während einiger Stunden stehen gelassen. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und in einem Vakuumexsikkator bei Zimmertemperatur getrocknet. Man erhält 5 g gelb es kristallines Olivomyzin. Das kristalline Präparat enthält nicht weniger als 850 mkglmg Olivomyzin. EliCc!mo beträgt 156, 395, 46 und 95 bei 225 bzw. 278, 315-320 und 410 mmk.

Die Angaben der Gegenstromverteilung im Kreig Apparat auf 100 Röhren in dem im Beispiel 1 angegebenen System ergeben den folgenden Gehalt an Komponenten: Olivomyzin 1 - 52 %, Olivomyzin II - 20 O/o und Olivomyzin 111-10,5 0/0.

Die Papierchromatographie (radiale Methode) des Olivomyzins, welches ein Gemisch von drei genannten Komponenten enthält, wird wie in den folgenden Systemen durchgeführt: Benzol - Essigsäure - Wasser (4:5:1), obere Phase Benzol - Butanol - Wasser (9:1:10), obere Phase
Chloroform - Tetrachlorkohlenstoff (beide mit Wasser gesättigt).

Methanol (5:4:1).

Diisoamyläther (mit Wasser gesättigt) - Butanol (2:1).

Zur Ermittlung des Olivomyzingehaltes in verschiedenen Stadien der Reinigung verwendet man die Spektralphotometriemethode bei 410 mmk.

Beispiel 3
Herstellung des Natriumsalzes des Olivomyzins.

5 g Olivomyzin, das im Beispiel 2 hergestellt wurde, werden in 20 ml Butylalkohol gelöst, auf 0 C abgekühlt, unter sorgfältigem Verrühren mit 5 ml 1 n alkoholischer Ätznatronlösung versetzt und mit 125 ml Petroleumäther behandelt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und in einem Vakuumexsil:kator getrocknet. Man erhält 4,8 g Natriumsalz des Olivomyzins. Dieses Salz ist in Wasser gut löslich.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Oli- vomyzin, dadurch gekennzeichnet, dass man Actinomyces olivoreticuli var. olivomycini auf einem Nährboden kultiviert, welcher Quellen von Kohlenstoff, organischem Stickstoff sowie anorganische Salze enthält, und das Olivomyzin aus der Kulturflüssigkeit gewinnt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass ein Nährboden verwendet wird, welcher Sojamehl, Glukose, Natriumchlorid und Kalziumkarbonat enthält.

2. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung von Olivomyzin aus der Kulturflüssigkeit durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, die sich mit Wasser nicht vermischen, und Reextraktion mit einer Alkalilösung unter anschliessendem Ansäuern vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als organische Lösungsmittel Butanol oder Essigsäureester verwendet werden.

4. Verfahren nach Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung von Olivomyzin aus der Kulturflüssigkeit durch Ausfällen mit neutralen Salzen unter Ansäuern, Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel wie Azeton und/oder Methylenchlorid, und Reinigung durch Aluminiumoxyd vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des kristallinen Präparates das Olivomyzin in einem organischen Lösungsmittel vorzugsweise in Äthylazetat, gelöst mit Natriumhydrosulfit behandelt und dann aus einem wässrigen organischen Lösungsmittel vorzugsweise aus 50 %igem Methanol, zur Kristallisation gebracht wird.

6. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass für die Herstellung des Natriumsal zes von Olivomyzin das letztere mit einem aliphatischen Alkohol, vorzugsweise mit Butylalkohol und dann mit einer alkoholischen Ätznatronlösung behandelt wird.