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Herstellung des .Antibiotikums Thiostrepton und dessen Salzen Die
Erfindung betrifft neue Antibiotika in verschiedenen Formen und die Verfahren zu
ihrer Herstellung durch Gärung, Konzentrierung, Reinigung und Isolierung sowie Überführung
in die Salze. In seiner freien Form wird das neue Antibiotikum Thiostrepton genannt.
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Das erfindungsgemäße Antibiotikum wird durch Züchtung einer bisher
noch nicht beschriebenen Spezies von Streptomyces unter geregelten Bedingungen gebildet.
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Der Mikroorganismus Der zur Gewinnung von Thiostrepton geeignete Mikroorganismus
ist ein Stamm von Streptomyces, welcher aus einer Probe von Wüstenerde aus Neu-Mexiko,
USA., isoliert wurde. Eine Kultur des lebenden Organismus wurde verpflanzt und der
Kulturensammlung des Rutger-Instituts für Mikrobiologie (New Brunswick, New Jersey)
einverleibt, von wo sie erhältlich ist. Sie erhielt die Nr. 3705 in der Waksman-Sammlung
und wird nachstehend als Streptomyces sp. 3705 bezeichnet.
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Die Erfindung ist natürlich nicht auf die Verwendung des hier beschriebenen
besonderen Organismus beschränkt, sondern umfaßt unter anderem Mutationsprodukte
des beschriebenen Organismus, welche durch Mutationsmittel, z. B. Röntgenstrahlen,
Ultraviolettstrahlung, Actinophagen oder chemische Verbindungen der Formel R - N(C
HZ C HZ C1)2, wobei R ein organisches Radikal ist, erhalten wurden. Zur Isolierung
und Charakterisierung des Mikroorganismus wird ein Teil der Bodenprobe in sterilem
destilliertem Wasser geschüttelt und auf Siebagar ausgebreitet. Dieses Medium enthält
Saccharose ........................ 10,0 g Zitronensäure ......................
1,2 g (NH4)2HPO4 ...................... 0,4 g K C1 ........... . ..................
0,08 g Mg C12 - 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,418 g Mn
Cl, - 4 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,036 g Fe CI3 ' 6
H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,023 g Zn C12 . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,021 g C0C12 » 6 H20 . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 0,004 g Agar .............................. 15,0 g destilliertes
Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ccm Die Kulturen werden dann durch
Aufstreichen auf einen Hefe-Rindfleischextrakt-Agar auf ihre antibiotische Wirksamkeit
sowohl gegen Bakterien als auch Pilze (Fungi) untersucht. Die Kultur hindert keinen
der Testfungi am Wachstum, jedoch die folgenden Testbakterien: Micrococcus pyogenes
var. aureus, Aerobacillus polymyxa, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis, Lactobacillus
acidophilus, Glostridium septicum, Diplococcus pneumoniae, Corynebacterium diphtheriae
und Mycobacterium tuberculosis. Im folgenden werden Kolonien des Organismus nach
zehntägiger Inkubation bei 24° C auf verschiedenen :Medien beschrieben (Farbbeschreibung
aus Ridgeways "Color Standards and Color Nomenclature«, Washington, D. C., 1912).
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Czapek-Dox-Agar 3 g Na N 03, 1 g K H2 P 04, 0,5 g K C1, 0,5 g Mg S
04 -711,0, 0,01 g Fe S 04 - 711,0, 40 g Glucose, 15 g Agar, destilliertes
Wasser auf 1000 ccm. Das Wachstum ist gut, die Kolonien besitzen ganze Ränder. Die
Sporenbildung ist weiß mit rauchgrauen Flächen und hellmediciblauen Flecken. Auf
der Unterseite der Kolonie ist das Wachstum hellolivgrün mit blaugelben dunkelblaugrünen,
grauen Flecken. Es wird kein Exopigment erzeugt.
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Sabourauds Schrägagar 40 g Glucose, 10 g Neopepton, 15 g Agar, destilliertes
Wasser auf 1000 ccm. Das Wachstum ist gut, die Kolonien besitzen gekräuselte Ränder,
die Sporen sind weiß. Das Wachstum auf der Unterseite der Kolonie ist ockerfarbengelbbraun
bis marsbraun. Ein braunes Exopigment wird erzeugt.
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Sojabohneninfusionsagar Eine 2°/oige Sojabohnenmehlsuspension wird
30 Minuten gekocht und heiß filtriert. Der pa-Wert wird dann mit Natriumhydroxyd
auf 7 eingestellt, und man fügt 0,20/, Glucose, 0,5"/, NaCl und 2°/a Agar zu. Das
Wachstum
ist gut, die -Kolonien besitzen ganze durchgehende Ränder, die Sporen sind weiß
bis zu einem hellen Paynesgrau, das Wachstum auf der Unterseite ist hellolivgelbbraun.
Es wird kein Exopigment erzeugt.
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Henrici Agar 5 g Kaseinat oder NZ-case, 5 ccm Glycerin, 2 g K2 H O
P4, Mg S 0q - 7 H20 (Spur), 15 g Agar, destilliertes Wasser auf 1000 ccm, pß 7,0.
Das Wachstum ist gut, die Kolonien besitzen ganze Ränder, die Sporen sind weiß mit
dunklen stumpfgrauen Teilen, das Wachstum auf der Unterseite der Kolonie ist schwarzbraun.
Kein Exopigment wird erzeugt.
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Hefe-Rindfleischextrakt-Agar 1,5 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextrakt,
6 g Pepton, 1 g Dextrose, 15 g Agar, destilliertes Wasser auf 1000
ccm. Das Wachstum ist gering, die Kolonien besitzen ganze Ränder, die Sporen sind
weiß, und das Wachstum auf der Unterseite der Kolonie ist grannig. Kein Exopigment
wird erzeugt.
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Die Kultur verflüssigt Gelatine und erzeugt einen sauren käsigen Niederschlag
in Milch. Sie bildet jedoch kein Indol oder reduziert nicht Nitrat zu. Nitrit. Der
Organismus kann die folgenden Kohlenstoffquellen in (N HJ ,S 04 als Stickstoffquelle
enthaltenden Grundkulturmedien verwerten: Arabinose, Rhamnose, Xylose, Glucose,
Galactose, Fructose, Mannose, Lactose, Maltose, Sucrose, Dextrin, Inulin, Raffinose,
Stärke, Glycerin, Inosit und Mannit. Das Wachstum wird nur schwach durch Salicin,
Sorbit, Natriumcitrat und Natriumacetat unterhalten. Das Wachstum wird nicht - durch
Dulcit, Ammoniumformiat, Ammoniumoxalat und Ammoniumtartrat unterhalten. In einem
Stärke als Kohlenstoffquelle enthaltenden Grundkulturmedium unterhalten die folgenden
Stickstoffquellen das Wachstum: Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Natriumnitrit und
Asparagin. Durch 1-Tyrosin und d,1-Tryptophan wird das Wachstum nur schwach unterhalten.
Durch Acetamid wird das Wachstum nicht unterhalten. Das Antibiotikum Es wurde gefunden,
daß Streptomyces sp. 3705 eine Mischung von Antibiotika erzeugt. Wenn er in einem
geeigneten Medium wächst, werden mindestens drei verschiedene Antibiotika erzeugt.
Wenn das Mycelium von der Brühe abfiltriert wird, ist eines der Antibiotika überwiegend
in dem Myceliumkuchen enthalten, während die anderen beiden Antibiotika sich hauptsächlich
im Filtrat befinden. Das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung bildende Antibiotikum
ist dasjenige, welches aus dem Myceliumkuchen extrahiert wird und Thiostrepton genannt
wird.
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Zur Erzeugung von Thiostrepton läßt man Streptomyces sp. 3705 bei
einer geeigneten Temperatur zwischen 20 und 35° C, vorzugsweise etwa 25 bis 27°
C, im überdeckten Zustand unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium
wachsen, welches eine assimilierbare, vergärbare Kohlenstoff- und Energiequelle
und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen,
wie vorstehend angegeben, Kohlehydrate, wie z. B. Stärke, Dextrin und Zucker, wie
Maltose, Lactose und Glucose, Glycerin, Lipoide, Fette usw. Geeignete Stickstoffquellen
sind unter anderem organische Stickstoffquellen, wie Asparagin und Sojabohnenmehl,
sowie anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsülfat oder Natriumnitrat. Die
Gärung wird etwa 72 bis 168 Stunden bei einem pH-Wert zwischen etwa 6 bis 8 durchgeführt.
Nach Ablauf dieser Zeit hat sich eine beträchtliche Menge Thiostrepton gebildet
(nachgewiesen durch Bioversuche), wie ausführlicher in den Beispielen beschrieben
wird.
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Nach beendetem Wachstum wird Thiostrepton aus dem Mycel der gesamten
Brühe durch Abtrennung des Myceliumkuchens aus der Brühe durch Filtration oder durch
Zentrifugieren isoliert. Das Thiostrepton wird dann aus dem Myceliumkuchen mit Hilfe
eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B. Chloroform, Dioxan, einem N,
N-Di (niederes Alkyl)-niederes-Alkansäureamid (z. B. N, N-Dimethylformamid oder
N, N-Dimethylacetamid) oder Benzylalkohol, extrahiert.
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Thiostrepton ist eine schwache Base, welche mit Säuren, insbesondere
Mineralsäuren (z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure) bei Umsetzung damit in einem
organischen Lösungsmittel, wie einem Alkohol (z. B. Äthanol), Salze bildet. Das
Antibiotikum bildet auch mit Erdalkalimetallsalzen (wie z. B. Calciumchlorid oder
Magnesiumchlorid) Komplexe, wenn es damit in einem organischen Lösungsmittel, z.
B. einem Alkohol (wie Methanol), umgesetzt wird. Sowohl die Säureadditionssalze
als auch die Erdalkahmetallkomplexe hydrolysieren bei Berührung mit Wasser.
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Die folgenden Beispiele erläutern geeignete Methoden zur Herstellung,
Reinigung und Bildung von Derivaten der erfindungsgemäßen Antibiotika.
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Beispiel 1 Gärung von Streptomyces sp.3705 in Schüttelflaschen Keimung:
Eine Schlingevoll einer Kultur von Streptomyces sp.3705 wird in einen das folgende
Medium enthaltenden 50-ccm-Kolben eingebracht: Sojabohnenmehl......................
15 g Dextrose ............................ 30 g CaCO3 . . ... . .. . . ... ......
.. ... . .. ... 2,5 g NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 1,09
Leitungswässer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1000 ccm Die Flasche wird 2 Tage bei 25° C auf einer hin und her gehenden Schüttelmaschine
(140 Hübe pro Minute, Hubweg 4,44 cm) bebrütet.
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Gärung: 10 ccm eines bei der Keimung erhaltenen Inoculums werden aus
dem Keimungskolben in fünf 1-1-Kolben übergeführt, welche jeweils das folgende Medium
enthalten: Sojabohnenmehl.................... 30 g Dextrose ..........................
20 g. Co C12 - 6 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,005 g CaCo3.............................
1,0 g Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ccm Die Kolben
werden 7 Tage auf einer hin und her gehenden Schüttelmaschine bei 25° C bebrütet.
Nach Ablauf der 7 Tage werden Proben der abzentrifugierten neutralen Brühe auf ihre
Wirksamkeit gegen Micrococcus pyogenes var. aureus und Mycobacterium tuberculosis
BCG mit den folgenden Ergebnissen getestet. Wirksamkeit in Verdünnungseinheiten:
M. pyogenes var. aureus M. tuberculosis BCG 250 bis 385 100 Beispiel 2 Gärung von
Streptomyces sp. 3705 in einem Behälter (Tank) I. Herkunft . des Inoculums: Vorratskulturen
von Streptomyces sp. 3705 werden wöchentlich in frischen Gouldschen Schrägagar übertragen
(20 g Agar, 10 g Glucose, 2,5 g Hefeextrakt, 1,0 g KZHOP, und 1000 ccm destilliertes
Wasser). Angeimpfte Schrägagare werden
nach drei- bis fünftägiger
Inkubation bei 25° C verwendet.
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II. Herstellung des Inoculums: In einen 500-ccm-Kolben, welcher 100
ccm des folgenden wäßrigen Mediums enthält Sojabohnenmehl......................
15 g Dextrose ............................ 20 g CaC03 ................... . ..........
5 g NaCI ............................... 1 g Leitungswasser . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 1000 ccm, das 30 Minuten bei 121' C nach Einstellung des
pH-Werts mit Natriumhydroxyd auf 7,0 bis 7,2 sterilisiert wurde, wird eine Schlingevoll
des unter I erhaltenen Wachstums eingebracht. Die Kultur wird 72 Stunden bei 25"
C bebrütet, worauf 10 ccm der Kultur auf ein zweites Medium von 100 ccm in einen
zweiten Kolben übertragen werden. Diese zweite Kultur wird 48 Stunden bei 25°C bebrütet,
worauf der Inhalt des zweiten Kolbens auf 1000 ccm des Mediums, welches sich in
einem 4-1-Kolben befindet, übertragen wird. Die dritte Kultur wird 48 Stunden bei
25° C bebrütet und dann in einen etwa 38 1 fassenden Keimungsbehälter gebracht,
welcher 25 1 eines vorher 15 Minuten bei 121' C sterilisierten Mediums enthält,
das folgende Zusammensetzung hat Sojabohnenmehl...................... 750 g Glucose
............................. 1000 g Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . 25 g Leitungswasser ....................... 251
(der
pii-Wert wird vor und nach der Sterilisation mit NaOH auf 7,0 eingestellt).
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Der Keimungsbehälter wird 30 bis 36 Stunden bei 25° C unter einem
Druck von etwa 0,7 at belüftet und gerührt. Zur Vermeidung eines zu starken Schäumens
wird dem Medium noch ein Antischaummittel zugesetzt.
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III. Gärung: In einen etwa 380 1 fassenden Gärungsbehälter, welcher
etwa 190 1 eines vorher 15 Minuten bei 121' C sterilisierten Mediums enthält, das
die folgende Zusammensetzung besitzt: 3,01 o Sojabohnenmehl, 3,00i,
Glucose,
0,50/, Ca C 03, 0,20/ , Nag S 0i, 0,25 °/, eines Antischaummittels (Einstellung
des pH-Werts auf 7,0 mit NaOH vor der Sterilisation), wird der Inhalt des Keimungsbehälters
zugegeben. Der Gärungsbehälter wird 56 bis 108 Stunden bei 25° C unter einem Druck
von etwa 0,7 at unter Durchrührung seines Inhalts belüftet.
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Nach Ablauf von 50 bis 80 Stunden erreicht die Wirksamkeit ein Maximum
von 10000 bis 16000 Verdünnungseinheiten/ccm (gegen Mikrococcus pyogenes var. aureus)
und bleibt danach im wesentlichen konstant. Der p,1-Wert der Gärungsbrühe bleibt
während der Gärung im Bereich von 7,0 bis 7,4 nahezu konstant.
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Thiostrepton kann dann nach den in folgenden Beispielen beschriebenen
Methoden aus der gesamten Brühe abgetrennt werden. Beispiel 3 Extraktion von Thiostrepton
aus dem Mycel Die gesamte neutrale Brühe wird filtriert, und der Filterkuchen wird
soweit als möglich in einer Presse getrocknet. Dann bringt man den feuchten Filterkuchen
in ein solches Volumen Chloroform ein, welches zur Erzielung einer guten Aufschlämmung
ausreicht (etwa 45,6 bis etwa 57 1 j e etwa 45 kg feuchter Kuchen) und rührt eine
halbe Stunde kräftig durch. Die Mischung wird filtriert, das Chloroform wird von
dem anwesenden Wasser geschieden, und man hält die Chloroformschicht zurück. Der
Kuchen wird dann mit einem zweiten Volumen Chloroform (etwa 35 bis 38 1 je etwa
45 kg feuchter Kuchen) extrahiert, filtriert, das Chloroform wird abgetrennt und
mit dem ersten Chloroformextrakt vereinigt. Die vereinigten Chloroformextrakte werden
dann im Vakuum bis auf ein Fünfzigstel des ursprünglichen Volumens destilliert (maximale
Gefäßtemperatur 25° C). Diesem Konzentrat werden 10 Volumina Hexan zugegeben. Nach
einstündigem Stehen wird der Niederschlag' abfiltriert, mit Aceton ausgewaschen
und getrocknet.
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Der Niederschlag (A) enthält 70 bis 90"/, reines Thiostrepton und
kann durch Lösen in Dioxan (1 g pro 10 ccm) Zugabe von Kohle (2 Gewichtsprozent
pro Volumen), Erwärmen der Mischung unter Rühren auf 50° C, Filtration und langsame
Zugabe von 5 Volumina Wasser zu dem Filtrat weiter gereinigt und kristallisiert
werden. Der so erhaltene kristalline Niederschlag ist ziemlich rein, jedoch noch
etwas gefärbt. Er kann weiter unter Erzielung eines weißeren Produkts gereinigt
werden, wenn man ihn erneut in Dioxan löst (1 g pro 15 ccm), filtriert und dem Filtrat-
langsam 5 Volumina einer 50°/,igen wäßrigen Methanollösung zusetzt. Man läßt die
Mischung über Nacht bei Raumtemperatur stehen, trennt dann den kristallinen Niederschlag
von Thiostrepton ab, wäscht mit Aceton und trocknet. Das Produkt ist ein weißer
oder sehr gelber gleichmäßig kristalliner Stoff, welcher bei einem Test gegen Micrococcus
pyogenes var. aureus 100000 bis 110000 Verdünnungseinheiten pro mg ergibt. Die Ausbeute
liegt in -jeder Kristallisations- und Umkristallisationsstufe zwischen etwa 75 und
800/,.
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Die weiteren wirksamen Stoffe sind ebenfalls in der gesamten Brühe
in kleinen Mengen enthalten. Einer dieser Stoffe kann aus dem ersten rohen Niederschlag
(A) durch Aufschlämmung in Aceton erhalten werden. Dieser besondere Stoff ist in
Aceton löslich und kann daraus mit Wasser ausgefällt oder durch Verdampfung des
Acetons bis zur Trockne erhalten werden. Der Bioversuch dieses teilweise gereinigten
Stoffes ergibt etwa 6000 bis 8000 Verdünnungseinheiten pro mg (Micrococcus pyogenes
var. aureus).
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Ein anderer anwesender Stoff kann durch Kristallisation der bei der
zweiten Ausfällung des Thiostreptons anfallenden Mutterlaugen erhalten werden. Er
ist löslicher als Thiostrepton und wird aus den organischen, zur Umkristallisation
verwendeten Mutterlaugen nur nach Zugabe von viel Wasser gewonnen. Die Biowirksamkeit
in vitro des rohen Materials beträgt etwa 15 000 bis 20 000 Verdünnungseinheiten
pro mg (Micrococcus pyogenes var. aureus). Beispiel 4 Herstellung des Hydrochlorids
von Thiostrepton Das Hydrochlorid von Thiostrepton wird durch Aufschlämmung des
kristallinen oder rohen Thiostreptons in einem Alkohol, z. B. Methanol, und Zugabe
eines Äquivalents Salzsäure in Form einer konzentrierten wäßrigen Lösung gebildet.
Das Thiostrepton löst sich dabei, was die Salzbildung anzeigt. Das Hydrochlorid
kann aus dieser Lösung durch Zugabe von Äther oder Äthylacetat ausgefällt werden.
Das Hydrochlorid ist als Feststoff oder in der ursprünglichen Methanollösung instabil,
und seine Wirksamkeit fällt rasch ab. Wenn dem Feststoff oder der Alkohollösung
Wasser zugesetzt wird, hydrolysiert das Salz sofort, und man erhält die freie Base.
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Andere Säureadditionssalze, z. B. das Sulfat, können auf dieselbe
Weise wie das Hydroxyd hergestellt werden und besitzen die gleichen allgemeinen
Eigenschaften.
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Beispiel 5 Herstellung des Calciumchloridkomplexes von Thiostrepton
Der Calciumchloridkomplex wird durch Aufschlämmung der Thiostreptonbase in einer
0,5°/,igen methanolischen
Calciumchloridlösung in einer Konzentration
von 4 bis 5 mg pro ccm gebildet. Die Base löst sich langsam, was eine Komplexbildung
anzeigt, da sich die Base in Abwesenheit von Calciumchlorid nicht löst. Wenn die
Lösung beendet ist, wird der Komplex durch Zugabe von Äther oder Äthylacetat ausgefällt.
Die Zugabe von Wasser zu dem Feststoff oder zu der ursprünglichen methanolischen
Lösung bewirkt eine sofortige Hydrolyse des Komplexes unter Rückbildung der freien
Base.
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Chemische und physikalische Eigenschaften von Thiostrepton Kristallines
Thiostrepton besitzt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:
Schmelzpunkt: Dunkelt bei etwa 235° C und schmilzt unter Zersetzung bei etwa 246
bis 256° C.
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Elementaranalyse (angenähert) : C = 51,75 °/o, H = 5,30 °/a, S = 9,22
°/o, N = 15,84 0/a, O = 17,89 %
(durch Differenz). Keine anderen Elemente
anwesend. Acetyl = 8,70 °/o; keine Methoxygruppen. Bildet keine Ester mit Bernsteinsäure
oder Phthalsäureanhydriden. Äquivalentgewicht = 380.
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Löslichkeit: Gute Löslichkeit in Dioxan, Chloroform, N, N-Dimethylformamid,
N, N-Dimethylacetamid und Benzylalkohol. Löslich bis zu 100 bis 200 mcg/ccm in Alkanolen,
wie Methanol, Äthanol, Isopropanol und Butanol sowie in Trichloräthylen und Propylenglycol.
Nahezu unlöslich in Wasser (10 bis 20 mcg/ccm). Unlöslich in Äther, Aceton, Benzol,
Hexan, Äthylacetat, Amylacetat, Dibutyläther, Glycol, Diäthylenglycol, Glycerin,
Getreideöl, Sesamöl und Äthyloleat.
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Stabilität: Stabil während bis zu einer Woche in einer 50:50-Lösung
von Dioxan und Wasser bei einem pB-Wert von 7 und 30°C. Völlig instabil in demselben
Lösungsmittelsystem bei prWerten von 2 und 11. Stabil in Dimethylacetamid für mindestens
2 Monate unterhalb Raumtemperatur (nur geringer Verlust an Wirksamkeit nach 2 Monaten
bei Raumtemperatur).
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Ultraviolettspektrum: Die Absätze bei der Ultraviolettabsorption von
kristallinem Thiostrepton in Methanol treten bei den folgenden Wellenlängen auf:
240, 280, 305 a (m#t).
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Ultrarotspektrum: Die Ultrarotabsorptionsmaxima-und -absätze (A) liegen
bei den folgenden Frequenzen und Wellenlängen
| Y (c--1) I ) (f') I Y (cm-') I ) (du) |
| 3289 3,04 1116 8,96 |
| 1733 5,77 1094 9,14 |
| 1658 6,03 1060 9,43 |
| 1631 6,13 1033 9,68 (A) |
| 1580 6,33 1020 9,80 |
| 1534 6,52 (A) 984 10,16 |
| 1511 6,62 971 10,30 |
| 1486 6,73 951 10,52 |
| 1420 7,04 (A) 935 10,70 |
| 1376 7,27 921 10,86 (A) |
| 1366 7,32 (A) 893 11,20 |
| 1348 7,42 (A) 856 11,68 |
| 1309 7,64 808 12,38 |
| 1282 7,80 780 12,82 |
| 1269 7,88 769 13,00 (A) |
| 1244 8,04 (A) 760 13,15 |
| 1203 8,31 740 13,52 |
| 1166 8,58 (A) 730 13,70 |
| 1152 8,68 (A) |
| 1138 8,79 |
Biologische Eigenschaften von Thiostrepton Thiostrepton besitzt ein weites baktericides
Spektrum gegen viele Bakterien und Viren (wie die folgende Teilaufstellung zeigt)
| Zur Wachs- |
| tumshemmung |
| Mikroorganismus ausreichende |
| Mindest- |
| konzentration |
| in y/ccm |
| Micrococcus pyogenes var. aureus 209 P 0,01 bis 0,02 |
| Cahill 0,03 |
| Nr.5.. 1,25 |
| Nr. 376 1,67 |
| Streptococcus pyogenes C 203......... 0,003 |
| Bacillus subtilis ..................... 0,03 |
| Streptococcus faecalis ................ 0,06 |
| Lactobacillus acidophilus . . . . . . . . . . . . . 0,06 |
| Clostridium septicum ................ 0,15 |
| Dyplococcus pneumoniae, Typ 3 ...... 0,3 |
| Corynebacterium diphtheriae ......... 0,4 |
| Mycobacterium tuberculosis var. bo-#ris |
| (BCG)............................ 3,0 |
| Aerobacter aerogenes ................ 50 |
| Escherichia coli ..................... 50 |
| Pseudomonas aeruginosa ............. 50 |
| Salmonella schettmulleri .. ... .... .. .. 50 |
| Shigella Bonnei...................... 50 |
| Klebsiella pneumoniae .. . . . .. . .... . .. 50 |
| Proteus vulgaris .................... 50 |
| Salmonella typhosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 |
| Shigella dysenteriae.................. 30 |
Weitere Versuche wurden mit Eiern, Mäusen, Ratten, Kaninchen und Katzen zur Bestimmung
der Giftwirkung und der Wirksamkeit von Thiostrepton durchgeführt.
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Zur Bestimmung der in-viv o-Aktivität von Thiostrepton gegen Meningopneumonitis-Virus
in Eiern werden 7 Tage alte befruchtete Eier mit hundert zu 50 °;`o letalen Dosen
eines standartisierten Inoculums von Miningopneumonitis am Dottersack infiziert.
Die Eier werden dann einen Tag nach der Infektion über den Dottersack mit in Dimethylacetamid
gelöstem Thiostrepton (Verhältnis des Antibiotikums zu Dimethylacetamid 1 : 10)
unter Erzielung der in der Tabelle 1 angegebenen Werte behandelt.
| Tabelle 1 |
| Schutzdosis, |
| Mittlere Unterschied Zahl der wirksam für |
| Getestete Über- der Über- Überlebenden 50 °/o der |
| Menge Lebenszeit Lebenszeit insgesamt Versuchs- |
| objekte2) |
| mg/Ei Stunden Stunden') nach 10 Tagen mg/Ei |
| Kontrolle |
| (Dimethyl- |
| acetamid) 158 0/18 |
| 1,0 219 -E- 61 8/16 0,72 |
| 0,5 213 + 55 7/17 |
| 0,25 189 + 31 1/17 |
| 1) Am zehnten Tage nach der Infektion noch lebenden Em- |
| bryos wurde für die Berechnung eine Überlebenszeit von 240 |
| Stunden zugeschrieben. |
| 2) Methode nach Reed und Muench. |
Zur Bestimmung der in-vivo-Wirksamkeit von Thiostrepton gegenüber Streptococcus
pyogenes
C203 in Mäusen wurden die Mäuse mit einem standartisierten Inoculum
von Streptococcus pyogenes C 203 durch
intraperitoneale Injektion
infiziert. Die :Mäuse wurden dann durch subcutane Injektion mit Thiostrepton behandelt,
welches in reinem N, N-Dimethylacetamid gelöst war und mit Wasser auf die in Tabelle
2 angegebene Endkonzentration verdünnt wurde.
| Tabelle 2 |
| Testspiegel Überlebende |
| (mcg/Maus in 0,5 ccm Lösung) 0/0 |
| Kontrolle (Salzlösung) 0 |
| 40 100 |
| 20 100 |
| 10 20 |
Teste wurden auch zur Bestimmung der Wirksamkeit von Thiostrepton gegen Micrococcus
pyogenes var. aureus Nr. 5 (penicillinempfindlicher Stamm) und Micrococcus pyogenes
var. aureus Nr.376 (penicillinbeständiger Stamm) bei Mäusen durchgeführt. Für diese
Bestimmungen wurden 18 bis 20 g wiegende Mäuse intraperitoneal mit einem standardisierten
Inoculum des betreffenden Stammes in 5 °/o Mucin infiziert. Die infizierten Mäuse
wurden dann durch intravenöse Injektion mit einer einzigen Dosis Thiostrepton auf
die in Tabelle 3 angegebene Weise behandelt. Zum Vergleich wurden Versuche unter
Verwendung des Calciumsalzes von Penicillin G anstatt mit dem erfindungsgemäßen
Antibiotikum durchgeführt.
| Tabelle 3 |
| Antibiotikum Art der Verabreichung Wirksamkeit gegen M. pyogenes
var. aureus |
| Durchschnittliche Überlebenszeit = 20 Stunden Penicillinempfind-
Penicillinbeständiger |
| Kontrollsalzlösung Überlebende/insgesamt (Ü/i) = 0/10 licher
Stamm Nr. 5 Stamm Nr. 376 |
| Uüzl) I Ü/i UIt21) I ü/i |
| Thiostrepton 100 mcg Antibiotikum + 1000 mcg N, N-Dimethyl- |
| acetamid (DMA) in 0,5 ccm physiologischer Salzlösung 222 10/10
220 10/10 |
| 50 mcg Antibiotikum -f- 500 mcg DMA in 0,25 ccm phy- |
| siologischer Salzlösung .......................... 200 9/10
109 5/10 |
| 25 mcg Antibiotikum + mcg DMA in 0,125 ccm physiolo- |
| gischer Salzlösung .............................. 89 4/10 42
2/10 |
| 100 mcg Antibiotikum -(- 1000 mcg Dioxan in 0,5 ccm |
| physiologischer Salzlösung ....................... 190 8/10
163 7/10 |
| 50 mcg Antibiotikum + 500 mcg Dioxan in 0,25 ccm |
| physiologischer Salzlösung ....................... 44 2/10
0 0/9 |
| 25 mcg Antibiotikum + 250 mcg Dioxan in 0,125 ccm |
| physiologischer Salzlösung ....................... 32 1/10
0 0/10 |
| Penicillin G 60 megAntibiotikum in 0,5 ccm physiologischer
Salzlösung 155 7/10 0 0/10 |
| (Kaliumsalz) 30 mcgAntibiotikum in0,25 ccm physiologischerSalzlösung
123 5/10 0 0/9 |
| 15 mcg Antibiotikum in 0,125 ccm physiologischer Salz- |
| lösung ......................................... 133 6/10 0
0/10 |
| 1) UÜZ = Unterschied der Überlebenszeit gegenüber den Kontrollversuchen
(in Stunden). |
| a) Beständig gegen 100 Einheiten Penicillin in vitro. |
Die vorstehenden Teste zeigen die besondere Wirksamkeit von Thiostrepton in vivo
gegen Micrococcus- und Streptococcusinfektionen.
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Zur Bestimmung der akuten Giftigkeit (Toxität) von Thiostrepton in
Mäusen wurde eine 10°/oige Lösung des Antibiotikums in N, N-Dimethylacetamid 1 :
20 mit destilliertem Wasser verdünnt und der Maus intravenös verabreicht (0,1 ccm
pro 5 Sekunden). Die für 50°/o der :Mäuse letale Dosis wurde zu etwa 41,7 mg /kg
befunden, und die für 20/, der Tiere letale Dosis schätzte man auf 23,1 mg/kg. Es
wurde auch festgestellt, daß eine einzige intravenöse Injektion von 5 mg Thiostrepton
pro kg keinen widrigen Einfluß auf Testtiere, wie Katzen, Ratten und Kaninchen,
besitzt.
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Für die menschliche Therapie zeigt Thiostrepton generell dasselbe
antibiotische Spektrum wie Penicillin und kann gegen grampositive coccale Infektion,
wie streptococcale, staphylococcale und pneumococcale Infektionen, Anwendung finden.
Es kann unter anderem oral und intravenös verabreicht werden. Für die orale Verabreichung
bei der Behandlung von staphylococcaler Infektion des Gastrointestinaltracts wird
das Antibiotikum bei der oralen Verabreichung in zweiteiligen Kapseln in einer Dosis
von etwa 1 bis 2 g pro Tag gegeben. Zur intravenösen Verabreichung wird das Antibiotikum
zuerst in 100°/oigem N, N-Dimethylacetamid gelöst und vor der Injektion mit Wasser
gemischt, so daß man eine etwa 10 °/o N, N-Dimethylacetamid und etwa 90 °/o Wasser
enthaltende Endzusammensetzung erhält. Diese Zusammensetzung wird dann intravenös
in einer Dosis von etwa 300 bis 400 mg Thiostrepton pro Tag verabreicht.
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Die Erfindung kann weitgehende Abänderung erfahren, ohne daß dadurch
ihr Rahmen verlassen wird.