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Herstellung und Reinigung fungizid und antibiotisch wirksamer Stoffe
Die Erfindung betrifft die Herstellung und Reinigung von fungizid und antibiotisch
wirkenden Stoffen.
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In den letzten Jahren haben die von Erfolg begleiteten Versuche, therapeutisch
wertvolle Substanzen aus verschiedenen Organismen zu erhalten, die Suche nach neuen
und besseren Antibiotika, die bei Fermentationsprozessen entstehen, beschleunigt.
Der Wert von Antibiotika mit einem breiten Wirkungsspektrum, wie Penicillin, Streptomycin,
Chlortetracyclin usw., ist anerkannt und die Suche nach weiteren Stoffen dieser
Art daraufhin stark intensiviert worden. Einen Gegenstand dieser Untersuchungen
bildet die Entwicklung von Antibiotika, die eine mehr spezifische Wirkungsweise
zeigen bzw. die eine Aktivität gegenüber Organismen entwickeln, gegenüber denen
die bisher verfügbaren Antibiotika nur von begrenztem Wert sind. Obgleich z. B.
bislang das Fehlen einer wirksamen Methode zur Behandlung von Mycosen ein in der
medizinischen Mycologie offenstehendes Problem ist, gibt es heute, wenn überhaupt,
nur wenige antibiotische Stoffe, die unter diesen Bedingungen von allgemeinerem
Wert sind.
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Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung eines neuen antibiotisch
wirkenden Stoffes, wobei das Antibiotikum gleichzeitig ein Fungizid ist. Die Erfindung
betrifft weiterhin die Abtrennung und Reinigung dieser fungiziden Substanz aus rohen
Konzentraten in relativ reiner Form.
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Das neue Fungizid und Antibiotikum, das nach der Erfindung erhalten
wird, hat sich sowohl in vitro als auch in vivo wirksam erwiesen. Es wird durch
Kultivierung von bis dahin unbekannten Stämmen oder Arten der Streptomyces erhalten,
die bei der Culture Collection Section, Fermentation Division des Northem Regional
Researcy Laboratoriums des United States Department of Agriculture deponiert worden
und infolgedessen von dort verfügbar sind und der ständigen Sammlung von Kulturen
von Mikroorganismen als NRRL 2390 einverleibt worden sind.
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Dieser neue Organismus hat den Namen Streptomyces aminophilus erhalten,
da eines seiner charakteristisch . kennzeichnenden Merkmale darin besteht, daß es
für das Wachstum organischen Stickstoff benötigt und anorganischen Stickstoff nur
in unwesentlicher Menge benutzt.
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Dieser Organismus unterscheidet sich von den anderen maßgebenden Arten,
die in der maßgebenden Klassifizierung der Actinomyceten nach dem Schlüssel von
Bergeys »Manual of Determinative Bacteriologyu, 6. Auflage, aufgeführt sind, durch
folgende charakteristische Eigenschaften: 1. Er benutzt weder Nitrate oder Ammoniak
als einzige Stickstoffquelle; 2. er produziert ein lösliches braunes Pigment auf
Asparagin enthaltenden Medium, jedoch nicht auf einem Medium, das komplexen organischen
Stickstoff aufweist; 3. grüngelbes vegetatives Mycel und weißes luftiges Mycel ;
4. mercaptanähnlicher Geruch, insbesondere auf Glucose-Pepton-Medium.
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Seine Stellung in dem Klassifizierungsschema kann in folgender Weise
gekennzeichnet werden: Familie: Streptomycetacese Art: Streptomyces I. mesophile
Saprophyte (Fäulnispflanze) F. auf Gelatine oder anderen komplexen Medien wird kein
lösliches Pigment gebildet; 2. schwache proleolytische Wirkung; a) auf synthetischem
Agar (Glucose- oder Glycerin-Asparagin-Agar) wird lösliches Pigment gebildet; bb)
Pigment braun bis schwarz.
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Die charakteristischen Eigenschaften dieser Arten, ihre Kultur betreffend,
sind weiter unten beschrieben. Das vegetative Mycel ist verzweigt und von 0,2,u
Durchmesser. Das Luftmycel ist monopodial verzweigt, 0,4,u Durchmesser. Es werden
offene Spiralen erzeugt. Die Conidien sind ellipsoidal und messen 0,3 bis 0,4 x
0,9 bis 1,4,u.
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Der optimale Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 37° in allen
Medien ohne wesentlichen Unterschied, mit Ausnahme der Wachstumsgeschwindigkeit.
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Das Wachstum auf Nähragar bildet ein grünlichgelbes vegetatives Mycel
mit leicht erhöhtem Luftmycel, das
hauptsächlich in der Mitte der
Kolonien erzeugt wird. Die Untergrundfläche ist zitronengelb; es wird kein lösliches
Pigment gebildet.
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DasWachstum aufGlucose-Pepton-Agarbildet eingelbes vegetatives Mycel
mit reichlichem weißem Luftmycel. Die Untergrundfläche ist gelb und wird in der
Mitte braun. Es wird ein starker mercaptanähnlicher Geruch erzeugt.
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Bei Wachstum auf Stärke-Agar wird die Stärke hydrolysiert. Das Wachstum
erzeugt ein gelbes vegetatives Mycel mit spärlich entwickeltem Luftmycel. Es wird
ein schwach gelbbraunes lösliches Pigment erzeugt.
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Das Wachstum auf Sabourauds-Agar erzeugt ein reichlich erhöhtes verfilztes
Wachstum, das vollständig mit weißem Luftmycel bedeckt ist. Die Untergrundfläche
ist braun; es wird kein lösliches Pigment gebildet.
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Das Wachstum auf Kartoffeloberflächen ist sehr schnell. Die Kultur
weist zunächst gelbe Farbe auf, wird aber schnell mit weißem Luftmycel bedeckt,
das stark erhöht und verfilzt ist. Nur nahe dem oberen Teil der Oberfläche ist eine
braune Verfärbung der Kartoffel wahrnehmbar. Die Kartoffel nimmt in ihrer Größe
rasch ab, augenscheinlich infolge von Digestion.
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Auf Gelatine werden Röhrchenkulturen in etwa 15 bis 30 Tagen flüssig.
Es bildet sich ein flockiges weißes Wachstum längs des Einstichs bei 25' und eine
Ablagerung am Boden bei höheren Temperaturen. Es wird kein Pigment gebildet.
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Auf Agar von äpfelsaurem Kalk bildet sich ein gelbes Mycel, das teilweise
mit weißem Luftmycel bedeckt ist. Die Untergrundfläche ist gelb. Es wird kein lösliches
Pigment gebildet.
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Bei dem Wachstum auf Kraftnährbrühe bilden sich weiße Kolonien auf
dem Boden und auf der Oberfläche. Es wird kein lösliches Pigment erzeugt.
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Sowohl auf Glycerinnitrat-Agar als auf Glucosenitrat-Agar bildet sich
eine sehr leicht ausbreitende Kultur.
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Das Wachstum auf Glycerin-Asparagin-Agar bildet ein gelbes Mycel.
Die Oberfläche ist erhöht und verfilzt, wobei nur an den Kanten Sporenbildung vorhanden
ist. An den Teilen, die nicht mit Luftmycel bedeckt sind, entwickelt sich eine leicht
grünliche Farbe. Die Untergrundfläche ist gelb und wird in alten Kulturen braun.
Es wird ein lösliches Pigment erzeugt, das zunächst leicht rosa ist, später jedoch
rötlichbraun wird.
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Das Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar gleicht dem Wachstum auf Glycerin-Asparagin-Agar,
mit der Ausnahme, daß das Luftmycel reichlicher auftritt und das lösliche Pigment
weniger stark ist.
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Auf Mohrrübenoberflächen entwickelt sich das Wachstum sehr langsam,
jedoch nach etwa 20 Tagen gleicht es dem Wachstum auf Kartoffeloberflächen.
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Lackmusmilch wird nicht koaguliert; sie wird langsam peptonisiert
und bleibt während 30 Tagen bei 30' nahezu klar. An der Oberfläche bildet sich ein
rötlichbrauner Ring.
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Die Nitratreduktion ist positiv. Es wird jedoch kein Indol produziert.
Der Organismus ist nicht dazu befähigt, N 03-,N H4+ oder N 0=- als einzige Quelle
für Stickstoff zu benutzen.
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Als Quelle für Kohlehydrate verbraucht der Organismus schnell Stärke,
Dextrin, Glucose, Maltose, Inulin, Ribose, Lävulose, Galactose, Glycerin, Mannit
und Cellobiose. Die nachfolgend aufgeführten Verbindungen vermag er nur langsam
zu verbrauchen. Es sind Arabinose, Mannose, Saccharose, Lactose, Salicin, Sorbit
und bernsteinsaures Natrium. Nachfolgend aufgeführte Verbindungen werden überhaupt
nicht oder nur in zu vernachlässigenden Mengen verbraucht. Es sind Inosit, Raffinose,
Rhamnose, Lyxose, Xylose, Dulcit, Natriumcitrat und Natriumacetat. Bei Untersuchung
des Kohlehydratverbrauchs zeigte es sich, daß sowohl von Glutaminsäure als auch
von Asparagin als Stickstoffquelle 0,2"/, ausreichend sind.
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Der Organismus wächst in einem wäßrigen Kulturmedium, das eine Quelle
für assimilierbaren Stickstoff, eine Quelle für Kohlehydrat und die wesentlichen
Mineralsalze enthält, schnell. Ein typisches Beispiel für ein solches Nährmedium
ist eines, das aus 17,5 g dehydratisiertem pro Liter hergestellt wird. Die wäßrige
Brühe wird in der Weise hergestellt, daß man den Nährstoff dem Wasser in dem angegebenen
Verhältnis zufügt und die Fermentationsbrühe sterilisiert, indem man sie im Autoklav
45 Minuten auf 121° erhitzt. Das Wachstum des Mikroorganismus findet unter Belüftung
und submers statt. Das Oberflächenwachstum ist auch befriedigend. Das Nährmedium
enthält pro 17,5 g Einheiten 1,5 g Fleischextrakt, 1,5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton,
1 g Dextrose, 3,5g Natriumchlorid, 3,68 g Dikaliumphosphat und 1,32 g Monokaliumphosphat.
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Bei der Kultur des Organismus wird die sterile Nährlösung mit einer
Schüttelkultur des Organismus, die in einem Erlenmeyer-Kolben bei Raumtemperatur
4 Tage gewachsen ist, wobei 100 ccm des obengenannten wäßrigen Nährmediums für die
Schüttelkultur verwendet wird, beimpft. Die ursprünglich beimpfte Brühe ist klar,
bernsteinfarbig; und das Wachstum der Kultur zeigt sich an der Bildung von kleinen
Partikelchen in dem Kolben. Die Fermentierung findet in Anwesenheit von Luft statt
und wird nach der Beimpfung mit der Schüttelkultur gewöhnlich 10 Tage durchgeführt.
Temperaturen in dem Bereich zwischen 15 und 40', vorzugsweise um etwa 20', sind
ausreichend und werden bei konstantem Rühren durch die Einführung von steriler Luft
gehalten. Die Zuführungsgeschwindigkeit der Luft ist so eingestellt, daß gerade
kein Schäumen verursacht wird. Die Luft kann mit einer Geschwindigkeit zwischen
0,5 und 2 Volumen Luft pro Volumen Brühe pro Minute zugeführt werden. Übermäßiges
Schäumen kann mit Antischaummitteln, wie Pflanzenölen, überwunden werden.
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Nach zehntägigem Wachstum wird das Mycel eingebracht, indem man das
Material in den Fermentierungsbehältern ein geeignetes Filter passieren läßt, um
das Mycel von der Flüssigkeit abzutrennen. Die erzeugte aktive fungizide Substanz
befindet sich in dem Mycel. Sie wird in der Weise isoliert, daß man das Mycel mit
Wasser wäscht, um das inerte wasserlösliche Material daraus zu entfernen, und dann
das restliche Material mit einem Lösungsmittel, wie Methanol, extrahiert. Durch
dieses Extraktionsverfahren wird das aktive fungizide Material von dem Mycel getrennt.
Es weist eine leicht basische Reaktion auf.
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Die Extraktion des als Fermentierungsprodukt erhaltenen Mycels umfaßt
gewöhnlich verschiedene getrennte Extraktionen, um eine maximale Ausbeute an aktiver
fungizider Substanz zu erzielen. Es ist vorteilhaft, wenn man die Zellen des Mycels
vor der Extraktion zum Platzen bringt. Bei der Anwendung des mehrstufigen Extraktionsverfahrens
hat es sich erwiesen, daß etwa fünf Extraktionsstufen gewöhnlich ausreichend sind,
um den größten Teil der vorliegenden aktiven fungiziden Substanz abzutrennen. Für
die Menge Mycel, die man aus 20 1 fermentiertem Nährmedium erhält, werden in jeder
der getrennten Extraktionsstufen etwa 1,5 bis 2 1 Methanol verwendet. Die Extraktion
führt man in der Weise aus, daß man Mycel in Mischung mit Methanol einige Stunden
bei Raumtemperatur rührt und das Mycel von dem Methanol unter Benutzung eines geeigneten
Filters, beispielsweise
eines gesinterten Glasfilters, abfiltriert.
Die Methanolfiltrate können unter partiellem Vakuum eingedampft werden. Der gelbliche
amorphe Rückstand wird in destilliertem Wasser aufgenommen. Die erhaltenen wäßrigen
Mischungen lyophilisiert man oder unterwirft sie der Gefriertrocknung. Die rohen
pulverförmigen Fraktionen, die nach der Lyophilisierung erhalten werden, werden
gewöhnlich miteinander vereinigt, wenn sie getrennt verdampft und lyophilisiert
worden waren, und können weiter durch ein modifiziertes chromatographisches Absorptionsverfahren
gereinigt werden, um die Fraktionen größter Aktivität abzutrennen.
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Zur Durchführung der bevorzugten chromatographischen Absorptionstechnik
benutzt man ein Lösungsmittel, das aus einer Mischung von 25 ccm eines Gemisches
von 3 Teilen n-Propanol auf 1 Teil Wasser, 5 ccm redestilliertes Benzol und 1 ccm
Eisessig besteht. Die gewünschte Fraktionierung erhält man bei Benutzung einer Absorptionskolonne,
die mit Holzbreicellulose gefüllt ist, die in die Kolonne in Form einer Aufschlämmung
in dem Lösungsmittel eingeführt und dann an Ort und Stelle dicht gepackt wird. Eine
ausgezeichnete Trennung erreicht man in einer Apparatur, deren Absorptionskolonne
einen Durchmesser von 22,2 cm hat und in der die aufgeschlämmte Cellulose zu einer
Höhe von 14 cm gepackt ist. Bis zur Verwendung in der Trennungsstufe wird die Cellulose
in der Kolonne mit dem Lösungsmittel während der ganzen Zeit feucht gehalten.
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Um die gewünschte Fraktionierung durchzuführen, wird das vereinigte
lyophilisierte oder gefriergetrocknete Material mit Wasser verrührt, dann filtriert
und das zurückbleibende feste Material mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat mit
Silbernitrat keinen Niederschlag mehr gibt. Der Rückstand wird an der Luft getrocknet,
auf die feuchte Holzbreicellulose in der Absorptionskolonne gebracht und das Lösungsmittel
langsam durch den auf der Cellulose ruhenden Rückstand geschickt und dann durch
die Kolonne wandern gelassen. Das Lösungsmittel, das durch die Kolonne hindurchgeht,
wird in Abständen von 30 Minuten gesammelt, wobei gewöhnlich etwa 3 bis 5 ccm aufgefangen
werden. Die auf diese Weise bis jetzt erhaltene Fraktion mit der größten Aktivität
wies eine Aktivität von mehr als 10 000 E./mg gegenüber einem Standard von 1000
E./mg für die vereinigten Materialien auf, wie die Bestimmung durch die nephelometrische
Methode ergab. Bei der Untersuchungsmethode wurde C. albicans M 63 als Testorganismus
benutzt. Als Einheit ist die Aktivitätsstärke definiert, die in einem Mikrogramm
oder seinem Äquivalent des Ansatzes Nr. 5 dieses Materials enthalten ist.
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Ein charakteristisches Infrarot-Absorptions-Spektrum des aktiven Fungizids
und Antibiotikums, das auf einem Salzfenster verdampft wurde, ist in Fig. 1 dargestellt.
Dieses Infrarot-Absorptions-Spektrum zeigt eine O H-oder N H-Absorptionsbande bei
etwa 3,05 &t" eine CH-Bande bei etwa 3,4 #t und eine Amidfunktion bei etwa 6,4
#L. Ein charakteristisches Ultraviolett-Absorptions-Spektrum ist in Fig. 2 dargestellt.
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Die neue fungizide und antibiotische Substanz, die nach dem beschriebenen
Fermentationsprozeß erhalten wird, hat sich in vivo gegenüber Sporotrichum-schenkii-Infektionen
bei intrapaperitonealer Applikation als wirksam erwiesen. Dosierungen von 10 bis
20 mg/kg Körpergewicht sind ausreichend.
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Die minimale Inhibitionskonzentration der fungiziden Substanz in #tg/ccm,
die gegenüber bestimmten Organismen benötigt wird, ist in der nachfolgenden Tabelle
aufgezeichnet.
| 1Vlinimale Inhibitionskonzentration in @.g/ccm |
| dTCC Name |
| N r. Tage |
| 3 4 i 5 I 6 I 7 I 8 9 |
| ' I I I |
| 9197 Aspergillus fumigatus . . . . . . . . . . K. W.
31,2 31,2 125,0 250,0 250,0 500,0 i 500,0 500,0 |
| 10124 Aspergillus Flavus . . . . . . . . . . . . . K. W. .
125,0 125,0 250,0 j 250,0 250,0 I 250,0i 500,0 500,0 |
| 10522 Gliocladium vermoeseni . . . . . . . . K. W. K.
W. K. W. K. W. 7,8 ' 15,6 15,6I 31,2 ; 62,5 |
| 10216 Microsporum audouini . . . . . . . . . K. W. @,
7,8 7,8 7,8I 62,5 125,0 250,0 250,0 250,0 |
| 8138 Microsporum canis . . . . . . . . . . . . . K.
W. 62,5 62,5 62,5 250,0 250,0 250,0 250,0 250,0 |
| 10215 Microsporum gypseum . . . . . . . . . K. W. 62,5
62,5 62,5 250,0 250,0 500,0 500,0 500,0 |
| 8506 Penicillium citrinum . . . . . . . . . . . K. W.
125,0 125,0 125,0 250,0 500,0 500,0 500,0 500,0 |
| 9533 Trichophyton mentagrophytes . . K. W. K. W. 7,8
125,0 250,0 250,0 250,0 250,0 250,0 |
| 9129 Trichophyton mentagrophytes . . K. W. 31,2 31,2
31,2 250,0 250,0 250,0 250,0 250,0 |
| 9471 Alphalosporium spinosum ...... 250,0 250,0 250,0
250,0 250,0 |
| 6676 Hypomyces rosellus . . . . . . . . . . . . 1,9
3,9 7,8 7,8 7,8 |
| 9275 Gilocladium fimbriatum . . . . . . . . 125,0 125,0
250,0 250,0 250,0 |
| 10195 Chaetomium cochlioides ........ 7,8 62,5 125,0 125,0
125,0 |
| 9095 Myrothecium verrucaria . . . . . . . . 125,0 125,0
125,0 250,0 250,0 |
| 10226 Cryptococcus neoformans ....... 1,9 3,9
3,9I 7,8I 7,8 |
| 4414 Cryptococcus neoformans ....... 3,9 3,9 31,2 125,0
125,0i |
| 9366 Debaryomyces marylandi ....... 1,9 62,5
125,0I 250,0 250,0 |
| 9947 Endomycopsis fibuliger . . . . . . . . . 0,9 3,9
7,8I 7,8 7,8 |
| 7601 Fusarium otvsporum . . . . . . . . . . 3,9 . 62,5
250,0: 250,0 250,0 |
| 808 Fusarium vasinfectum ......... 250,0 ! 250,0 250,0 250,0: |
| 8567 Saccharomyces fragilis . . . . . . . . . 31,2 250,0
250,0 250,0 |
| 0632 Kloeckera africana . . . . . . . . . . . . 15,6
125,0I 125,0 125,0 |
| 8170 Hansenula anomala . . . . . . ... . . .
0,9 15,6 ( 125,0 250,0 |
| 0212 Sporotrichum schenkii . . . . . . . . . 3,9 125,0 250,0
250,0 |
| M63 Candida albicans .............. 3,9I 7,8 31,2 31,2 |
| Sporotrichum schenkü ......... 250,0 250,0I 250,0 250,0 500,0
500,0 500,0 |
| Ashbya gossypii............... 0,9 0,9 0,9 0,9 1,9 3,9 3,9 |
| (K. W. = kein Wachstum während der Untersuchung.) |
| ATCC Name Minimale Inhibitionskozentration in [,zg:'ccm |
| Nr. Tage |
| i 2 I 3 4 I 5 I 6 7 I $ 9 |
| I |
| Trichosporum giganteum ....... 125,0 125,0 125,0 250,0 500,0
500,0 500,0 |
| Trichosporum cutaneum . . . . . . . . 7,8 125,0 125,0 250,0
500,0 500,0 500,0 j |
| Penicillium gladiolo . . . . . . . . . . . . 62,5 125,0 125,0
125,0 250,0 250,0 250,0 |
| Aspergillus clavatus ........... 15,6 62,5 125,0 250,0 250,0
250,0. 250,0 |
| Aspergillus clavatus ........... 0,9 62,5 125,0 250,0 250,0
250,0 500,0 |
| Aspergillus niger .............. 62,5 125,0 250,0 250,0 250,0
500,0 500,0 |
| Aspergillus parasiticus ......... 15,6 125,0 250,0 500,0 500,0
500,0 ` 500,0 |
| Streptomyces vinezuelae ....... 250,0 250,0 250,0 250,0 500,0
500,0 500,0 |
| Streptomyces lavendulae ....... 62,5 62,5 125,0 125,0 125,0
125,0 125,0 |
| Streptomyces antibioticus ...... 62,5 62,5 125,0 125,0 125,0
125,0 125,0 |
| Candida macedoniensis ......... 250,0 250,0 500,0 500,0 500,0
, 500,0 500,0 |
| Candida stellatoidea .. ... . . . ... 0,9 3,9 7,8 15,6 62,5
250,0 250,0i |
| Candida macedoniensis ......... 31,2 250,0 250,0 500,0 500,0
500,0 500,0 j |
| Alternaria porri ............... 1,9 7,8 7,8 15,6 31,2 31,2
250,0 |
| Alternaria radicina ............ 1,9 3,9 15,6 31,2 31,2 62,5
62,5 |
| Epidemophyton floccosium ..... 1,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 3,9 |
| Mucor parasiticus ............. 62,5 1 62,5 125,0 250,0 250,0
250,0 250,0 |
| Candida stellatoidea ........... 1,95: 3,9 3,9 7,81 |
| Candida krusei .... . ...... .. ... 1,95 62,5 250,0 250,0 , |
| Candida albicans.............. 3,9 7,81 7,81 15,62 |
| Streptomyces griseus........... 0,03 62,5 250,0 250,0 |
| Penicillium chrysoginum ....... 0,97 1,95 125,0 250,0 |
| Sporotrichum schenkii ......... 0,48 125,0 250,0 250,0 |
| M200 Hormodendrum pedrosoi ....... 125,0 250,0 250,0 250,0 |
| M240 Sporobolomyces salmonicolor ... 3,9 125,0 ' 250,0
250,0 |
| M260 Cryptococcus neoformans ....... 0,48 0,97
0,97 1,95 |
| M270 Allescheria boydii . . . . . . . . . . . . . 250
0 250,0 250 0 2500 ' |
| M50 Saccharomyces cerevisine ....... 1,95 250,0
250,0 1 250,0 |
Um Anhaltspunkte für die chemische Struktur des fungiziden Antibiotikums zu erhalten,
wurden folgende Identitätsteste durchgeführt: Identitätstest Resultat Ninhydrin
.............................. positiv Vanillin und HC1 .......................
positiv Molisch ................................ negativ Cuanibo (oxydiertes Nitroprussid)
. .. . . . . . . negativ Aromatische Nitro- oder Aminogruppen
... negativ
Es wird darauf hingewiesen, daB Variationen des beschriebenen Verfahrens durchaus
in den Rahmen der Erfindung fallen.