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Verfahren zur Erzeugung eines Wirkstoffs gegen Fungi auf biologischem
Wege Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen
Wirkstoffs gegen Fungi aus Stämmen von Mikroorganismen einer bisher noch nicht beschriebenen
Species des Genus Streptomyces. Dieser Wirkstoff ist als solcher sowie in Form seiner
Salze gegenüber einer großen Anzahl von Fungi wirksam.
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Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Wirkstoff stellt
in gereinigtem Zustand einen weißen kristallinen Stoff mit schwach amphoteren Eigenschaften
dar. Elementaranalysen gereinigter Proben dieses neuen Wirkstoffs haben folgende
Werte ergeben: Kohlenstoff 58ü/" Wasserstoff 7,50/" Stickstoff 2ü/, und Sauerstoff
(durch Differenz) 320/,. Die Verbindung weist ein verhältnismäßig niedriges Molekulargewicht
auf. Die aus den oben angegebenen analytischen Werten abgeleitete empirische Formel
entspricht nahezu der Formel C31-34H47-51013-14N, Eine gereinigte Probe der freien
Base des Wirkstoffs gegen Fungi zeigt eine spezifische Drehung von [
= ' 248' (0,50/, in Dimethylformamid).
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a]2,
Der Wirkstoff ist in Wasser bei Zimmertemperatur oder darunter
12 bis 24 Stunden bei neutralem pH-Wert verhältnismäßig stabil. In wäßrigen Säuren
und Alkalien und bei erhöhten Temperaturen ist er weniger stabil.
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Das Infrarötabsörptionsspektrum des Wirkstoffs ist in Fig.1 wiedergegeben.
Diese Kurve wurde mit einer Probe der gereinigten Base, die mit Kaliumbromidkristallen
vermischt und zu einer Scheibe verpreßt worden war, ermittelt.
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Das Ultraviolettabsorptionsspektrum ist in Fig.2 wiedergegeben. Die
Ultraviolettabsorptionskurve wurde mit einer gereinigten Probe der Verbindung in
Methanol in einer Konzentration von 5,8 y/ml erhalten. Die Kurve zeigt Maxima bei
220, 289, 302 und 317 m#L sowie eine Schulter bei 278 m#t. Die bei den Maxima für
die Extinktionskoeffizienten Ei'!. (spektrophotometrische Absorption einer
1°/oigen Lösung, gemessen in einer 1-cm-Zelle) gemessenen Werte wurden aus der Ultraviolettabsorptionskurve
unter Rückführung der Konzentration, bei welcher die Probe vermessen wurde, auf
1071 errechnet. Die den oben angegebenen Maxima entsprechenden Werte betragen 330,
760, 1200, 1120 bzw. 380.
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Das Röntgenstrahldiffraktionsdiagramm einer-gereinigten Probe der
Verbindung zeigt maximale Intensitäten bei Ebenenabständen von 14,5 Ä, 4,19 A und
4,06 Ä.
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Ein N-Acetylderivat der Verbindung wurde mikroskopisch untersucht,
wobei folgende Eigenschaften ermittelt wurden
| Kristallhäbitus .......... säulenartig |
| Refraktionsindices - |
| Ng = ................ 1,522 = 0,002 |
| Ny = ................ 1,543 --1- 0,002 |
| Optisches Vorzeichen .... positiv |
| Orientierung ............ .. optische Richtung X paral- |
| .. lel zur Längsrichtung, op- |
| ..tische Richtungen Y und Z |
| .- senkrecht zur Längsrich- |
| tung. |
Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Wirkstoff gegen Fungi ist in folgenden
Lösungsmitteln bei Zimmertemperatur in ungefähr dem angegebenen Grad, ausgedrückt
in mg/nil Lösungsmittel löslich:
| Lösungsmittel Löslichkeiten |
| in mg/ml |
| Chloroform .............. ' :.......... 0,1 |
| Benzol................................ 1,6 |
| Essigsäureäthylester ..................... 0,5 |
| Äther.....:........................... 0,0 |
| Petroläther ............................ 0,0 |
| 1,4-Dioxan ............................ 7 |
| 80°/oiges Dioxan (20°/o Wasser). ... .._.: .. 7 |
| Pyridin ............................... 70 ,- |
| Piperidin .............................. 190 |
| Methanol.............................. 6 |
| 80°/oiges Methanol (20 °/o Wasser) .......... 2 |
| Aceton ................................ 0,1 |
| 80°/@ges Aceton (200/, Wasser) .......... 0,4 |
| n-Butanol (trocken) ...... ........... 0,2 |
| n-Butanol (mit Wasser gesättigt) ......... 1,5 |
| Äthanol.............-.................. 1,2 |
| 80°/oiges Äthanol (200/, Wasser) ......... 0,7 |
| Wasser ................................ 0,1 |
Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Wirkstoff läßt
sich an einer Reihe von Adsorbentien, z. B. Aktivkohle, aktiviertem Magnesiumsilikat,
Aluminiumoxyd, Fullererde u. dgl., adsorbieren.
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Der Wirkstoff liegt sowohl in der Gärmaische als auch im Mycel vor
und läßt sich daraus in einfacher Weise durch geeignete Lösungsmittel extrahieren,
wie dies im folgenden näher ausgeführt werden soll.
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Der neue Wirkstoff zeichnet sich durch ein großes Wirkungsspektrum
gegenüber Fungi aus. Zur Bestimmung dieser Wirkung wurden geeignete Agarmedien,
die Reihenverdünnungen der Verbindungen enthielten, hergestellt. Die Medien wurden
mit einer großen Vielzahl von Fungi beimpft und 5 bis 7 Tage bei 26° C inkubiert.
Das Wachstum wurde dann mit dem Wachstum dieser Organismen auf Kontrollager, die
keinen Wirkstoff gegen Fungi enthielten, verglichen. Die minimalen Konzentrationen
des neuen Wirkstoffs, die eine vollständige Inhibierung des Wachstums des Testorganismus
erzielen ließen, werden unten wiedergegeben. Die Konzentrationen sind in mg/ml ausgedrückt.
| Minimale |
| Konzentration |
| Organismus zur Erzielung |
| vollständiger |
| Hemmung |
| Saccharomyces cerevisiae .............. 1 |
| Saccharomyces Carlsbergensis ........... 3 |
| Torula pulcherina...................... 3 |
| Candida flareri........................ 3 |
| Candida brumptii ..................... 10 |
| Candida albicans ...................... 10 |
| Trichophyton mentagrophytes........... 10 |
| Trichophyton tonsurans ................ 10 |
| Phialophora j eanselmei ................ 3 |
| Glomerella cingulata ................... 3 |
| Endothia parasitica ................... 1 |
| Ceratostomella uhni ................... 3 |
| Neurospora sitophila .................. 3 |
| Aspergillus clavatus ................... 3 |
| Aspergillusfumigatus .................. 3 |
| Aspergillus nidulans.................... 10 |
| Aspergilius versicolor................... 3 |
| Penicillum frequentans ................ 3 |
| Penicillum expansum .................. 3 |
| Minimale |
| Konzentration |
| Organismus zur Erzielung |
| vollständiger |
| Hemmung |
| Penicillum digitatum .................. 1 |
| Penicillum purpurogenum .............. 10 |
| Absidia glauca ........................ 10 |
| Absidia corymbifora ................... 3 |
| Cunninghamella echinulata ............. 3 |
| Mucor abundans ...................... 3 |
| Rhizopus nigricans..................... 3 |
| Polyporus cinnabarinus................. 1 |
| Ustilago olivacea ...................... 1 |
| Hormiscium gelatinosum ............... 3 |
| Myrothecium verrucaria ............... 10 |
| Helminthosporium carbonum ........... 3 |
| Alternaria solani....................... 1 |
| Hormodendrum cladosporioides ......... 3 |
Der neue Wirkstoff wird von einer Streptomyces-Species erzeugt, der die Nr. A 5283
zugeteilt wurde. Diese Species wurde offenbar bisher noch nicht beschrieben. Der
Stamm Streptomyces A 5283, der auch als Str. gilvosporeus bezeichnet wird, wurde
unter Nr. ATCC 13 326 bei der American Type Culture Collection in Washington, D.
C., hinterlegt. Eine allgemeine Beschreibung der neuen Species soll im folgenden
wiedergegeben werden.
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Die mit großen Anfangsbuchstaben bezeichneten Farben sind die Farben
nach Ridgeway.
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Luftmycel: auf zahlreichen Medien reichlich; bräunlich mit einem charakteristischen
weinfarbenen Ton (nahezu Light Brownish Drab, Hell-Bräunlich-Grau).
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Vegetatives Mycel: Weißlich bis Light Buff, Hellederfarben- bis Cream
Color, Cremefarben. Unterseitenfärbung: Weißlich bis Gelb (Light Buff, Hellederfarben-
bis Cream Color, Cremefarben). Lösliches Pigment: keines.
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Morphologie: wiederholt verzweigte Lufthyphen in nahezu dichotomer
Weise; Endfäden offen spiralförmig mit nahezu runden Sporen von 0,6 #t Durchmesser
in Ketten. In voll ausgereiften Sporophoren, wo die Sporen in dichten Massen auftreten,
ist der spiralartige Charakter verdeckt.
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Die Wachstumseigenschaften auf den üblichen Agarmedien sind in den
folgenden Tabellen beschrieben:
| Tabelle 1 |
| Wachstumseigenschaften von Streptomyces sp. A 5283 nach 17tägiger
Inkubation in Petrischalen bei 28° C |
| Medium Wams Lüftmycel' Unterseite p gment Bemerkungen |
| Asparagin-Dextrose- gut bräunlich, reichlich hellgelb fast
Cream keines starke Sporenbildung |
| Agat (fast Pallid Brownish Color, Cremefarben) |
| Drab, Blaß-Bräunlich- |
| Grau), weißer Rand |
| saurer Asparagin- gut bräunlich, reichlich gelb (Cream Color
bis keines desgl. |
| Dextrose-Agar (fast Light Brownish Naples Yellow, Creme- |
| Drab), weißer Rand farben bis Neapel- |
| Hell-Bräunlich-Grau Gelb) |
| Czapek-Dox-Agar mäßig keines (Cream Color, Creme- keines vegetatives
Mycel, |
| farben) Cream Color Creme- |
| farben, glatt |
| Waksmans Stärke- gut bräunlich, reichlich weißlich bis gelb
keines Hydrolyse positiv, |
| Agar (fast Light Brownish (Cream Color, Creme- Klärung .des
Agars |
| Drab, Hell-Bräunlich- farben) |
| Grau) |
Wachstumseigenschaften von Streptomyces sp. A 5283 nach 17tägiger
Inkubation in Petrischalen bei 28° C
| Wachs lösliches |
| Medium tum Luftmycel Unterseite |
| Pigment . Bemerkungen |
| Kartoffel-Dextrose- gut bräunlich, reichlich gelb. (Cream Color,
keines starke Sporenbildung |
| Agar (fast Light Brownish Cremefarben) |
| Drab, Hell-Bräunlich- |
| Grau) |
| Sabourauds gut graubraun, (fast Light braun (Warm Buff bis
keines gute Sporenbildung |
| Maltose-Agar Drab, Hell-Grau) bis Sudan Brown warmes p |
| weißlich Lederfarben bis Sudan- |
| Braun) |
| Maisquellwasser- gut bräunlich, reichlich gelb (Cream Color,
keines starke Sporenbildung |
| Agar (fast Light Brownish Crernpfarben) |
| Drab, Hell-BräunUch- |
| Grau), weißer Rand |
| Calciummalat-Agar ziemlich weißlich, spärlich hell gelblich
(Light keines nicht geklärt |
| gut Buff, Hell-Lederfarben) |
| Bennett-Agar gut bräunlich, reichlich gelb (Cream Color bis
keines starke Sporenbildung |
| (Pale Brownish Drab Cream Buff, Creme- |
| bis Light Brownish farben bis Creme- |
| Drab, Blaß-Bräunlich- Lederfarben) |
| Grau bis Hell-Bräun- |
| lich-Grau) |
| Glucose-Agar mäßig keines Gelbbraun (fast Ochra- . keines vegetatives
Mycel |
| ceous-Buff, Ocker- weißlichgelb, glatt |
| artig-Lederfarben) (Light Buff, Hell |
| Lederfarben) |
| Nähragar ziemlich keines gelb (fast Light Buff, keines verstreute
weißliche |
| gut Hell-Lederfarben) IKolonien |
| Emerson-Agar mäßig weißlich, spärlich gelbbraun (fast Warm
keines vegetatives Mycel |
| Buff, Warm-Leder- weißlichgelb (Light |
| farben) Buff, Hell-Lederfarben) |
| Krainshy's mäßig weißlich, spärlich weiß bis gelb (Colonial
keines vegetatives Mycel |
| Dextrose-Agar Buff, Kolonial-Leder- weißlich |
| farben) |
| Tabelle II |
| Wachstumseigenschaften von Streptomyces sp. A 5283 nach 14tägiger
Inkubation bei 28° C |
| Wachs. |
| Medium tum Luftmycel vegetatives ycel lösliches Pigment Sonstiges |
| Dextrose-Nitrat- ziemlich keines weißlich keines - Nitrat reduziert |
| Brühe gut |
| Gelatine mäßig keines weißlich keines vollständige Verflüssigung |
| Lackmusmilch mäßig keines .,. , weißlichgelb keines rasche
Peptonisation |
| Kartoffelschnitzel mäßig weiß, spärlich weißlichgelb bis hell-
keines schwachrosa an den |
| braun (fast Buff-Pink, Spitzen der Schnitzel |
| Lederfarben-Rosa) |
| Karottenschnitzel mäßig weiß -- - - - |
| Tabelle III |
| Beschreibung von Streptomyces sp. A 5283 nach 16tägiger Inkubation
bei verschiedenen Temperaturen |
| Wachs- |
| Temperatur tum Lnitmycei vegetatives Myce1 |
| Pigment Vermerkengen |
| l' |
| - |
| 24° C gut : reichlich weißlich - keines |
| 28° C gut reichlich weißlich - keines - |
| 32° C mäßig mäßig weißlich - keines - |
| 37° C mäßig gering weißlich - keines - |
Selbstverständlich sind Abweichungen der in den vorstehenden drei
Tabellen wiedergegebenen Eigenschaften von der Art, wie sie erfahrungsgemäß beim
Arbeiten mit Fungi auftreten, bei verschiedenen Stämmen dieser neuen Species und
in Abhängigkeit anderer Umweltsbedingungen möglich.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung eines neuen Wirkstoffs
gegen Fungi wird ein wäßriges Nährmedium mittels eines Mikroorganismus der Species
Streptomyces A 5283 fermentiert.
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Das verwendete Nährmedium enthält Quellen für Kohlenstoff, z. B. Stärke,
hydrolysierte Stärke, Zucker, wie Lactose, Maltose, Dextrose, Saccharose, oder Zuckerquellen,
wie Melasse, Alkohole, wie Glycerin und Mannit, organische Säuren, wie Zitronensäure
und Essigsäure, und verschiedene Naturprodukte, die außer kohlenstoffhaltigen Substanzen
andere Nährstoffe enthalten können. Zu den verwendbaren Stickstoffquellen gehören
Proteine, z. B. Casein, Zein, Lactalbumin, Proteinhydrolysate, z. B. Proteosen,
Peptone, Peptide und im Handel erhältliche Stoffe, z. B. N-Z-Amin, das bekanntlich
ein Caseinhydrolysat ist, ferner Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Gluten, Baumwollsamenmehl,
Fischmehl, Fleischextrakte, Schlachtflüssigkeiten, Leberpräparate, Hefeextrakte,
Distillers' Solubles u. dgl., Aminosäuren, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate usw.
Das Nährmedium enthält ferner anorganische Bestandteile, wie Natrium, Kalium, Calcium,
Magnesium u. dgl: sowie Chloride, Sulfate, Phosphate, und Kombinationen dieser Anionen
und Kationen in Form von Mineralsalzen können bei der Gärung mit Vorteil verwendet
werden. Die sogenannten Spurenelemente, wie Bor, Kobalt, Eisen, Kupfer, Zink, Mangan,
Chrom, Molybdän und ähnliche können ebenfalls mit Vorteil verwendet werden. Gewöhnlich
liegen diese Spurenelemente in ausreichenden Mengen in den kohlenstoffhaltigen und
stickstoffhaltigen Bestandteilen des Mediums vor, insbesondere wenn diese aus natürlichen
Quellen stammen, oder sie sind im Leitungswasser vorhanden, weshalb der Zusatz weiterer
Mengen dieser Spurenelemente überflüssig sein kann.
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Die Fermentationsflüssigkeit wird mittels steriler Druckluft, gewöhnlich
mit einer Geschwindigkeit von 1 Volumen Luft pro Volumen Gärmedium und Minute belüftet.
Um die Verunreinigung mit Fremdmikroorganismen auf ein Minimum herabzusetzen, ist
es zweckmäßig, die Fermentationsgefäße zu -verschließen -und einen Druck von 0,14
bis 1,05 atü darin aufrechtzuerhalten. Außer der durch die Belüftung hervorgerufenen
Bewegung ist eine mechanische Rührung oder Bewegung im allgemeinen zweckmäßig. Entschäumungsmittel,
z. B. 1 °/o Octadecanol in Schmalzöl, können je nach den Erfordernissen zur Verhütung
eines übermäßigen Schäumens von Zeit zu Zeit zugesetzt werden.
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Die Gärung wird bei einer Temperatur von vorzugsweise 26 bis 30° C
geführt; die Temperatur kann jedoch bis herab zu 17° C oder bis hinauf zu 42° C
betragen.
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Die für eine maximale Erzeugung des neuen Wirkstoffs erforderliche
Zeit hängt beträchtlich von den anderen Gärbedingungen ab. Gewöhnlich sind etwa
48 Stunden erforderlich, bis merkliche Mengen des Wirkstoffs in dem Medium nachweisbar
sind. Die Erzeugung des Wirkstoffs nimmt mit der Zeit zu, und die Gärung kann bis
zu 120 Stunden fortgeführt werden. Die Wasserstoffionenkonzentrationen variieren
gewöhnlich entsprechend pH-Werten von etwa: 6 bis 8,- doch sind Abweichungen von
diesen Werten zulässig.
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Reinigungsmethode Nach der-Gärung und dem Abfiltrieren der rohen Maische
läßt-sich der Wirkstoff, in variierenden Mengen sowohl im Mycel als auch in dem
Maischenfiltrat nachweisen.
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Bei einer bevorzugten Arbeitsweise zur Isolierung des rohen Wirkstoffs
wird der pH-Wert auf 7 eingestellt und das Gemisch nach Zusatz von Diatomeenerde
filtriert. Die Festsubstanzen werden mit etwa 1/1o Volumen Wasser gewaschen und
dann, wie im folgenden beschrieben, behandelt.
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Das Waschwasser wird mit dem Filtrat vereinigt und der p11-Wert der
erhaltenen wäßrigen Lösung auf 7 eingestellt. Die Aktivität wird dann aus dieser
Lösung an Magnesol adsorbiert, das ein synthetisches hydratisiertes Magnesiumsilikat
der ungefähren Zusammensetzung Mg 0 - 2,5 Si 02 - HZ 0 ist, und die Aktivität wird
daraus zunächst mit Methanol und dann mit einer Lösung aus 70 °/o Methanol und 30
°/o Wasser eluiert. Die beiden Eluate werden vereinigt, und die erhaltene Lösung
wird unter vermindertem Druck auf etwa 1/5o bis 1/3o des Volumens der ursprünglichen
Maische eingeengt. Das Konzentrat wird bis zur vollständigen Kristallisation bei
3 bis 5° C gehalten, dann werden die rohen Kristalle filtriert, mit Wasser und Aceton
gewaschen und schließlich getrocknet.
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Die gewaschenen Festsubstanzen einschließlich des Mycels werden etwa
15 Minuten lang in einem Methanolvolumen aufgeschlämmt, das etwa ein Fünftel von
demjenigen der Ausgangsmaische beträgt. Die nach dem Filtrieren des Gemisches zurückbleibenden
Festsubstanzen werden, wie oben beschrieben und mit etwa dem gleichen Methanolvolumen,
extrahiert, undbeide Methanolextrakte werden vereinigt. Die erhaltene Methanollösung
wird unter vermindertem Druck auf 1/5o bis 1/3o des Volumens der ursprünglichen
Maischen konzentriert. Das Konzentrat wird bis zur vollständigen Kristallisation
bei 3 bis 5° C gehalten, dann werden die rohen Kristalle filtriert, mit kaltem Wasser
und Aceton gewaschen und getrocknet.
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Aus dem Vorstehenden wird ersichtlich, daß bei jeder Fermentation
zwei Ausbeuten an rohem kristallinem Produkt erhalten werden, und zwar die eine
aus dem Filtrat und die andere aus dem Mycel.
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Die rohen Kristalle werden durch Auflösen in Eisessig, Abfiltrieren
und Einstellen des pH-Werts mit wäßrigem Ammoniak auf 4 umkristallisiert. Die erhaltenen
feinen Kristalle können nur unter Schwierigkeiten filtriert werden, weshalb sie
gewöhnlich durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser, Aceton und Äther gewaschen
und dann getrocknet werden. Das Umkristallisieren kann selbstverständlich zur Erzielung
analytisch reiner Proben wiederholt werden.
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Man kann die Verbindung aber auch durch Auflösen in der kleinstmöglichen
Menge Essigsäure, Abfiltrieren und Eingießen des Filtrats in 10 Volumina Wasser
umkristallisieren. Bei der Abscheidung bildet das Produkt ein Gel, das bis zur Kristallisation
gerührt und dann abfiltriert, gewaschen und getrocknet wird.
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An Stelle des synthetischen hydratisierten Magnesiumsilikats kann
man bei der Gewinnung des Wirkstoffs aus den Maischenfiltraten als Adsorbens auch
Fullererde und aktivierte Tierkohle (Darco G60) verwenden.
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Außer Methanol können auch andere mit Wasser mischbare polare Lösungsmittel,
z. B. Äthanol, Butanol, Propanol, mit Butanol gesättigtes Wasser, mit Wasser gesättigtes
Butanol, saures Aceton, Dimethylformamid, Pyridin, - Methyläthylketon, Essigsäureäthylester
und ähnliche Lösungsmittel dieser Art, als Mittel zum Eluieren oder als Lösungsmittel
für die Extraktion der Aktivität aus dem Mycel verwendet werden.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel
1 Ein für eine Gärung im technischen Maßstab geeigneter Impfstoff wird folgendermaßen
gewonnen: Das Oberflächenwachstum eines Reagenzglasschrägagars der Kultur wird in
5 bis 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension von Sporen und
Mycelteilen wird zum Beimpfen von 100-ml-Anteilen sterilen Mediums in 500-ml-Erlenmeyerkolben
verwendet. Die beiden Kolben werden nach dem Beimpfen etwa 2 Tage bei etwa 28°C
auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bebrütet, wonach die 200
ml Primärinokulum zum Beimpfen von 61 sterilem Medium in einer 9-1-Glasflasche verwendet
werden, das seinerseits unter Belüftung gewöhnlich während etwa eines Tages bei
etwa 28°C bebrütet wird. Die 61 ausmachende Flaschenkultur wird dann zum Beimpfen
von 100 bis 2001 oder mehr sterilem Medium in einem Gärtank verwendet. Für größere
Ansätze von etwa 5001 und darüber werden größere Impfstoffmengen durch Vereinigen
von zwei oder mehr 6-1-Flaschen des Impfstoffs bereitet.
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Ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung Gewichtsprozent
Dextrose ............................. 1 Fleischextrakt .......................
0,2 Hefeextrakt ......................... 0,2 Asparagin ...........................
0,05 KZ H P 04
............................ 0,05 wurde mit Leitungswasser
aufgefüllt und 30 bis 45 Minuten mit Dampf von etwa 1 Atm. Druck bei
120'C
sterilisiert.
Der pH-Wert vor der Sterilisation betrug 7,12 und nach der Sterilisation 6,87. 2001
des sterilen Mediums wurden in einem Fermentationsgefäß von etwa 3801 Fassungsvermögen
mit 61 der oben beschriebenen, 291/Z Stunden alten Flaschenkultur beimpft und 471/Z
Stunden bei 27 bis 29'C fermentiert. Während der Gärung wurden 9 Volumen sterile
Luft je Volumen Medium in der Minute durch die Gärflüssigkeit gepreßt, und die Rührung
wurde durch einen mechanischen Rührer bewirkt. Eine Lösung von 10/, Octadecanol
in Schmalzöl wurde je nach Bedarf zur Eindämmung des Schäumens zugesetzt. Die bei
der Prüfung erhaltenen Ergebnisse sind im folgenden wiedergegeben:
| Gärzeit Zonengröße in mm, Prüfung mit |
| in Stunden p$ Hormodendrum Saccharomyces |
| cladosporoides cerevisiae |
| 0 (vor der 7,12 |
| Sterilisation) |
| 0 (nach der 6,87 |
| Sterilisation) |
| 251/Z 4,88 30,4 23,0 |
| 471/2 6,56 30,8 24,0 |
Beispiele 2 bis 10 Es wurde praktisch unter den gleichen Bedingungen, mit den gleichen
Mengen und dem gleichen Medium usw., wie im Beispiel 1 beschrieben, gearbeitet.
Bei jedem der im folgenden beschriebenen neun Versuche wurden 2001 sterilen Mediums
mit 61 einer etwa 1 Tag alten Flaschenkultur beimpft und,wie imBeispiel1 beschrieben,
bei 27 bis 29°C fermentiert. Die Ergebnisse sind im folgenden wiedergegeben.
| Zonengröße in mm, Zonengröße in mm, |
| p. nach der Prüfung mit Prüfung mit |
| Beispiel p. vor der pu nach der angegebenen Hormodendrum .
Saccharomyces- Gärzeit |
| Nr. Sterilisation Sterilisation Gärzeit. cladosporides cerevisiae
in Stunden |
| in Stunden nach der angegebenen nach der angegebenen |
| Gärzeit in- Stunden . Gärzeit in Stunden |
| 2 7,12 6,87 4,88 30,4 23,0 251/2 |
| 6,56 30-,9 24,0 471/Z |
| 3 7,12. 6,82 4,98 30,8 27,7 231/2 |
| 6,53 27,1 24,0- 411/2- |
| 4 7,11 6;89 4,98 33,0 24,0 241-/Z |
| 6,58 29,5-, 21,9 411/2 |
| 5 7,04 6,86 4,94 31,5 25,7 24 |
| 5,61 27,9 24,0 41 |
| 6 7,10 6,.92 4,90- 26,7 20,3 25 |
| 5,10 24,8 20,3.- 42 |
| 7 7,00 6,83 6,80 14,5 15,7 - 24 |
| 5,92 27,0 24,6 48.- |
| 8 7,02 6-,89 5,57 26;9 23,8 24 |
| 6,72 27,9 23,8 41 |
| 9. 7,02 6182 5,38 29,4 25,2 23:1/,- |
| 6,30 27,3 22,6 401/2 |
| 10 7,00 6,81 6,42 27,8 24,5 24 |
| 5,02 26,9 24,0 41 |
Beispiel 11 Ein Gärmedium der folgenden Zusammensetzung Gewichtsprozent Maisstärke
3 Maisquellwasser.........-..,....-.......-.. 2 NaCl
........ ...........
0,5 Ca C O3
................................ 0:,35 Gewichtsprozent K,HP04
........................... 0,1 Bernsteinsäure -....................... 0,005 Fe
S04 - 7H20
...................... 0,001 wurde mit Leitungswasser aufgefüllt
und bei
120'C
30 bis 45 Minuten- mit Dampf von etwa 1 Atm. Druck sterilisiert.
Nach
der Beimpfung wurde die Gärung, wie im Beispiel e beschrieben, geführt. Dabei wurden
folgende Ergebnisse erzielt:
| Fermentationszeit Zonengröße in mm, Prüfung mit |
| in Stunden PH |
| Hormodendrum I Saccharomyces |
| 0 (vor der 5,85 |
| Sterilisation) |
| 0 (nach der 6,18 |
| Sterilisation) |
| 231/Z 6,05 36 25,5 |
| 471/2 7,01 37,3 26,8 |
| 631/Z 7,00 38,3 26,8 |
Beispiel 12 Die rohe Maische, die aus einer der wie oben beschriebenen vergorenen
Flüssigkeiten erhalten wurde und 2o insgesamt 2201 ausmachte, wurde auf pH 7,0 eingestellt
und mit Diatomeenerde versetzt. Das Gemisch wurde filtriert und der Filterkuchen
mit 301 Wasser gewaschen. Waschwasser und Filtrat wurden vereinigt. Der pg-Wert
dieser Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung 25 mit 800 g hydratisiertem
Magnesiumsilicat versetzt. Die Suspension wurde 1/z Stunde gerührt und filtriert,
und die Festsubstanzen wurden gewaschen. Der Magnesiumsilicatkuchen wurde in 81
Methanol 20 Minuten aufgeschlämmt und erneut abfiltriert. Die hinterbleibenden 3o
festen Substanzen wurden 20 Minuten in 81 70°/oigem wäßrigem Methanol aufgeschlämmt
und wieder filtriert. Die beiden Eluate wurden zu einer 14,51 ausmachenden Lösung
vereinigt, die unter vermindertem Druck auf 2,71 eingeengt wurde. Das Konzentrat
wurde 1 Tag bei 35 3 bis 5'C gehalten, und die erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert,
gewaschen und getrocknet. Beispiel 13 Der bei der im vorhergehenden Beispiel beschriebenen
Arbeitsweise erhaltene gewaschene Filterkuchen wurde in 301 Methanol suspendiert
und 15 Minuten gerührt. Nach dem Abfiltrieren des Gemischs wurde der zurückbleibende
Kuchen erneut in 301 Methanol suspendiert und 15 Minuten gerührt und wieder abfiltriert.
Die beiden Methanolfiltrate wurden zu 551 einer methanolischen Lösung vereinigt,
die unter vermindertem Druck auf 3,51 eingeengt wurde. Das Konzentrat wurde bis
zur Vervollständigung der Kristallisation bei 3 bis 5'C gehalten, und die Kristalle
wurden filtriert, gewaschen und getrocknet. Beispiel 14 10g des gemäß Beispiel 12
erhaltenen Produkts wurden in 80 ml Eisessig bei Zimmertemperatur gelöst, und die
Lösung wurde durch ein Glassinterfilter -filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wurde
mit 5 n-wäßrigem Ammoniak auf 4 eingestellt, und die gebildeten, sehr feinen Kristalle
wurden abzentrifugiert, mit Wasser, Aceton und schließlich Äther gewaschen und im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 6,8 g. 6,5 g des Produkts wurden langsam
durch Rühren in 13 ml Eisessig bei Zimmertemperatur gelöst. Nach Abfiltrieren der
Lösung wurde das Filtrat in 130 ml Wasser eingegossen. Der erhaltene Niederschlag
bildete ein Gel, das so lange gerührt wurde, bis die Festsubstanz kristallin war.
Das Gemisch wurde bei 3 bis 5'C über Nacht stehengelassen und zentrifugiert. Die
kristalline Festsubstanz wurde mit Wasser, Aceton und Äther gewaschen und dann im
Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug 5,37 g. 5,07 g dieses Produkts wurden langsam
unter Rühren in 10 ml Eisessig gelöst, abfiltriert, umkristallisiert, gesammelt
und getrocknet, wonach die Ausbeute 3,45 g betrug.
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Beispiel 15 Die rohen Kristalle, wie sie aus dem gemäß Beispiel 12
erhaltenen Filtrat anfielen, wurden vereinigt und mit 200 ml entmineralisiertem
Wasser gewaschen. Die gewaschenen Festsubstanzen wurden in Wasser suspendiert und
lyophilisiert. Man erhielt 48,4 g. Beispiel 16 Die aus dem im Beispie113 beschriebenen
Mycelkuchen erhaltenen rohen Kristalle wurden vereinigt und mit 500 ml Wasser gewaschen.
Die gewaschenen Kristalle wurden in 500 ml Aceton aufgeschlämmt, und das Gemisch
wurde filtriert. Die Festsubstanzen wurden dann im Vakuum getrocknet und ergaben
28,6 g. Beispiel 17 435 mg des, wie im Beispiel 14 beschrieben, erhaltenen Produkts
wurden in 9 ml Eisessig bei Zimmertemperatur gelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung
eines Glassinterfilters filtriert, und das Filtrat wurde tropfenweise unter Rühren
mit 0,1 n-wäßriger Schwefelsäure versetzt, bis keine weitere Kristallisation mehr
erfolgte. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang kaltgestellt, wonach die Kristalle abzentrifugiert,
mit Wasser, Aceton und Äther gewaschen und getrocknet wurden. Die Ausbeute betrug
269 mg an kristallinem Sulfat. Beispiel 18 Die, wie im Beispiel l beschrieben, hergestellte
rohe Maische wurde mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert, und das Filtrat wurde
zweimal mit jeweils 1/4 Volumen an n-Butanol extrahiert. Die beiden Extrakte wurden
vereinigt und die erhaltene Lösung unter vermindertem Druck auf 21 eingeengt. Die
sich abscheidenden rohen Festsubstanzen wurden abfiltriert, gewaschen und getrocknet.
Diese Substanz enthielt etwa 75 °/e der Aktivität der Ausgangsmaische.
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An Stelle von n-Butanol kann man in gleicher Weise und mit gleichem
Erfolg andere mit Wasser nicht mischbare polare Lösungsmittel, z. B. Amylalkohol,
Äthylmethylketon u. dgl., verwenden. Beispiel 19 Die, wie im Beispiel 1 beschrieben,
mittels der Kultur A 5283 gebildete fungizide bzw. fungistatische Verbindung (100
mg) wurde in 2 ml Äthanol suspendiert und die Suspension mit einer gesättigten Lösung
von Pikrinsäure in Äthanol versetzt, bis eine klare Lösung entstand. Diese Lösung
wurde zum Sieden erhitzt und abgekühlt, worauf eine gelbe Festsubstanz ausfiel,
die abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Man erhielt
50 mg des Pikrats des Wirkstoffs, das etwa folgende Analysenwerte lieferte: C =
50,9 °/o; H = 6,0 °/o; N = 5,9 %. Beispiel 20 Die nach der im Beispiel 12 beschriebenen
Arbeitsweise aus der Kultur A 5283 isolierte fungizide bzw. fungistatische Verbindung
(300 mg) wurde in 10 ml Methanol suspendiert und mit 0,90 ml 0,5 n-methanolischer
Kalilauge unter Rühren versetzt. Das Antibiotikum lieferte eine gelbe Lösung, die
mit Entfärbungskohle behandelt und abfiltriert wurde. Aus dem Filtrat schied sich
beim Stehen und Reiben mit einem Glasstab ein schwerer Niederschlag aus farblosen
Mikrokristallen ab. Nach dem Abfiltrieren, Waschen mit Methanol und
Trocknen
im Vakuum erhielt man 200 mg des Monokaliumsalzes mit etwa folgenden Analysenwerten:
C = 55,0 °/0 H = 6,9 0/,; N = 2,0 0/,; K = 5,5 °/o. Beispiel 21 1
1 der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Gärmaische wurde auf pH 7,0 eingestellt und mit
250 ml n-Butanol unter Rühren während i/2 Stunde extrahiert. Die Schichten wurden
getrennt. Der wäßrige Rückstand wurde ein zweites Mal mit 250 ml n-Butanol extrahiert,
und die Schichten wurden erneut getrennt. Die Butanolextrakte wurden vereinigt und
im Vakuum konzentriert. Der Extrakt wurde bei 4° C gehalten, bis die Aktivität vollständig
ausgefällt war.
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Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildete Wirkstoff gegen
Fungi ist nicht zu verwechseln mit den von Streptomyces erzeugten, als Chromin und
Rimocidin bekannten fungiziden bzw. fungistatischen Substanzen. Die physikalischen
und chemischen Eigenschaften von Chromin sind von Wakaki und Mitarb. in Journal
of Antibiotics 6 (5), S.247 bis 250 (1953), beschrieben. Rimocidin ist ein fungizides
bzw. fungistatisches Antibiotikum, das von Davisson und Mitarb. aus dem Mycel von
Streptomyces rimosus isoliert und von ihnen in Antibiotics und Chemotherapie, Bd.
1, S. 289 (1951), beschrieben wurde. Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildete
Wirkstoff gegen Fungi läßt sich leicht von den erwähnten Wirkstoffen auf Grund seiner
physikalischen und chemischen Eigenschaften und insbesondere durch die Papierstreifenchromatographie
unterscheiden. Bei der Papierstreifenchromatographie unter Verwendung der oberen
Phase eines Gemischs aus 100 Teilen Triäthylamin, 30 Teilen Formamid und 100 Teilen
Wasser als Lösungsmittelsystem und einer etwa 17- bis 19stündigen Entwicklung der
Streifen zeigt der neue Wirkstoff eine Wanderungsgeschwindigkeit, die etwa ein Drittel
von derjenigen des Chromins, ein Drittel von derjenigen der langsamer wandernden
Komponente des Rimocidins und ein Neuntel von derjenigen der schneller wandernden
Komponente des Rimocidins beträgt. Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene
neue Wirkstoff ist, verglichen mit diesen anderen Wirkstoffen, gegen Fungi in dem
System praktisch unbeweglich, wodurch er sich leicht von den bereits beschriebenen
Wirkstoffsubstanzen unterscheiden läßt.