DE1793766B2

DE1793766B2 - Antibiotikum A 3823

Info

Publication number: DE1793766B2
Application number: DE19651793766
Authority: DE
Inventors: Michael Edward Haney Jun.; Marvin Martin Hoehn; James Myrlin Mcguire
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1964-09-28
Filing date: 1965-09-28
Publication date: 1978-03-02
Also published as: FR1588155A; NL139557B; DK115244B; CH457720A; GB1127224A; NL6512545A; DE1467883A1; BE670210A; BR6573551D0; DE1793766C3; ES317908A1; DE1793766A1; DE1467883C3; DE1467883B2

Description

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Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch angegebene Antibiotikum A 3823.

Die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe von pK'_a = 6,65 steht in Übereinstimmung mit einer einzigen Carboxylgruppe.

Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A 3823 in Chloroformlösung bei 0,1 mm Schichtdicke ist in der F i g. 1 dargestellt. Dieses deutet auf folgendes hin: Die bei 2,73, 2,98 und 3,05 Mikron auftretenden Maxima bzw. Schultern der Absorption sind Hydroxylgruppen und einer Carboxylgruppe zuzuschreiben. Die Bande bei 5,86 Mikron ist einer Carboxylgruppe zuzuschreiben. Die multiplen Banden in der Gegend zwischen etwa 8 und etwa 10 Mikron stimmen mit einer Absorption für mehrfache CO-Bindungen überein. In diesem Bereich des Spektrums zeigen sich Ätherabsorption und Absorption durch Hydroxylgruppen.

Das Antibiotikum A 3823 unterliegt einer raschen Veränderung in saurer Lösung unter Aktivitätsverlust. In basischer Lösung dagegen ist das Antibiotikum merklich beständig. So unterliegt beispielsweise eine Probe des Antibiotikums, das man bei einem pH-Wert von 11 60 Stunden unter Rückfluß erhitzt, keiner sichtbaren Änderung, abgesehen von der Bildung des Salzes der Säure. Wenn man das Antibiotikum als trockenes, kristallines Material lagert, so bleibt A 3823 lange Zeit beständig.

Auch das Kernmagnetresonanzspektrum zeigt, daß das Molekül eine Carboxylgruppe, 3 bis 4 Hydroxylgruppen und eine Ätherbindung aufweist. Der Rest des Moleküls scheint aus Methylen- und Methyl-Gruppierungen zu bestehen.

Ein Röntgenpulverdiagramm des Antibiotikums unter Verwendung einer Cr-Strahlung mit einem Vanadiumfilter zur Berechnung der Schichtlinienabstände ergibt folgende Werte:

l/h

13,01
11,88
9,70
9,39
8,68
8,20
7,93
7,50
7,21
7,01
6,39
5,47
5,36
5,19
4,93
4,65
4,47
4,26
3,97
3,77
3,58
3,53
3,44
3,32
3,17

0,05 0,10 0,80 0,90 0,50 0,20 0,20 0,20 0,80 1,00 0,90 0,90 0,05 0,70 0,60 0,50 0,10 0,60 0,10 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

Das neue Antibiotikum ist als Zusatz zu Tierfutter geeignet.

Die berechnete empirische Formel von A 3823 ist Ci6H66Oi2. Jedoch läßt das Verhalten der Verbindung unter scharfen Trocknungsbedingungen vermuten, daß das Antibiotikum mit einem Mol Kristallwasser kristallisiert und die empirische Formel des Antibiotikums C36H64O11 lautet.

Qualitative Versuche mit der Verbindung A 3823 lassen vermuten, daß keine reduzierten oder Aminozukker vorhanden sind. Die Steroid- und Gluconsäureteste sind ebenfalls negativ.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum A 3823 besitzt eine Hemmwirkung des Wachstums von Bakterien und Pilzen, welche pathogen gegenüber dem tierischen und

b5 pflanzlichen Leben sind. Die Hemmkonzentrationen für eine Anzahl von Organismen, bestimmt durch die Agar-Reihenverdünnungsmethode, sind in der nachfolgenden Tabelle I gezeigt.

Tabelle 1

Testorganismus

Mindesthemmkonzentration (y/ml)

Stunden 48 Stunden 72 Stunden

Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Myeobacterium avium
Streptococcus faecalis
Lactobacillus casei
Leuconostoc citrovorum
Proteus sp. No. 1
Vibrio metschnikovii
Alternaria solani
Botrytis cinerea
Colletotrichum pisi
Glomerella cingulate
Helminthosporium sativum
Polyporus osteatus
Penicillium expansum
Pullularia sp.
Sclerotinia fructicola
Verticillium albo-atrum
Spicaria divaricata

Eine andere wichtige Eigenschaft von A 3823 ist seine Fähigkeit, die Entwicklung der Coccidiose bei Geflügel zu verhindern. So verhindert beispielsweise A 3823, das im Futter von jungen Hühnern vorhanden ist, in Mengen von nur 0,02% sehr wirksam die Mortalität und

<0,78	<0,78	6,25
1,56	1,56	3,13
_	<0,78	12,5
3,13	12,5	100
<0,78	<0,78	50
<O,78	3,13	25
50	> 100	12,5
50	50	1,56
		3,13
		100
		100

vermindert bei Hühnern die Zahl der Schäden, welche durch verschiedene Arten von Coccidien hervorgerufen werden. Die Ergebnisse, die bei vier Species beobachtet worden sind, werder in derTabelle Il gezeigt.

Tabelle II

Antibiotische Aktivität des Antibiotikums A 3823 gegenüber vier Coccidienarten

Infizierender Organismus	Antibiotikum	Anzahl der	Mortalität	Gewichts
	gehalt im Futter	Hühner		zunahme
	(Gew.-%)		(%)	(E)
Eimeria tenella	0,02	19	0	1778
	Kontrolle	50	36	133
Eimeria necatrix	0,02	30	0	4128
	Kontrolle	50	48	-98
Eimeria maxima	0,02	50	0	8500
	Kontrolle	50	0	7100
Eimeria Brunetti	0,02	20	0	1498
	Kontrolle	20	0	935

Die akute Toxizität des Antibiotikums A 3823 bei Mäusen, ausgedrückt als LD50, beträgt etwa 43,8 ± 5,2 mg/kg Körpergewicht, wenn man das Antibiotikum oral gibt. Intraperitoneal beträgt die LD50 etwa 16,8 ± 1,7 mg/kg Körpergewicht. Das Antibiotikum bcheint bei Geflügel sehr viel weniger toxisch zu sein, da die akute orale Toxizität bei Geflügel, wiederum ausgedrückt als LD50, etwa 284,45 ± 47,22 mg/kg Körpergewicht beträgt.

Das Antibiotikum A 3823 ist bekannten Coccidiostatika bei der Bekämpfung von Coccidien überlegen, die resistent gegen Coccidiostatika, wie Amprolium oder 3,5-Dinitro-2-methylbenzamid, sind, wie aus nachstehender Tabelle hervorgeht. Bei einer Abnahme der coccidiostatischen Wirkung eines untersuchten Mittels um mindestens 50 Prozent wird der entsprechende Stamm als resistent bezeichnet. In der Tabelle geben die Werte vor dem Schrägstrich die Gesamtzahl der resistenten Isolate und die Werte nach dem Schrägstrich die Gesamtzahl der untersuchten Isolate wieder.

Resistenz von Eimeria acervulina gegenüber Antibiotikum A 3823 und verschiedenen bekannten Coccidiostatika

Coccidiostatikum

Anzahl der Resistenz gegen:

untersuchten

Isolate Buquinolat A-3823

Meticlorpindol

Decoquinat Nicarbazin Robeniden

Amprolium & Ethopabat	53	23/29	0/7	10/53	25/53	0/4	0/2
Buquinolat	13	13/13^a)	—	5/13	10/13")	—	—
Antibiotikum A 3823	47	0/1	0/46^a)	11/47	23/47	—	0/9
Meticlomindol	104	41/59	0/27	82/104»)	55/104	1/2	0/4

Fortsetzung

Coccidiostatikum

Anzahl der Resistenz gegen:

untersuchten

Isolate Buquinolal A-382J

Mcticlorpindol

Dccoquinat Nicarbazin Robeniden

Decoquinat	102	38/44^a)	0/20	37/102	95/102»)
Nicarbazin	4	0/4	—	2/4	0/4
Nihydrazon	2	1/2	_	1/2	0/2
3,5-Dinitro-2-methylbenzamid	30	6/7	0/9	15/30	11/30
Nitromid & Sulfanitran	25	12/14	0/1	11/25	14/25
Robeniden	3		0/3	0/3	2/3

2/8

1/1

0/2

0/3")

^a) Diese Werte bedeuten das Auftreten von Resistenz gegen Coccidiostatika zum Zeitpunkt der Probengewinnung.

Die Herstellung des Antibiotikums A 3823 erfolgt dadurch, daß man Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen kultiviert, anschließend die Fermentationsbrühe filtriert, das Filtrat und den Mycelkuchen mit einem niedermolekularen Alkohol, niedermolekularen Ester, einem Keton, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid extrahiert und das Antibiotikum aus dem Extrakt nach an sich bekannten Methoden abtrennt.

Wegen der Unsicherheit der Klassifizierungsuntersuchungen bei Streptomyces-Organismen bestehen stets Zweifel bei der Klassifizierung eines neu aufgefundenen Organismus. Jedoch scheint der Organismus, welcher das Antibiotikum A 3823 bildet, in seinen wichtigsten Eigenschaften am meisten dem Streptomyces cinnamonensis Okami (NRRL B 1588) zu ähneln. Er ist jedoch als ein neuer Stamm dieses Streptomyces anzusehen, da ausreichende Unterschiede zwischen dem neu aufgefundenen Stamm von Streptomyces cinnamonensis und dem bekannten Stamm bestehen. Die zwei Stämme ähneln einander in der Sporenkette und in der Sporenmorphologie, in der Färbung des hergestellten Luft- und vegetativen Mycels und im Vorhandensein eines löslichen Pigments. Jedoch unterscheiden sich die beiden Stämme in der Verwertung von neun Kohlenstoffquellen, in der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch Streptomyces cinnamonensis (NRRL B 1588), dagegen Fehlen der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch den neu aufgefundenen Stamm. Insbesondere unterscheiden sich die zwei Stämme aber stark in ihren Temperaturerfordernissen. So erfolgen beispielsweise bei Streptomyces cinnamonensis (NRRL B 1588) maximales Wachstum und maximale Sporenbildung bei 26⁰C. Bei 30⁰C erfolgt nur eine mittelmäßige Sporenbildung. Ein Wachstum erfolgt, jedoch ohne Sporenbildung, bei 37"C, während bei 43°C das Wachstum vollständig unterdrückt wird. Im Gegensatz hierzu wächst der neu aufgefundene Stamm von Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 bei 30 bis 37°C maximal unter maximaler Sporenbildung. Bei 43°C tritt noch mittelmäßiges Wachstum, obgleich mit spärlicher Sporenbildung, auf, das isl bei einer Temperatur, bei welcher der bekannte Stamm überhaupt nicht mehr wächst.

Der Organismus, welcher das Antibiotikum A 3823 produziert, wurde aus einer in Phoenix, Arizona, entnommenen Bodenprobe isoliert. Dabei wurde die Bodenprobe in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension auf Nähragar aufgetragen. Die beimpften Agarplattcn wurden bei 25 bis 35"C bebrütet, bis man sichtbare Kolonien beobachtete. Nach der Inkubationszeit wurden Kolonien der Antibiotika erzeugenden Organismen mit einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertragen. Die Schrägagar-Ansätze wurden dann bebrütet, um geeignete Mengen an impfmaterial für die Herstellung von A 3823 zu gewinnen.

Die für die Klassifizierungsuntersuchungen des A 3823 produzierenden Stammes von S. cinnamonensis ATCC 15413 verwendeten Methoden sind diejenigen welche man üblicherweise zur Klassifizierung von Actinomyceten verwendet. Die Kohlenstoffverwertungsteste wurden ausgeführt in Übereinstimmung mil der Methode von P r i d h a m und G ο 111 i e b (J. Bact 56 [1948], S. 107). In den nachfolgenden Absätzen sine die Ergebnisse der Klassifizierungsuntersuchungen zusammengefaßt. Die in Klammer gesetzten Ziffern beziehen sich auf Farbgruppen im Dictionary of Coloi von Maerz und Paul (1950). Alle Kulturen wurder bei 3O⁰C gezüchtet. Morphologische und Kulturcharakteristiken wurden nach 14 Tagen Inkubationszeit bestimmt. Zum Studium der Morphologie der Kulturen wurden Tomatenpasten-Hafermehl-Agar und Czapek-Agar verwendet. Nitratreduktion und Gelatine-Verflüssigung wurden nach 7 und 14 Tagen bestimmt, während Beobachtungen über die Schwefelwasserstoffbildung nach 24 und 48 Stunden erfolgten. Wie üblich wurde die Kohlenstoffverwertung nach 10 Tagen Inkubationszeil bestimmt.

Mikroskopische Morphologie

Morphologie der Sporenkette

Sporophoren und Sporenketten sind gerade bi; gekrümmt; Spiralen und Haken sind nicht vorhan den. Die Sporen sind oval bis kurze Zylinder mi Abmessungen von 0,7 bis 11,1 ιτιμ zu 1,4 bis 2,2 σιμ Elektronenmikroskopische Aufnahmen von mi Platin kontratstierten Kohleabdrücken der Sporet zeigen eine verhältnismäßig glatte Sporenoberflä ehe, welche mit einem Netzwerk von ineinande verschlungenen, feinfaserigen Bündeln bedeckt ist.

Kultureigenschaften

Tomatenpasten-Hafermehl Agar

Das Wachstum ist leinlich mit einem starkei blaßroten (3-D7) Luftmycel, die Rückseite ii rotbraun (8-H3). Es ist ein lösliches, rotbraune Pigment vorhanden.

Nähragar

Das Wachstum ist gering ohne Luftmyccl. Die Rückseite ist gelb (10-F3). Lösliches Pigment ist nicht vorhanden.

Czapek-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen, hellrosafarbenen (2-Bl) Luftmycel. Die Rückseite ist hellgelbbraun (11-F5). Man beobachtet eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigments.

Glucose-Asparagin-Agar

Das Wachstum ist spärlich ohne Luftmycel. Die Rückseite ist hellgelb-grün (19-B1).

Stärke-Agar mit anorganischen Salzen

Das Wachstum ist reichlich mit einem reichlichen, mäßig blaßroten Luftmycel; die Rückseite ist mäßig braun (14-AlO). Es ist eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigments vorhanden.

Hefeextrakt-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen Luftmycel, welches weiß ist mit einem bräunlichblaßroten Rand. Die Rückseite ist ein dunkles, graustichiges Braun (15-A2); wenig braunes, lösliches Pigment.

Bennet-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen, graustichigen, gelb-blaßroten (4-B7) Luftmycel. Die Rückseite ist mäßig braun (14-A10); wenig braunes, lösliches Pigment.

Emerson-Agar

Das Wachstum ist mäßig, jedoch ohne Luftmycel. Die Rückseite ist mäßig orangefarben (10-17). Lösliches Pigment nicht festgestellt.

Calciummalat-Agar

Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen gelb-blaßroten (3-D7) Luftmycel. Die Rückseite ist graubraun; wenig braunes, lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar

Das Wachstum ist nur mittelmäßig ohne Luftmycel. Die Rückseite ist ein graustichiges Gelb (12-B2). Lösliches Pigment wurde nicht festgestellt.

Physiologische Eigenschaften

Magermilch

Koagulation und Peptonisierung wurde beobachtet.

Gelatineverflüssigung
Wechselnd

NitratreHuktion
Negativ

Temperaturbedingungen

Maximales Wachstum und maximale Sporenbildung werden zwischen 30 und 37°C beobachtet. Bei 43° C finden mittelmäßiges Wachstum und mittelmäßige Sporenbildung statt. Bei 5O⁰C beobachtet man kein Wachstum.

Die Ergebnisse der Teste der Kohlenstoffverwertung, die mit dem A 3823 produzierenden Stamm von S. cinnamonensis ATCC 15413 durchgeführt wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Symbole zur Kennzeichnung des Wachstums sind wie folgt;

Kohlenstoff-Quelle

Reaktion

D( + )-Xylose

L( + )-Ribose

L( + )-Rhamnose

Dextrose

Fructose

Saccharose

Lactose

D( + )-Raffinose

i-Inosit

Inulin

Maltose

Mannit

Salicin

d-Sorbit

D-Ribose

D(+)-Trehalose

D( + )-Mannose

+ = Verwertung.

( + 1= Verwertung wahrscheinlich.
( —) = Verwertung fraglich.
— = keine Verwertung.

Zur Herstellung des Antibiotikums A 3823 durch Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 eignet sich ein übliches Kulturmedium aus assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Eine bevorzugte Carbohydratquelle ist beispielsweise Melasse, obgleich auch Glucose, Fructose, Maltose, Stärke oder Inosit verwendet werden können. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl oder Mischungen von Aminsäuren. Anorganische Nährsalze, welche dem Kulturmedium einverleibt werden können, sind die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid- oderCarbonat-Ionen liefern können.

Spurenelemente, welche für das Wachstum und die Entwicklung des Organismus Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 notwendig sind, sollen auch im Kulturmedium vorhanden sein. Solche Spurenelemente kommen üblicherweise als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die ausreichen, um den Wachstumsbedingungen des Organismus zu entsprechen.

Der zur Herstellung von A 3823 verwendete Organismus kann beträchtlichen Änderungen in den Wachstumsbedingungen unterworfen werden. So wächst der Organismus beispielsweise in einer Vielfalt von Medien, in welchen der anfängliche pH-Wert sehr stark schwankt. Vor der Beimpfung des Mediums mit dem Organismus ist es jedoch erwünscht, den pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen etwa 6,5 und etwa 7,5 einzustellen, was von dem im Einzelfall verwendeten Medium abhängt. Ebenso wie bei anderen Actinomyceten wird mit fortschreitender Fermentation das Medium allmählich alkalischer und kann während der Wachstumsperiode des Organismus einen pH-Wert zwischen etwa 7 und etwa 8 oder höher erreichen. Der End-pH-Wert wird wenigstens teilweise bestimmt durch den anfänglichen pH-Wert des Mediums, die im Medium vorhandenen Pufferstoffe und die Zeitdauer des Wachstums.

Ebenso wie für die Herstellung anderer Antibiotika werden für die Herstellung von wesentlichen Mengen des Antibiotikums A 3823 vorzugsweise aerobe Submerskulturen in großen Tanks verwendet. Kleine

Mengen des Antibiotikums erhält man zweckmäßig in Schüttelkolben und durch Oberflächenkulturen in Flaschen. Das Fermentationsmedium im sterilen Tank kann zur Einleitung der Fermentation mit einer Suspension, die Sporen gebildet hat, beimpft werden. Da jedoch die Erfahrung gemacht wurde, daß bei Verwendung einer Suspension, die Sporen gebildet hat, als Impfmaterial eine Wachstumsverzögerung eintritt, verwendet man bevorzugt die vegetative Form der betreffenden Kultur. Durch Vermeidung der Wachstumsverzögerung in dieser Weise realisiert man eine wirksamere Ausnutzung der Fermentationsvorrichtung. Es ist daher erwünscht, zunächst ein vegetatives Impfmaterial der Organismus dadurch herzustellen, daß man eine verhältnismäßig kleine Menge eines Kulturmediums mit einer Sporenform des Organismus beimpft und, wenn man ein junges, aktives, vegetatives Impfmaterial hergestellt hat, dieses aseptisch in einen großen Gärtank zu übertragen. Das Medium, in welchem das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann entweder dasselbe oder ein anderes Medium als dasjenige sein, das man für die großtechnische Herstellung von A 3823 verwendet.

Der das Antibiotikum A 3823 produzierende Organismus wächst innerhalb eines weiten Temperaturbereichs zwischen etwa 25 und etwa 45°C. Maximales Wachstum und maximale Sporenbildung treten jedoch zwischen etwa 27 und etwa 37°C ein. Bevorzugt wird die Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa 27 und 30° C durchgeführt. jo

Wie bei aeroben, submersen Züchtigungsverfahren üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium während der Fermentation geblasen. Für ein wirksames Wachstum des Organismus und entsprechend gute Erzeugung von A 3823 in der Tankherstellung des Antibiotikums beträgt das verwendete Luftvolumen vorzugsweise wenigstens etwa 0,1 Raumteile Luft/Minute/Raumteil Kulturmedium. Das beste Wachstum und die besten Ausbeuten an A 3823 erhält man, wenn das verwendete Luftvolumen wenigstens 0,5 Raumteile Luft/Minute/Raumteil Kulturmedium, vorzugsweise wesentlich mehr, beträgt.

Die Konzentration des gebildeten Antibiotikums im Kulturmedium kann man während der Fermentation leicht dadurch verfolgen, daß man Proben des Kulturmediums auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum eines Organismus prüft, von dem bekannt ist, daß sein Wachstum in Gegenwart dieses Antibiotikums gehemmt ist. Für diesen Zweck sind die Organismen Mycobacterium avium und Bacillus subtilis geeignet. Die Prüfung der Proben kann man in bekannter Weise turbidimetrisch oder mit der Zylinder-Plattenmethode durchführen.

Im allgemeinen erfolgt die Höchstproduktion an A 3823 innerhalb von etwa 2 bis 5 Tagen nach Beimpfung des Nährmediums, wenn man eine aerobe Submerskultur oder Schüttclkolbenkultur verwendet, und innerhalb etwa 5 bis 10 Tagen, wenn man eine Oberflächcnkultur verwendet.

Das während der Fermentation erzeugte Antibiotikiim A 3823 kann sich entweder in der Nährbrühc oder im Mycel oder an beiden Orten bilden. Demzufolge werden die Isolicrungsvcrfnhrcn so gewühlt, daß eine Höchstgewinnung des Antibiotikums entweder von einer oder von beiden Quellen ermöglicht wird. fa5 Beispielsweise kann man die erhaltene NUhrbrühc filtern und das Filtrat mit dem betreffenden Lösungsmittel extrahieren, um das nicht im Mycelkuchen zurückgehaltene Antibiotikum zu gewinnen. Das im Mycelkuchen vorhandene Antibiotikum wird durch gründliche Extraktion des Mycelkuchens mit dem betreffenden Lösungsmittel gewonnen. In beiden Fällen kann das Antibiotikum aus dem Extraktionslösungsmittel durch allgemein übliche Methoden erhalten werden.

Beispiel 1

Herstellung des Antibiotikums A 3823 in Schüttelkolbenkulturen

Man beimpft einen Nähr-Schrägagar, welcher aus 5 g Casaminsäure, 5 g Glycerin, 5 g Dextrin, 10 g Endmelasse des Zuckerrohrs (»Black-strap-Melasse«), 5 g Hefe 2019, 1 g K₂HPO₄, 5 ml einer Mineralsalzlösung, 20 g Agar und Leitungswasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 1 besteht, mit Sporen von Streptomycescinnamonensis,Stamm ATCC 15413.(Die Mineralsalzlösung enthält 100 g KCl, 100 g MgSo₄ · 7 H₂O, 2 g FoSO₄ und 2 ml konzentrierter Salzsäure je Liter Lösung.) Der pH-Wert des Sporen-Impfmediums wird auf einem pH-Wert von 7,6 bis 7,8 eingestellt. Der beimpfte Schrägagar wird etwa 5 Tage bei etwa 3O⁰C bebrütet, dann mit einer geringen Menge sterilem Wasser bedeckt und leicht abgeschabt, um die Organismen abzulösen und eine wäßrige Suspension der Organismen zu gewinnen.

I ml der so erhaltenen Suspension verwendet man zum Beimpfen von 100 ml eines Mediums für vegetatives Wachstum, welches die folgende Zusammensetzunghat:

Cerelose	15g
Sojabohnenmehl	15g
Maisquellwasser- Feststoffe	5g
Natriumchlorid	5g
Calciumcarbonat	2g
Wasser auf	1 I

Das Medium dieser Zusammensetzung wird bei etwa I2O°C und etwa 1,06 at etwa 30 Minuten sterilisiert, bevor es geimpft wird. Das geimpfte Medium für vegetatives Wachstum wird etwa 48 Stunden bei etwa 3O⁰C auf einer Amplitudenschüttelmaschine mit einer Amplitude von etwa 5,1 cm und 108 Bewegungen je Minute geschüttelt.

5-ml-Anteile des erhaltenen Mediums mit vegetativem Wachstum verwendet man zur Beimpfung von 100-ml-Anteilen eines sterilen Produktionsmediums, welches in 500-ml-Erlenmeyerkolben enthalten ist. Das verwendete Produktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung je Liter:

Cerelose	10g
Brer-Rabbit-Melassc	20 g
Pepton	5g
Calciumcarbonat	2g
Wasser auf	1 1

Die beimpfte Produktionskultur schüttelt man etwa 5 Tage bei etwa 26 bis 30°C auf einer wie oben beschriebenen Amplitudenschüttelmaschine. Danach gibt man den Inhalt einer Anzahl von Schüttelkolben zusammen, filtriert die Brühe durch eine Büchner-Nutschc mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe. Die filtrierte Brühe stellt man auf einen pH-Wert von etwa 3 mit 5 η-Salzsäure ein und extrahiert dann zweimal mit Chloroform. Man engt die vereinigten Chloroformcxtrakte zur Trockne ein, löst den Rückstand in Chloroform und filtriert die Lösung, Man leitet das

Filtrat durch eine Kolonne mit den Abmessungen 2 cm χ 48 cm, die mit 0,42 χ 1,68 mm grüßen Aktivkohlestücken gefüllt ist und welche vorher mit Chloroform gewaschen worden ist. Nach dem Antibiotikumfiltrat leitet man 1 I Chloroform durch die Kolonne. Die aus der Kolonne ablaufenden Fraktionen, die in der Prüfung antibiotische Aktivität zeigen, vereinigt man und verdampft zur Tockne. Man löst den Rückstand in einem Lösungsgemisch, welches lOTeile Methanol auf I Teil Wasser enthält. Die erhaltene, das Antibiotikum enthaltende Lösung wird erwärmt und dann in einem Kühlraum beiseite gestellt. Die Kristallisation des Antibiotikums erfolgt langsam, wenn etwas von dem Methanol verdampft. Man trennt die Kristalle in einer Zentrifuge ab, wäscht sie mit kaltem Wasser und trocknet sie in einem Vakuumofen. Das erhaltene Antibiotikum wird aus Äther/Petroläther umkristallisiert und im Vakuum getrocknet. Das Antibiotikum besitzt die im Anspruch angegebenen Eigenschaften.

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Beispiel 2

Herstellung des Antibiotikums A 3823 in
halbtechnischem Maßstabe

Ein 2-l-Kolben mit 800 ml eines Mediums für vegetatives Wachstum, das 1% Maisstärke, 0,5% Natriumchlorid, 0,5% Pepton, 0,5% Rindfleischextraki und 0,25% Hefeextrakt in destilliertem Wasser enthält, wird geimpft mit einer Suspension, die man aus einer Nähr-Schrägagarkultur, wie in Beispiel 1 beschrieben, m erhalten hat. Das geimpfte Medium für vegetatives Wachstum wird 29 Stunden bei etwa 28° auf einer Rotationsschüttelmaschine mit 6,4 cm Ausschlag bei 250 Umdrehungen/Minute bebrütet. 50 ml der so erhaltenen vegetativen Kultur verwendet man zum Beimpfen eines 44-l-lmpfkulUirbehälters, welcher ein Medium enthält, das 30 Minuten bei 120⁰C sterilisiert worden ist, und 1 % lösliche Stärke, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Pepton, 0,5% Natriumchlorid und 0,5% Rindfleischextrakt in Wasser enthält. Man hält den Impfkulturbehälter nach der au Impfung 24 Stunden bei 28°C. Das Bewegen beginnt nach 8 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 370 Umdrehungen/Min. In den ersten 8 Stunden belüftet man mit 0,0113 m^J Luft/Min, und erhöht dann auf eine Menge von 0,0396 nWMin. Man verwendet die Impftankkultur zum Beimpfen eines 946-l-Fcrmcnters, welcher ein sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium enthält, das aus 1% Cerelose, 1% Zuckerrohrmelasse, 0,5% Sojabohnenschrot, 0,2% Calciumcarbonat und 0,02% eines Antischaummittels besteht. Die Temperatür des Fermentationstanks hält man bei etwa 30⁰C während der ganzen Fermentation. Die Belüftung während der Fermentation beträgt 0,482 nWMin. Man beginnt das Bewegen nach 6 Stunden mit 175 Umdrehungen/Min, und setzt die Fermentation fort.

Dann werden zu 825 I der erhaltenen Gesamtfermentationsbrühe 21 kg einer handelsüblichen Filterhilfe gegeben. Man mischt die Brühe gründlich mit der Filterhilfe und filtriert dann durch ein 61-cm-Platten- und Rahmenfilter. Man wäscht den Filterkuchen auf dem Filter mit einer ausreichenden Menge destilliertem Wasser, um zusätzlichem Filtratvoliimen auf 825 I zu bringen. Den Filterkuchen hebt man für die weitere Verarbeitung zur Gewinnung von zusätzlichen Antibiotikum auf.

Man fügt zu dem Filtrat etwa 550 I Chloroform und senkt den pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von 5 η-Salzsäure auf etwa 3. Man mischt die wäßrige und die organische Phase gründlich etwa 30 Minuten und trennt dann durch Zentrifugieren. Die verbrauchte Brühenphase wird verworfen. Die Chloroformphase konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 9450 ml. Dann leitet man das Chloroformkonzentrat durch eine Glaskolonne eines Durchmessers von 10,2 cm, welche bis zu einer Höhe von 168 cm beschickt ist mit 1,68 χ 0,42-mm-Aktivkohle der Handelssorte Pittsburgh CaI carbon, die in der Kolonne vorgewaschen worden ist, indem man 50 1 Chloroform durch die Kolonne mit einer Menge von 500 ml/Min, durchgeleitet hat. Man leitet das Chloroformkonzentrat, welches das Antibiot'kum enthält, durch die Kolonne in einer Menge von etwa 200 ml/Min. Die von der Kolonne abfließenden ersten vier Liter, welche das in der Kolonne festgehaltene Flüssigkeitsvolumen darstellen, werden verworfen. Nach dem Chloroformkonzentrat leitet man Chloroform als Waschflüssigkeit durch die Kolonne. Man gewinnt etwa 50 Liter Kolonneneluat, in dem das Antibiotikum enthalten ist, und konzentriert dieses Eluat im Vakuum auf ein Volumen von etwa 370 ml.

Zusätzliches Antibiotikum erhält man aus dem Filterkuchen, indem man zweimal 70 1 Methanol durch die Filterpresse leitet. Den verbrauchten Filterkuchen verwirft man. Die vereinigten Methanoleluate konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 13 Liter. Man gibt etwa 8,7 I Chloroform /.u dem Konzentrat, erniedrigt den pH-Wert durch Zugabe von 5 η-Salzsäure auf etwa pH 3, mischt die zwei Phasen gründlich etwa 30 Minuten und trennt dann durch Zentrifugieren. Die verbrauchte Wasserphase wird verworfen. Die Chloroformphase konzentriert man in Vakuum auf ein Volumen von etwa 420 ml. Das erhaltene Konzentrat wird mit dem obigen aus dem Filtrat der Brühe erhaltenen Konzentral vereinigt. Dieses Konzentrat wird dann zu kristallinem Antibiotikum A 3823 analog dem in Beispiel I beschriebenen Verfahren aufgearbeitet. Das erhaltene Antibiotikum besitzt die im Anspruch angegebenen Charakteristiken.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Antibiotikum A 3823 mit folgenden Charakteristiken: Weiße, feste, kristalline Substanz vom F. etwa 103 bis 106⁰C, löslich in niedermolekularen Alkoholen, niedermolekularen Estern, Ketonen, Chloroform, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid und unlöslich in Wasser. Die Substanz hat eine titrierbare Gruppe von pK'_a = 6,65 in 66%igem, wäßrigem Dimethylformamid, eine optische Drehung [λ] von +47,7° als l°/oige Lösung in Methanol. Die Elementaranalyse ergibt nach 2 Stunden Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxid bei etwa 60°C eine angenäherte Zusammensetzung von 62,78% Kohlenstoff, 9,43% Wasserstoff und 26,61% Sauerstoff und nach dem Trocknen in einer Block-Schmelzpunktsvorrichtung eine angenäherte Zusammensetzung von 64,66% Kohlenstoff, 9,58% Wasserstoff und 25,41% Sauerstoff. Das Molekulargewicht beträgt etwa 677, berechnet aus Titrationswerten. Die Lösung des Antibiotikums in Chloroform zeigt das in der Figur dargestellte Ultrarotabsorptionsspektrum mit den folgenden unterscheidbaren Banden bei 2,73.2,98 (Schulter), 3,05,3,38,3,47, 5,86,6,23, (1,83,7,02,7,26,7,56,7,66,7,76,8,04,9,02,9,17, 9,47, 9,78, 9,91, 10,06, 10,25, 10,58, 10,82, 10,98, 11,21, 11,44,11,64,11,82 und 11,97 Mikron. Im Ultraviolettbereich besitzt es keine merkliche Absorption. Die Substanz ist erhältlich durch Kultivieren von Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen mit anschließender Filtration der Fermentationsbrühe und J5 Extraktion des Filtrats und Mycelkuchens mit einem niedermolekularen Alkohol, niedermolekularen Ester, einem Keton, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid und Abtrennung des Antibiotikums aus dem Extrakt nach an sich bekannten Methoden.