DE1467883B2

DE1467883B2 - Verfahren zur herstellung eines antibiotikums

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Publication number: DE1467883B2
Application number: DE19651467883
Authority: DE
Inventors: Michael Edward; Hoehn Marvin Martin; McGuire James Myrlin; Indianapolis Ind. Haney jun. (V.StA.)
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1964-09-28
Filing date: 1965-09-28
Publication date: 1973-07-12
Also published as: FR1588155A; NL139557B; DK115244B; CH457720A; GB1127224A; NL6512545A; DE1467883A1; BE670210A; BR6573551D0; DE1793766C3; ES317908A1; DE1793766A1; DE1793766B2; DE1467883C3

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur 25 Herstellung des Antibiotikums A 3823, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, unter submersen, 30 aeroben Bedingungen kultiviert, die Fermentationsbrühe filtriert, das Filtrat und den Mycelkuchen mit einem niedermolekularen Alkohol, niedermolekularen Ester, einem Keton, Chloroform, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid extrahiert und das Antibioti- 35 kum aus dem Extrakt nach an sich bekannten Methoden gewinnt.

Das erfindungsgemäß erhältliche, neue Antibiotikum A 3823 ist ein weißer, kristalliner, fester Stoff,
der bei etwa 103 bis 106⁰C schmilzt, in niedermole- 40
kularen Alkoholen, niedermolekularen Estern, Ketonen, Chloroform, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid löslich und Γη Wasser unlöslich ist.
Die Substanz hat eine titrierbare Gruppe vom
pK'a = 6,65 in 66°/_oigem, wäßrigem Dimethylform- 45
amid. Die optische Drehung [<x]" der l%igen Lösung
in Methanol beträgt +47,7°. Die Elementarafialyse
ergibt nach 2 Stunden Trocknen im Vakuum übe'f
Phosphorpentoxid bei etwa 6O⁰C eine annähernde Die berechnete empirische Formel von A 3823 ist

Zusammensetzung von 62,78 % Kohlenstoff, 9,43 % 50 C₃₆H₆₆Oj₂. Jedoch läßt das Verhalten der Verbindung Wasserstoff und 26,61 °/₀ Sauerstoff und nach dem unter scharfen Trocknungsbedingungen vermuten, Trocknen in einer Blockschmelzpunktsvorrichtung daß das Antibiotikum mit einem Mol Kristallwasser eine annähernde Zusammensetzung von 64,66 °/₀ kristallisiert und die empirische Formel des AntiKohlenstoff, 9,58 % Wasserstoff und 25,41 % Sauer- biotikums C₃₆H₆₄O₁₁ lautet.

stoff. Das Molekulargewicht beträgt etwa 677, be- 55 Qualitative Versuche mit der Verbindung A 3823 rechnet aus Titrationswerten. Die Lösung des Anti- lassen vermuten, daß keine reduzierten oder Aminobiotikums in Chloroform zeigt die folgenden unter- zucker vorhanden sind. Die Steroid- und Gluconscheidbaren Banden des Ultrarotabsorptionsspek- säureteste sind ebenfalls negativ,
trums: 2,73, 2,98 (Schulter), 3,05, 3,38, 3,47, 5,86, Das erfindungsgemäß hergestellte Antibiotikum

6,23, 6,83, 7,02, 7,26, 7,56, 7,66, 7,76, 8,04, 9,02, 60 zeigt eine Vielfalt von interessanten und wertvollen 9,17, 9,47, 9,78, 9,91, 10,06, 10,25, 10,58, 10,82, Eigenschaften. So zeigt beispielsweise das Anti-10,98, 11,21, 11,44, 11,64, 11,82 und 11,97 Mikron. biotikum A 3823 eine Hemmwirkiing des Wachstums Die Substanz zeigt keine merkliche Absorption im von Bakterien und Pilzen, welche pathogen gegenüber Ultraviolettbereich. dem tierischen und pflanzlichen Leben sind. Die

Das erfindungsgemäß erhältliche, neue Antibioti- 65 Hemmkonzentrationen für eine Anzahl von Orgakum ist als Zusatz zu Tierfutter geeignet. nismen, bestimmt durch die Agar-Reihenverdün-

Das Antibiotikum A 3823 unterliegt einer raschen nungsmethode, sind in der nachfolgenden Tabelle I Veränderung in saurer Lösung unter Aktivitäts- gezeigt.

d	I/Ix
13,01	0,05
11,88	0,10
9,70	0,80
9,39	0,90
8,68	0,50
8,20	0,20
7,93	0,20
7,50	0,20
7,21	0,80
7,01	1,00
6,39	0,90
5,47	0,90
5,36	0,05
5,19	0,70
4,93	0,60
4,65	0,50
4,47	0,10
4,26	0,60
3,97	0,10
3,77	0,05
3,58	0,05
3,53	0,05
3,44	0,05
3,32	0,05
3,17	0,05

Tabelle I

	Mindesthemmkonzentration	[y/tnl]	72 Std.
Testorganismus		48 Std.
	24 Std.	<0,78
Staphylococcus aureus	<0,78	1,56
Bacillus subtilis	1,56	<0,78
Mycobacterium avium	—	12,5
Streptococcus faecalis..	3,13	<0,78
Lactobacillus casei ....	<0,78
Leuconostoc citro-		3,13
vorum	<O,78	>100
Proteus sp. No. 1	50	50	6,25
Vibrio metschnikovii ..	50		3,13
Alternaria solani			12,5
Botrytis cinerea			100
Colletotrichum pisi....
Glomerella cingulate ..			50
Helminthosporium			25
sativum			12,5
Polyporus ostreatus ...			1,56
Penicillium expansum..			3,13
Pullularia sp			100
Sclerotinia fructicola ..			100
Verticillium albo-atrum
Spicaria divaricata ....

Eine andere wichtige Eigenschaft von A 3823 ist seine Fähigkeit, die Entwicklung der Coccidiose bei Geflügel zu verhindern. So verhindert beispielsweise A 3823, das im Futter von jungen Hühnern vorhanden ist, in Mengen von nur 0,02 °/o sehr wirksam die Mortalität und vermindert bei Hühnern die Zahl der Schaden, welche durch verschiedene Arten von Coccidien hervorgerufen werden. Die Ergebnisse, die bei vier Species beobachtet worden sind, werden in der Tabelle II gezeigt.

Tabelle II

Antibiotische Aktivität des Antibiotikums A 3823 gegenüber vier Goccidienarten

Infizierender
Organismus

Eimeria tenella ..
Eimeria necatrix
Eimeria maxima
Eimeria Brunetti

Antibiotikumgehalt
im Futter
[Gewichtsprozent]

0,02
Kontrolle

Anzahl	Mor
der	tali
Hüh	tät
ner
	L¹VoJ
19	0
50	36
30	0
50	48
50	0
50	0
20	0
20	0

Gewichtszunahme

[g] "■■■

1778

133

4128

-98

8500

7100

1498

935

Die akute Toxizität des Antibiotikums A 3823 bei Mäusen, ausgedrückt als LD₅₀, beträgt etwa 43,8 ± 5,2 mg/kg Körpergewicht, wenn man das Antibiotikum oral gibt. Intraperitoneal beträgt die LD₅₀ etwa 16,8 ± 1,7 mg/kg Körpergewicht. Das Antibiotikum scheint bei Geflügel sehr viel weniger toxisch zu sein, da die akute orale Toxizität bei Geflügel, wiederum ausgedrückt als LD₅₀, etwa 284.45 ± Al,22 mg/kg Körpergewicht beträgt.

Das neue Antibiotikum wird hergestellt, indem man einen neu aufgefundenen Stamm eines Actinomyceten-Organismus unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium züchtet, bis das Kulturmedium merklich antibiotische Aktivität aufweist. Man kann dann das Antibiotikum durch Anwenden verschiedener bekannter Arten der Isolierung und Reinigung gewinnen. Diese Verfahren können verwendet werden, um das Antibiotikum in relativ reiner Form zu erhalten. Es genügt ein geringerer Grad der Reinigung, wenn das Antibiotikum in Tierfutter eingearbeitet werden soll. In diesem Falle braucht das Antibiotikum nicht als fester Stoff gewonnen zu werden, sondern kann, falls gewünscht, auf das Futter oder einen Träger als konzentrierte Lösung aufgesprüht werden.

Der zur erfindungsgemäßen Herstellung des neuen Antibiotikums verwendete Pilzstamm wurde hinterlegt bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C, und hat die Kulturnummer ATCC 15413 erhalten.

Wegen der Unsicherheit der Klassifizierungsuntersuchungen bei Streptomyces-Organismen bestehen' stets Zweifel bei der Klassifizierung eines neu aufgefundenen Organismus. Jedoch scheint der Organismus, welcher das Antibiotikum A 3823 bildet, in seinen wichtigsten Eigenschaften am meisten dem Streptomyces cinnamonensis Okami (NRRL B 1588) zu ähneln. Er wird als neuer Stamm dieses Streptomyces angesehen. Es bestehen ausreichende Unterschiede zwischen dem neu aufgefundenen Stamm von S. cinnamonensis und dem bekannten Stamm, so daß es notwendig ist, den in dieser Anmeldung beschriebenen Organismus als neuen Stamm zu bezeichnen. Die zwei Stämme ähneln einander in der Sporenkette und in der Sporenmorphologie, in der Färbung des hergestellten Luft- und vegetativen Mycels und im Vorhandensein eines löslichen Pigments. Jedoch unterscheiden sich die Stämme in der Verwertung von neun Kohlenstoffquellen, in der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch S. cinnamonensis (NRRL B 1588), dagegen Fehlen der Herstellung von Schwefelwasserstoff durch den neu aufgefundenen Stamm. Insbesondere unterscheiden sich die zwei Stämme aber stark in ihren Temperaturerfordernissen. So erfolgen beispielsweise bei S. cinnamonensis (NRRL B 1588) maximales Wachstum und maximale Sporenbildung bei 26° C. Bei 30⁰C erfolgt nur eine mittelmäßige Sporenbildung. Ein Wachstum erfolgt, jedoch ohne Sporenbildung, bei 37° C, während bei 43° C das Wachstum vollständig unterdrückt wird. Im Gegensatz hierzu wächst der neu aufgefundene Stamm von S. cinnamonensis ATCC 15413 bei 30 bis 37°C maximal unter maximaler Sporenbildung. Bei 43° C tritt noch mittelmäßiges Wachstum, obgleich mit spärlicher Sporenbildung, auf, das ist bei einer Temperatur, bei welcher der bekannte Stamm überhaupt nicht mehr wächst.

Der Organismus, welcher das Antibiotikum A 3823

produziert, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem man Proben des Bodens in sterilem, destillier-

δο tem Wasser suspendierte und die Suspension auf Nähragar auftrug. Die beimpften Agarplatten wurden bei 25 bis 35° C bebrütet, bis man sichtbare Kolonien beobachtete. Nach der Inkubationszeit wurden Kolonien der Antibiotika erzeugenden Organismen mit einer sterilen Platinöse auf Schrägagar übertragen. Die Schrägagar-Ansätze wurden dann bebrütet, um geeignete Mengen an Impfmaterial für die Herstellung von A 3823 zu gewinnen.

Die für die Klassifizierungsuntersuchungen des A 3823 produzierenden Stammes von S. cinnamonensis ATCC 15413 verwendeten Methoden sind diejenigen, welche man üblicherweise zur Klassifizierung von Actinomyceten verwendet. Die Kohlenstoffverwertungsteste wurden ausgeführt in Übereinstimmung mit der Methode von P r i d h a m und G ο 111 i e b (J. Bact. 56 [1948], S. 107). In den nachfolgenden Absätzen sind die Ergebnisse der Klassifizierungsuntersuchungen zusammengefaßt. Die in Klammer gesetzten Ziffern beziehen sich auf Farbgruppen im Dictionary of Color von M a e r ζ und Paul (1950). Alle Kulturen wurden bei 3O⁰C gezüchtet. Morphologische und Kulturcharakteristiken wurden nach 14 Tage Inkubationszeit bestimmt. Zum Studium der Morphologie der Kulturen wurden Tomatenpasten-Hafermehl-Agar und Czapek-Agar verwendet. Nitratreduktion und Gelatine-Verflüssigung wurden nach 7 und 14 Tagen bestimmt, während Beobachtungen über die Schwefelwasserstoffbildung nach 24 und 48 Stunden erfolgten. Wie üblich wurde die Kohlenstoffverwertung nach 10 Tage Inkubationszeit bestimmt.

Mikroskopische Morphologie

Morphologie der Sporenkette. Sporophoren und Sporenketten sind gerade bis gekrümmt; Spiralen und Haken sind nicht vorhanden. Die Sporen sind ovale bis kurze Zylinder mit Abmessungen von 0,7 bis 11,1 ΐημ zu 1,4 bis 2,2 ηαμ. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von mit Platin kontrastierten Kohleabdrücken der Sporen zeigen eine verhältnismäßig glatte Sporenoberfläche, welche mit einem Netzwerk von ineinander verschlungenen, feinfasrigen Bündeln bedeckt ist.

Kultureigenschaften

Tomatenpasten-Hafermehl-Agar. Das Wachstum ist reichlich mit einem starken, blaßroten (3-D7) Luftmycel, die Rückseite ist rotbraun (8-H3). Es ist ein lösliches, rotbraunes Pigment vorhanden.

Nähragar. Das Wachstum^ ist gering ohne Luftmycel. Die Rückseite ist gelb (10-F 3). Lösliches Pigment ist nicht vorhanden.

Czapek-Agar. Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen, hellrosafarbenen (2-B1) Luftmycel.. Die Rückseite ist hellgelbbraun (11-F 5). Man beobachtet eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigments.

Glucose-Asparagin-Agar. Das Wachstum ist spärlich ohne Luftmycel. Die Rückseite ist hellgelbgrün (19-B1).

Stärke-Agar mit anorganischen Salzen. Das Wachstum ist reichlich mit einem reichlichen, mäßig blaßroten Luftmycel; die Rückseite ist mäßig braun (14-AlO). Es ist eine geringe Menge eines braunen, löslichen Pigments vorhanden.

Hefeextrakt-Agar. Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen Luftmycel, welches weiß ist mit einem bräunlich-blaßroten Rand. Die Rückseite ist ein dunkles, graustichiges Braun (15-A2); wenig braunes, lösliches Pigment.

Bennett-Agar. Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen, graustichigen, gelb-blaßroten (4-B7) Luftmycel. Die Rückseite ist mäßig braun (14-A10); wenig braunes, lösliches Pigment.

Emerson-Agar. Das Wachstum ist mäßig, jedoch ohne Luftmycel. Die Rückseite ist mäßig orangefarben (10-17). Lösliches Pigment nicht festgestellt.

Calciummalat-Agar. Das Wachstum ist mäßig mit einem mäßigen gelb-blaßroten (3-D7) Luftmycel. Die Rückseite ist graubraun; wenig braunes, lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar. Das Wachstum ist nur mittelmäßig ohne Luftmycel. Die Rückseite ist ein graustichiges Gelb (12-B2). Lösliches Pigment wurde nicht festgestellt.

Physiologische Eigenschaften

Magermilch. Koagulation und Peptonisierung wurde beobachtet.

Gelatineverflüssigung. Wechselnd.
Nitratreduktion. Negativ.

Temperaturbedingungen. Maximales Wachstum und maximale Sporenbildung werden zwischen 30 und 37°C beobachtet. Bei 43°C finden mittelmäßiges Wachstum und mittelmäßige Sporenbildung statt. Bei 5O⁰C beobachtet man kein Wachstum.

Die Ergebnisse der Teste der Kohlenstoffverwertung, die mit dem A 3823 produzierenden Stamm von S. cinnamonensis ATCC 15413 durchgeführt wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Die Bedeutung der in der Tabelle verwendeten Symbole zur Kennzeichnung der Wachstumsantwort sind wie folgt:

+ = Verwertung,
(+) = Verwertung wahrscheinlich,
(—) = Verwertung fraglich,

— = keine Verwertung.

Kohlenstoff-Quelle Reaktion

D(+)-Xylose +

L(+)-Ribose

L(+)-Rhamnose

Dextrose +

Fructose +

Saccharose (—)

Lactose (—)

D(+)-Raffinose +

i-Inosit +

Inulin (—)

Maltose +

Mannit +

Salicin +

d-Sorbit (-)

D-Ribose +

D(+)-Trehalose +

D(+)-Mannose +

Das zur Herstellung des Antibiotikums A 3823 durch S. cinnamonensis ATCC 15413 verwendete Kulturmedium kann jedes beliebige Medium einer Anzahl von Medien sein, da, wie aus den vorstehend angegebenen Verwertungsprüfungen hervorgeht, der das Antibiotikum erzeugende Organismus die Energie einer Vielfalt von Quellen verwerten kann. Jedoch sind aus Gründen der Wirtschaftlichkeit in der Herstellung, der besten Ausbeute und der Leichtigkeit der Isolierung des Antibiotikums bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So ist eine der bevorzugten Carbohydrat-Quellen für die Gärung Melasse, obgleich auch Glucose, Fructose, Maltose, Stärke, Inosit

u. dgl. verwendet werden können. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Peptone, Sojabohnenmehl, Mischungen von Aminosäuren u. dgl. Unter den anorganischen Nährsalzen, welche den Kulturmedien ein-

7 8

verleibt werden können, sind die üblichen Salze, die Wie bei aeroben, submersen Züchtungsverfahren Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phos- üblich, wird sterile Luft durch das Kulturmedium phat-, Chlorid-, Carbonat- u. dgl. Ionen liefern während der Fermentation geblasen. Für ein wirkkönnen, sames Wachstum des Organismus und entsprechend

Spurenelemente, welche für das Wachstum und 5 gute Erzeugung von A 3823 in der Tankherstellung die Entwicklung des Organismus, welcher für die des Antibiotikums beträgt das verwendete Luft-Herstellung von A 3823 verwendet wird, notwendig volumen vorzugsweise wenigstens etwa 0,1 Raumteile sind, sollen auch im Kulturmedium vorhanden sein. Luft/Minute/Raumteil Kulturmedium. Das beste Solche Spurenelemente kommen üblicherweise als Wachstum und die besten Ausbeuten an A 3823 Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des io erhält man, wenn das verwendete Luftvolumen Mediums in Mengen vor, die ausreichend sind, um wenigstens 0,5 Raumteile Luft/Minute/Raumteil KuI-den Wachstumsbedingungen des Organismus zu ent- turmedium, vorzugsweise wesentlich mehr, beträgt, sprechen. Die Konzentration des Antibiotikums im Kultur-

Der zur Herstellung von A 3823 verwendete Orga- medium kann man während der Fermentation leicht nismus kann beträchtlichen Änderungen in den 15 verfolgen, indem man Proben des Kulturmediums Wachstumsbedingungen unterworfen werden. So auf ihre Hemmwirkung gegenüber dem Wachstum wächst der Organismus beispielsweise in einer Vielfalt eines Organismus prüft, von welchem bekannt ist, von Medien, in welchen der anfängliche pH-Wert daß sein Wachstum in Gegenwart dieses Antibiotisehr stark schwankt. Vor der Beimpfung des Mediums kums gehemmt ist. Für diesen Zweck sind die Orgamit dem Organismus ist es jedoch erwünscht, den 20 nismen Mycobacterium avium und Bacillus subtilis pH-Wert des Nährmediums auf einen Wert zwischen geeignet. Die Prüfung der Proben kann man in etwa 6,5 und etwa 7,5 einzustellen, was von dem im bekannter Weise turbidimetrisch oder mit der Zylin-Einzelfall verwendeten Medium abhängt. Ebenso wie der-Plattenmethode durchführen,
bei anderen Actinomyceten wird mit Fortgang des Im allgemeinen erfolgt die Höchstproduktion an Fermentationsverfahrens das Medium allmählich al- 25 A 3823 innerhalb etwa 2 bis 5 Tagen nach Beimpfung kalischer und kann einen pH-Wert zwischen etwa des Nährmediums, wenn man eine aerobe Submers-7 und etwa 8 oder höher während der Wachstums- kultur oder Schüttelkolbenkultur verwendet, und periode des Organismus erreichen, während das innerhalb etwa 5 bis 10 Tagen, wenn man eine Ober-Antibiotikum erzeugt wird. Der End-pH-Wert wird flächenkultur verwendet. ■'■■'■

wenigstens teilweise bestimmt durch den anfänglichen 30 Das während der Fermantation von A 3823 erzeugte

pH-Wert des Mediums, die im Medium vorhandenen Antibiotikum kann sich entweder in der Nährbrühe

Pufferstoffe und die Zeitdauer, während welcher man oder im Mycel oder an beiden Orten bilden. Dem-

den Organismus wachsen läßt. zufolge sind die Isolierungsverfahren, die bei der

Ebenso wie für die Herstellung anderer Antibiotika Herstellung von A 3823 verwendet werden, so gewerden für die Herstellung von wesentlichen Mengen 35 wählt, daß eine Höchstgewinnung des Antibiotikums des Antibiotikums A 3823 vorzugsweise aerobe Sub- entweder von einer oder von beiden Quellen ermöglicht merskulturen in großen Tanks verwendet. Kleine wird. So kann man beispielsweise die erhaltene Mengen des Antibiotikums erhält man zweckmäßig Nährbrühe filtern und das' Filtrat mit einem geeigin Schüttelkolben und durch Oberflächenkulturen in neten Lösungsmittel extrahieren, um das nicht im Flaschen. Das Fermentationsmedium im sterilen 4° Mycelkuchen zurückgehaltene Antibiotikum zu geTank kann zur Einleitung der Fermentation mit winnen. Zusätzlich gewinnt man das im Mycelkuchen einer Suspension, die Sporen gebildet hat, beimpft vorhandene Antibiotikum durch gründliche Extrakwerden. Da jedoch. die Erfahrung gemacht wurde, tion mit einem geeigneten Lösungsmittel. In beiden daß bei Verwendung einer Suspension, die Sporen Fällen kann das Antibiotikum aus dem Extraktionsgebildet hat, als ^Impfmaterial eine Wachstumsver- 45 lösungsmittel durch übliche, in der Technik allgemein zögerung eintritt, verwendet man bevorzugt die. vege- verwendete Methoden gewonnen werden,
tative Form der Kultur. Durch Vermeidung der Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Wachstumsverzögerung in dieser Weise realisiert man Obgleich die vorliegende Beschreibung sich besonders eine wirksamere Ausnutzung der Fermentationsvor- auf den neu aufgefundenen Organismus S. cinnarichtung. Es ist daher erwünscht, zunächst ein vege- 50 monensis ATCC 15413 bezieht, liegt auch die Hertatives Impfmaterial des Organismus dadurch her- stellung von A 3823 durch Züchtung anderer A 3823 zustellen, daß man eine verhältnismäßig kleine Menge herstellender Stämme von S.- cinnamonensis oder von' eines Kulturmediums mit einer Sporenform des Mutanten von A 3823 herstellenden Stämmen von Organismus beimpft und, wenn man ein junges, S. cinnamonensis einschließlich von Mutanten von aktives, vegetatives Impfmaterial hergestellt hat, 55 ATCC 15413 im Bereich der Erfindung. Solche dieses aseptisch in einen großen Gärtank zu über- Stämme oder Mutanten kann man nach bekannten tragen. Das Medium, in welchem das vegetative Verfahren herstellen, beispielsweise indem man einen Impfmaterial hergestellt wird, kann entweder dasselbe Stamm von S. cinnamonensis einer Röntgen- oder oder ein anderes Medium als dasjenige sein, das man Ultraviolettstrahlung oder der Einwirkung von chefür die großtechnische Herstellung von A 3823 ver- 60 mischen Mitteln, wie Stickstofflost-Verbindungen, wendet. unterwirft.

Der Organismus, welcher A 3823 produziert, wächst Beispiel 1
innerhalb eines weiten Temperaturbereichs zwischen

etwa 25 und etwa 45° C. Maximales Wachstum und Die Herstellung des Antibiotikums A 3823 in

maximale Sporenbildung treten jedoch zwischen 65 Schüttelkolbenkulturen wird durch das folgende

etwa 27 und etwa 37°C ein. Bevorzugt wird die Verfahren erläutert:

Fermentation bei einer Temperatur zwischen etwa Man beimpft einen Nähr-Schrägagar, welcher aus

27 und 30° C durchgeführt. 5 g Casaminsäure, 5 g Glycerin, 5 g Dextrin, 10 g

9 10

Endmelasse des Zuckerrohrs (»Black-strap-Melasse«), dann in einem Kühlraum beiseite gestellt. Die Kristal-

5 g Hefe 2019, 1 g K₂HPO₄, 5 ml einer Mineralsalz- !isation des Antibiotikums erfolgt langsam, wenn

lösung, 20 g Agar und Leitungswasser bis auf ein etwas von dem Methanol verdampft. Man trennt

Gesamtvolumen von 11 besteht, mit Sporen von die Kristalle in einer Zentrifuge ab, wäscht sie mit

Streptomyces cinnamonensis, Stamm ATCC 15413. S kaltem Wasser und trocknet sie in einem Vakuum-

(Die Mineralsalzlösung enthält 100 g KCl, 100 g ofen. Das so erhaltene Antibiotikum wird aus Äther/

MgSO₄ · 7 H₂O, 2 g FeSO₄ und 2 ml konzentrierter Petroläther umkristallisiert und im Vakuum ge-

Salzsäure je Liter Lösung.) Der pH-Wert des Sporen- trocknet.

Impfmediums wird auf einen pH-Wert von 7,6 bis B e i s d i e 1 2
7,8 eingestellt. Der beimpfte Schrägagar wird etwa io

5 Tage bei etwa 30° C bebrütet, dann mit einer Die Herstellung des Antibiotikums A 3823 in halbgeringen Menge sterilem Wasser bedeckt und leicht technischem Maßstabe wird durch das folgende Verabgeschabt, um die Organismen abzulösen und eine fahren erläutert:

wäßrige Suspension der Organismen zu gewinnen. Ein 2-1-Kolben mit 800 ml eines Mediums für

1 ml der so erhaltenen Suspension verwendet man 15 vegetatives Wachstum, das 1 % Maisstärke, 0,5 %

zum Beimpfen von 100 ml eines Mediums für vege- Natriumchlorid, 0,5% Pepton, 0,5 % Rindfleisch-

tatives Wachstum, welches die folgende Zusammen- extrakt und 0,25 °/₀ Hefeextrakt in destilliertem Wasser

setzung hat: enthält, wird geimpft mit einer Suspension, die man

Cerelose 15 ε ^{aus e}*^ner Nähr-Schrägagarkultur, wie im Beispiel 1

SojabohnenmehV .'.''.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 15 g ²° beschrieben, erhalten hat. Das geimpfte Medium

Maisquellwasser-Feststoffe 5 g ^f"^r ₀ vegetatives Wachstum wird 29 Stunden bei etwa

Natriumchlorid 5 g 28 C auf einer Rotaüonsschuttelmaschine mit 6,4 cm

Calciumcarbonat 2 g Ausschlag bei 250 Umdrehungen/Minute bebrütet.

Wasser auf 11 50 ml der so erhaltenen vegetativen Kultur verwendet

25 man zum Beimpfen eines 44-1-Impfkulturbehälters,

Das Medium dieser Zusammensetzung wird bei welcher ein Medium enthält, das 30 Minuten bei etwa 120° C und etwa 1,06 at etwa 30 Minuten steri- 120° C sterilisiert worden ist, und 1 % lösliche Stärke, lisiert, bevor es geimpft wird. Das geimpfte Medium 0,5 °/₀ Hefeextrakt, 0,5 % Pepton, 0,5 % Natriumfür vegetatives Wachstum wird etwa 48 Stunden bei chlorid und 0,5 °/₀ Rindfleischextrakt in Wasser entetwa 3O⁰C auf einer Amplitudenschüttelmaschine 30 hält. Man hält den Impfkulturbehälter nach der mit einer Amplitude von etwa 5,1cm und 108 Be- Impfung 24 Stunden bei 28° C. Das Bewegen beginnt wegungen je Minute geschüttelt. nach 8 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 5-ml-Anteile des so erhaltenen Mediums mit vege- 370 Umdrehungen/Min. In den ersten 8 Stunden tativem Wachstum verwendet man zur Beimpfung belüftet man 0,0113 m³ Luft/Min, und erhöht dann von 100-ml-Anteilen eines sterilen Produktions- 35 auf eine Menge von 0,0396 m³/Min. Man verwendet mediums, welches in 500-ml-Erlenmeyerkolben ent- die Impftankkultur zum Beimpfen eines 946-1-Ferhalten ist. Das verwendete Produktionsmedium hat menters, welcher ein sterilisiertes wäßriges Fermendie folgende Zusammensetzung je Liter: tationsmedium enthält, das aus 1% Cerelose, l°/₀ Cerelose 10 g Zuckerrohrmelasse, 0,5% Sojabohnenschrot, 0,2%

Brer-Rabbit-Melasse 20 g ⁴° Calciumcarbonat und 0,02 % eines Antischaummittels

Pepton 5 g besteht. Die Temperatur des Fermentationstanks hält

Calciumcarbonat 2 g ^man ^i ^etwa 30⁰C während der ganzen Fermen-

Wasser auf *" 11 tation. Die Belüftung während der Fermentation

beträgt 0,482 m³/Min. Man beginnt das Bewegen

Die beimpfte Produktionskultur schüttelt man 45 nach 6 Stunden mit 175 Umdrehungen/Min, und etwa 5 Tage bei etwa 26 bis 30° C auf einer wie oben fährt damit für die Dauer der Fermentation fort, beschriebenen Amplitudenschüttelmaschine. Danach Die Isolierung des Antibiotikums wird wie im Beigibt man den Inhalt einer Anzahl von Schüttelkolben-.· spiel 3 beschrieben durchgeführt,
zusammen, filtriert die Brühe durch eine Büchner-

Nutsche mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe. 5° B e i s ρ i e 1 3
Die filtrierte Brühe stellt man auf einen pH-Wert

von etwa 3 mit 5n-Salzsäure ein und extrahiert dann Die Gewinnung eines gereinigten Konzentrats, zweimal mit Chloroform. Man engt die vereinigten welches das Antibiotikum A 3823 enthält, aus einer Chloroformextrakte zur Trockne ein, löst den Rück- Fermentationsbrühe wird durch das folgende Verstand in Chloroform und filtriert die Lösung. Man 55 fahren erläutert:

leitet das Filtrat durch eine Kolonne mit den Ab- Man gibt zu 825 1 der durch das im Beispiel 2 messungen 2 · 48 cm aus 0,42 · 1,68-mm-Aktivkohle beschriebene Verfahren erhaltenen Gesamtbrühe 21 kg der Handelssorte Pittsburgh CaI carbon (Vertrieb einer handelsüblichen Filterhilfe. Man mischt die durch Pittsburgh Coke and Chemical Co., Neville Brühe gründlich mit der Filterhilfe und filtriert dann Island, Pa.), welche vorher mit Chloroform gewaschen 60 durch ein 61-cm-Platten- und Rahmenfilter. Man worden ist. Nach dem Antibiotikumfiltrat leitet man wäscht den Filterkuchen auf dem Filter mit einer 11 Chloroform durch die Kolonne. Die aus der ausreichenden Menge destilliertem Wasser, um das Kolonne ablaufenden Fraktionen, die in der Prüfung Filtratvolumen auf 825 1 zu bringen. Den Filterantibiotische Aktivität zeigen, vereinigt man und kuchen hebt man für die weitere Verarbeitung zur verdampft zur Trockne. Man löst den Rückstand in 65 Gewinnung von zusätzlichem Antibiotikum auf.
einem Lösungsgemisch, welches 10 Teile Methanol Man fügt zu dem Filtrat etwa 550 1 Chloroform auf 1 Teil Wasser enthält. Die erhaltene, das Anti- und senkt den pH-Wert des Gemisches durch Zugabe biotikum enthaltende Lösung wird erwärmt und von 5n-Salzsäure auf etwa 3. Man mischt die wäß-

rige und die organische Phase gründlich etwa 30 Minuten und trennt dann durch Zentrifugieren. Die verbrauchte Brühenphase wird verworfen. Die Chloroformphase konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 9450 ml. Dann leitet man das Chloroformkonzentrat durch eine Glaskolonne eines Durchmessers von 10,2 cm, welche bis zu einer Höhe von 168 cm beschickt ist mit 1,68 · 0,42-mm-Aktivkohle der Handelssorte Pittsburgh CaI carbon, die in der Kolonne vorgewaschen worden ist, indem man 50 1 Chloroform durch die Kolonne mit einer Menge von 500 ml/Min, durchgeleitet hat. Man leitet das Chloroformkonzentrat, welches das Antibiotikum enthält, durch die Kolonne in einer Menge von etwa 200 ml/Min. Die von der Kolonne abfließenden ersten 4 Liter, welche das in der Kolonne festgehaltene Flüssigkeitsvolumen darstellen, werden verworfen. Nach dem Chloroformkonzentrat leitet man Chloroform als Waschflüssigkeit durch die Kolonne. Man gewinnt etwa 50 Liter Kolonneneluat,

das Antibiotikum enthält, und konzentriert dieses Eluat im Vakuum auf ein Volumen von etwa 370 ml. Zusätzliches Antibiotikum erhält man aus dem Filterkuchen, indem man zweimal 701 Methanol durch die Filterpresse leitet. Den verbrauchten Filterkuchen verwirft man. Die vereinigten Methanoleluate konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von etwa 13 Liter. Man gibt etwa 8,7 1 Chloroform zu dem Konzentrat, erniedrigt den pH-Wert durch

ίο Zugabe von 5n-Salzsäure auf etwa pH 3, mischt die zwei Phasen gründlich etwa 30 Minuten und trennt dann durch Zentrifugieren. Die verbrauchte Wasserphase wird verworfen. Die Chloroformphase konzentriert man im Vakuum auf ein Volumen von

is etwa 420 ml. Man fügt das so erhaltene Konzentrat zu dem Konzentrat, das man aus dem Filtrat der Brühe erhalten hat, und verwendet die vereinigten Konzentrate zur Herstellung von kristallinem A 3823 durch ein Kristallisationsverfahren, welches ähnlich ist demjenigen, das im Beispiel 1 beschrieben ist

Claims

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verlust. In basischer Lösung dagegen ist das AntiPatentanspruch· biotikum merklich beständig. So unterliegt beispielsweise eine Probe des Antibiotikums, das man bei einem pH-Wert von 11 60 Stunden unter Rückfluß

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 5 erhitzt, keiner sichtbaren Änderung, abgesehen von A 3823, dadurch gekennzeichnet, daß der Bildung des Salzes der Säure. Wenn man das man Streptomyces cinnamonensis ATCC 15413 Antibiotikum als trockenes, kristallines Material in einem Kulturmedium, welches assimilierbare lagert, so bleibt A 3823 lange Zeit beständig.
Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorga- Das Kernmagnetresonanzspektrum deutet darauf

rüschen Salzen enthält, unter submersen, aeroben io hin, daß das Molekül eine Carboxygruppe, 3 bis Bedingungen kultiviert, die Fermentationsbrühe 4 Hydroxygruppen und eine Atherbindung aufweist, filtriert, das Filtrat und den Mycelkuchen mit Der Rest des Moleküls scheint aus Methylen- und einem niedermolekularen Alkohol, niedermole- Methyl-Gruppierungen zu bestehen. Das Ultrarotkularen Ester, einem Keton, Chloroform, Di- absorptionsspektrum des Antibiotikums A 3823 in methylformamid oder Dimethylsulfoxid extrahiert 15 Chloroformlösung bei 0,1 mm Schichtdicke zeigt die und das Antibiotikum aus dem Extrakt nach an F i g. 1.

sich bekannten Methoden gewinnt. Ein Röntgenpulverdiagramm des Antibiotikums

unter Verwendung einer Cr-Strahlung mit einem Vanadiumfilter zur Berechnung der Schichtlinien-20 abstände ergibt folgende Werte: