DE4142951C1 - - Google Patents

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DE4142951C1
DE4142951C1 DE19914142951 DE4142951A DE4142951C1 DE 4142951 C1 DE4142951 C1 DE 4142951C1 DE 19914142951 DE19914142951 DE 19914142951 DE 4142951 A DE4142951 A DE 4142951A DE 4142951 C1 DE4142951 C1 DE 4142951C1
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Germany
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methanol
eluent
archazolide
water
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DE19914142951
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Gerhard Prof. Dr. Hoefle
Hans Prof. Dr. Reichenbach
Florenz Dr. Sasse
Heinrich 3300 Braunschweig De Steinmetz
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GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings

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Description

Die Erfindung betrifft Archazolide der folgenden allgemeinen Formel:
mit den folgenden Bedeutungen:
7-OX und 15-OX sind OH, NYCH₃ ist NHCH₃
Gemäß einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Archazolid der Summenformel C₄₂H₆₂N₂SO₇ mit folgenden Parametern:
UV (Methanol): lambda max (log epsilon)=228 nm (4,6)
Massenspektrum (EI, 70 eV): m/z=738 [M] H⁺
Dünnschichtchromatographie (DC-Alufolie 60F-254,
Laufmittel Dichlormethan/Methanol 95 : 5): Rf=0,56
Analytische HP-Flüssigchromatographie (Nucleosil C-18 10 µm, 250×4 mm, Laufmittel Methanol/Wasser 8 : 2, 1,5 ml Fluß/min): Rt=12,0 min.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Archazolids der Summenformel C₄₂H₆₂N₂SO₇ mit den vorstehend angegebenen Parametern, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • - Archangium gephyra DSM 6806 in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Medium kultiviert und das Archazolid produzieren läßt.
  • - das gebildete Archazolid an einem Adsorberharz adsorbiert.
  • - das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt.
  • - danach das Archazolid vom Adsorberharz mit einem Elutionsmittel freisetzt und gefriertrocknet.
Dieses erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, daß man
  • - an Amberlite XAD16 adsorbiert,
  • - mit Methanol eluiert,
  • - das Eluat bis zur Wasserphase einengt,
  • - mit Ethylacetat extrahiert,
  • - den Ethylacetat-Extrakt einengt,
  • - in Methanol aufnimmt,
  • - an einer Sephadex-Säule (LH20; Laufmittel: Methanol) fraktioniert,
  • - an einer Umkehrphase-Säule (Nucleosil C-18; Laufmittel: Methanol/Wasser) chromatographiert und
  • - einengt und gefriertrocknet.
Ferner betrifft die Erfindung ein therapeutisches Mittel, daß aus einem oder aus mehreren erfindungsgemäßen Archazoliden besteht oder diese neben üblichen Hilfsmitteln, beispielsweise Trägern und Verdünnungsmittel, umfaßt.
Nachstehend wird die Erfindung durch ein Beispiel näher erläutert.
Beispiel (Herstellung von Archazolid A) A.1. Produktionsstamm
Das Bakterium Archangium gephyra gehört zur Ordnung der Myxococcales, Unterordnung Cystobactarineae, Familie Archangiaceae. Der Produktionsstamm Ar 3548 wurde im Januar 1988 an der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) aus einer Bodenprobe aus den Karawanken in Österreich isoliert. Der Stamm wurde am 13. 11. 91 bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) unter Nummer DSM 6806 hinterlegt. Die Merkmale des Produktionsstamms stimmen mit der Beschreibung von Archangium gephyra in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology., Vol. 3 (1989), Seite 2148, überein.
A.2. Stammkultur
Die Stammkultur erfolgt auf Agarplatten, bevorzugt auf Hefe-Agar (VY/2-Agar). Dieses Medium enthält 0,5% Bäckerhefe, 0,1% CaCl₂×2 H₂O, 0,1 µg/1 Vitamin B₁₂ und 1,2% Agar. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt. Die Platten werden bei 30°C bebrütet.
A.3. Morphologische Beschreibung
Die vegetativen Zellen sind lange, schlanke Stäbchen mit verjüngten Enden, etwa 0,8×6-10 µm. Bedingt durch die Gleitbewegung der Bakterien, breiten sich die Kolonien rasch über die Kulturplatte aus. Die Schwarmkolonie auf Hefeagar ist dünn, filmartig, rötlich braun. Wie an dem um die Kolonien entstehenden Klärhof zu erkennen, werden die Hefezellen im Medium abgebaut.
Auf Ausstrichen von lebenden Escherichia-coli-Bakterien auf Wasseragar (1,5% Agar, 0,1% CaCl₂ 2 H₂O, pH 7,2, autoklaviert), aber auch VY/2-Agar bildet der Organismus hellorange bis blaß bräunliche Fruchtkörper. Bei diesen handelt es sich um Rippen und wulstige Massen, die oft kammartig hochgezogen oder sogar koralloid verzweigt sind und aus erhärtetem Schleim und Myxosporen bestehen. Die Myxosporen sind kurze plumpe, sehr dicke und gut gerundete Stäbchen, oft etwas unregelmäßig im Umriß, und immer stark lichtbrechend. Sie messen etwa 1,4-1,8×1,8-2,2 µm.
A.4. Leistungen
Der Stamm Ar 3548 produziert eine Substanz, nämlich Archazolid, die das Wachstum von humanen Krebszellinien und anderer tierischer Zellkulturen und das Wachstum von Pilzen hemmt. Der Hemmstoff kann sowohl aus den Zellen wie auch aus dem Kulturüberstand isoliert werden.
A.5. Produktion des Archazolids
Die Substanz wird während der logarithmischen bis hin zur stationären Wachstumsphase produziert. Eine typische Fermentation verläuft wie folgt:
Ein Fermentor mit 350 l Arbeitsvolumen wird mit 300 l Kulturmedium gefüllt (Zusammensetzung: 0,5% Einzellerprotein aus Methylomonas clarae (Probion; Hoechst); 0,5% Stärke; 0,2% Glucose; 0,1% Hefeextrakt; 0,1% MgSO₄×7 H₂O; 0,1% CaCl₂×2 H₂O; 0,1 µg/l Vitamin B₁₂). Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt. Zur Bindung des ins Medium freigesetzten Hemmstoffes wird dem Medium 1% (V/V) eines Adsorberharzes (Amberlite XAD-16) zugesetzt. Beimpft wird mit 10 l einer 2 Tage alten Vorkultur, die im gleichen Medium in einem entsprechend kleineren Fermentor erzeugt wurde. Fermentiert wird bei 30°C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 Upm und einer Belüftung von 10 Vol.-% pro min. Anfängliche Schaumbildung wird durch Zugabe von 50 ml Silikon-Antischaum (z. B. Tegosipon) verhindert. Der pH-Wert steigt im Laufe der Fermentation an. Der Anstieg wird durch Zugabe von 5%iger Schwefelsäure auf 7,8 begrenzt. Die Fermentation wird nach 6 Tagen beendet.
B. Wirkung
Archazolid hemmt sehr effektiv das Wachstum von humanen Krebszellinien und anderen tierischen Zellkulturen, ohne die Zellen unmittelbar abzutöten. Adhärent wachsende Zellen runden sich unter dem Einfluß von Archazolid ab und werden frei beweglich. Archazolid hemmt das Wachstum von bestimmten Pilzen (vgl. Tabelle).
Wirkungspektrum
Humane Krebszellinien
IC₅₀
HeLa (ATCC CCL 2) 1 ng/ml
K-562 (ATCC CCL 243) 1 ng/ml
Tierische Zellinien @ Maus, L 929 (ATCC CCL 1) 1 ng/ml
Ente (ATCC CCL 141) 0,1 ng/ml
Hefen
Hemmhof im Agardiffusionstest [mm] (20 µg pro Testblättchen mit 5 mm Durchmesser)
Metschnikowia pulcherrima
10
Pichia membranaefaciens 10
Torulopsis glabrata 9
Lipomyces lipofer 9
Nematospora coryli 9
Saccharomyces cerevisiae 9
Hansenula anomala 7
Andere Pilze @ Ustilago zeae 12
Aspergillus niger 11
Mucor hiemalis 10
Pythium debaryanum 10
Sclerotinia sclerotiorum 10
Botrytis cinerea 8
C. Isolierung von Archazolid
Aus einem 100 l Fermentationsansatz des Stammes Ar 3548 in Gegenwart von 1 l Adsorberharz (Amberlite XAD 16) wird das Harz abgesiebt und mit 5 l Methanol in einem Zeitraum von 2,5 Stunden eluiert. Das Eluat engt man bis zur Wasserphase ein und extrahiert 3mal mit Ethylacetat, um polare Bestandteile abzutrennen. Der Ethylacetatextrakt wird eingeengt. Der verbleibende Rohextrakt (12 g) wird in 200 ml Methanol gelöst und in 2 Portionen über eine Sephadex-LH20-Säule (62 mm×63 mm) bei einem Fluß von 3,5 ml/min fraktioniert. Laufmittel Methanol; Detektion bei 227 nm und durch DC-Chromatographie. Die Archazolid enthaltenden Fraktionen (4,1 g) werden in 10 0,41 g Portionen über eine präparative Nucleosil C-18, 7 µm-Säule (250×16 mm) mit dem Laufmittel Methanol/Wasser 85/15 und einem Fluß von 15 ml/min (Detektion bei 227 nm) chromatographiert. Nach Eindampfen der vereinigten Archazolid enthaltenen Fraktionen bis zur Wasserphase wird gefriergetrocknet. Man erhält 100 mg Archazolid als amorphe Substanz.
D. Charakterisierung von Archazolid Farblose amorphe Substanz
UV (Methanol): λmax(lg∈)=228 nm (4,6)
El-MS (70 eV): m/z=738 [M]H⁺
Hochauflösung
ber.: 738, 4278 für C₄₂H₈₂N₂SO₇
gef.: 738,4239
¹H-NMR s. Tab. 1
¹³C-NMR s. Tab. 2
DC: (DC-Alufolie 60 F-254, Merck; Laufmittel Dichlormethan/Methanol 95 : 5) Rf=0,56
Detektion: UV-Absorption oder Ansprühen mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz und Erhitzen auf 120°C (violetter Fleck).
Analytische HPCL: Laufmittel Methanol/Wasser 8 : 2, Säule: Nucleosil C-18 10 µm (250×4 mm), Fluß: 1,5 ml/min, Detektion: 227 nm; Retentionszeit Rt=12,0 min.
¹H- und ¹³C-NMR Daten von Archazolid in CD₃OD

Claims (5)

1. Verbindung der folgenden allgemeinen Formel: mit den folgenden Bedeutungen:
7-OX und 15-OX sind OH, NYCH₃ ist NHCH₃.
2. Verbindung der Summenformel C₄₂H₆₂N₂SO₇ mit folgenden Parametern:
UV (Methanol): lambda max (log epsilon)=228 nm (4,6)
Massenspektrum (EI, 70 eV): m/z=738 [M] H⁺
Dünnschichtchromatographie (DC-Alufolie 60F-254,
Laufmittel Dichlormethan/Methanol 95 : 5): Rf=0,56
Analytische HP-Flüssigchromatographie (Nucleosil C-18 10 µm, 250×4 mm, Laufmittel Methanol/Wasser 8 : 2, 1,5 ml Fluß/min): Rt=12,0 min.
3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • - Archangium gephyra DSM 6806 in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltenden Medium kultiviert und das Archazolid produzieren läßt.
  • - das gebildete Archazolid an einem Adsorberharz adsorbiert.
  • - das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt.
  • - danach das Archazolid vom Adsorberharz mit einem Elutionsmittel freisetzt und gefriertrocknet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • - an Amberlite XAD16 adsorbiert,
  • - mit Methanol eluiert,
  • - das Eluat bis zur Wasserphase einengt,
  • - mit Ethylacetat extrahiert,
  • - den Ethylacetat-Extrakt einengt,
  • - in Methanol aufnimmt,
  • - an einer Sephadex-Säule (LH20; Laufmittel: Methanol) fraktioniert,
  • - an einer Umkehrphase-Säule (Nucleosil C-18; Laufmittel: Methanol/Wasser) chromatographiert und
  • - einengt und gefriertrocknet.
5. Therapeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 besteht oder diese neben üblichen Hilfsmitteln, insbesondere Trägern und Verdünnungsmitteln, umfaßt.
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JP-Kokai 1-108994 *
JP-Kokai 1-245088 *
JP-Kokai 63-157991 *
JP-Kokai 63-79585 *
Liebigs Ann. Chem. 1983, 1081-1095 *

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