WO1999047523A1 - Apicularen a und b - Google Patents
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- WO1999047523A1 WO1999047523A1 PCT/EP1999/001770 EP9901770W WO9947523A1 WO 1999047523 A1 WO1999047523 A1 WO 1999047523A1 EP 9901770 W EP9901770 W EP 9901770W WO 9947523 A1 WO9947523 A1 WO 9947523A1
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- 0 CCC=CC=CC(NC=CCC(CC(CC(C1)OC(C(C2O)NC(C)O)OC(CO)C2O)OC1C1)Oc2c1ccc*2O)=O Chemical compound CCC=CC=CC(NC=CCC(CC(CC(C1)OC(C(C2O)NC(C)O)OC(CO)C2O)OC1C1)Oc2c1ccc*2O)=O 0.000 description 1
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
- C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D493/08—Bridged systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
Definitions
- the present invention relates to apicular A of the following formula:
- the present invention further relates to a heterocyclic compound of the empirical formula C 25 H 31 N0 6 and with the following parameters:
- the present invention further relates to a heterocyclic compound which can be obtained by (a) Chondromyces robustus strain Cm r8 DSM 12054 in a Probion PS, starch, MgS0 4 x 7 H 2 0, CaCl 2 x 2 HO, mineral salts and medium containing cyanocobalamin in the presence of an adsorbent resin, the pH being a value not exceeding 7.62,
- the present invention further relates to a process for the preparation of the heterocyclic compound according to the invention, which is characterized in that (a) Chondromyces robustus strain Cm r8 DSM 12054 in a probion PS, starch, MgS0 4 x 7 H 2 0, CaCl 2 x 2 H 2 0, mineral salts and cyanocobalamin-containing medium are cultivated aerobically in the presence of an adsorber resin, the pH not exceeding 7.62,
- Probion PS instead of Probion PS, other conventional protein substrates can also be used.
- the invention further relates to a compound of the formula
- the invention further relates to a heterocyclic compound, obtainable in that
- the solvent-free phase is subjected to reverse phase chromatography on RP silica gel with a mixture of methanol / water (45:55) as the eluent and the fraction containing a heterocyclic compound is detected and separated in the UV and
- the invention further relates to a method for producing a heterocyclic compound according to the invention, which thereby is characterized in that one
- the solvent-free phase is subjected to reverse phase chromatography on RP silica gel with a mixture of methanol / water (45:55) as the solvent and the fraction containing the heterocyclic compound is detected and separated in the UV and
- the present invention relates to a cytostatic agent consisting of or containing a heterocyclic compound according to the present invention, optionally in addition to one or more conventional carriers and / or auxiliaries.
- A.l. Production strain The bacterium Chondromyces robustus, nov. spec, strain Cm r8, subordination Sorangineae, order Myxococcales.
- strains of the species Chondromyces apiculatus e.g. strain Cm a8 or Cm a22
- Chondromyces lanuginosus e.g. strain Sy t4
- Chondromyces pediculatus e.g. B. strain Cm pl
- the vegetative cells of Cm r8 are cylindrical with broadly rounded ends, 0.8 x 6-8 ⁇ m.
- the organism grows well on yeast agar, e.g. B. VY / 2 agar (baker's yeast 0.5%, based on fresh weight; CaCl 2 x 2H 2 0 0.1%, cyanocobalamin 0.5 mg / 1, agar 1.5%; pH 7.2).
- yeast agar e.g. B. VY / 2 agar (baker's yeast 0.5%, based on fresh weight; CaCl 2 x 2H 2 0 0.1%, cyanocobalamin 0.5 mg / 1, agar 1.5%; pH 7.2).
- No growth can be observed on pure glucose mineral salt media.
- Proteins, e.g. B. casein or unicellular protein are hydrolyzed. Chitin is not attacked.
- the strain grows preferably at 30 ° C, in the neutral pH range and aerobic.
- the colony gradually spreads over the culture plate on suitable nutrient media. Short, wide radial trenches form on the surface. If yeast cells are present in the nutrient medium, they are largely broken down. Fruit bodies can develop after a few days: These consist of one white slime stem, which at the end carries a group of thick orange sporangioles, each with 1 to 3 fine tails. The fruiting bodies reach heights of 200 to 800 ⁇ m.
- Probion PS single-cell protein from Methylomonas clarae; Hoechst-Werke, Frankfurt
- lml / 1 standard trace element solution and lml / 1 standard vitamin solution Schottampere 5th edition, page 168 ff.
- pH 7.0 The cultures are kept at 30 ° C for 5-7 days. The strain also grows well on the basis of skimmed milk powder.
- Cm r8 can be preserved: e.g. B. by freezing vegetative cells from agar plates or liquid cultures in peptone solution at -80 ° or in liquid nitrogen.
- A.5. Accessibility of the production master Cm r ⁇ is deposited with the German Collection of Microorganisms (DSM) in Braunschweig under the number DSM 12054.
- DSM German Collection of Microorganisms
- A.6. Detection of Apicular A For the qualitative detection of Apicular A, the cell mass or the XAD (see below) of the producing culture is extracted with acetone or methanol. Aliquots of the concentrated extracts are tested against L929 mouse fibroblasts. The quantitative determination in the extracts is carried out as described in section B by means of HPLC. The processing, isolation and chemical characterization are also carried out in accordance with Section B.
- Apicular A is formed in the shake flask during growth and reaches its highest activity after 5-7 days at the end of the logarithmic to early stationary phase.
- the aeration rate is set to 200 NL / hour at the beginning of the fermentation, the speed to 120 rpm. After 44 hours until the end of the fermentation (after 240 hours) the speed is reduced to 100 rpm. Because of the strong foaming of the medium, an additional 0.03% of the anti-foaming agent Tegosipon (from Goldschmidt, Essen) is added. The p0 2 value, which at the beginning of the mentation is 98% saturation, drops to 72.5% by the end of the fermentation after 240 hours. The pH drops in
- Apicular B The water phase of the crude extract extracted with ethyl acetate was then extracted three times with a total of 450 ml of n-butanol.
- the butanol phase was i. Vak. Completely freed from the solvent and separated by RP chromatography (RP silica gel ODS-AQ, 120 ⁇ , 15 ⁇ (YMC); mobile solvent 45% methanol in water, detection of UV absorption at 280 nm).
- the product fraction was i. Vak. concentrated to 85 mg apicular B. For analysis, a sample was purified by Sephadex LH-20 chromatography.
- Apicular A has a very strong cytotoxic effect. The growth of various human and animal cell lines is completely inhibited. Abnormal spindle devices are observed under the influence of Apicularen A. The table gives the concentrations for a 50% inhibition [IC 50 ] of cell growth.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Apicularen A der Formel (I), sowie Apicularen der Formel (II) sowie ein Herstellungsverfahren und ein Apicularen A-haltiges Mittel.
Description
Apicularen A und B
Die vorliegende Erfindung betrifft Apicularen A der folgenden Formel:
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine heterozyklische Verbindung der Summenformel C25H31N06 und mit den folgenden Parametern:
IR-Spektrum (KBr): vmax = 3288 (3597, 3510, 3417, 3194, 3067, 3031 sh), 2960, 2932, 2917, 2873, 1725, 1715, 1678, 1654, 1610, 1522, 1464, 1283, 1240, 1217, 1119, 1075, 1060, 957, 869, 803, 778, 722, 634 cm"1.
UV-Spektrum (CH3OH): λmax (lg ε) = 278 (4,43).
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine heterozyklische Verbindung, die dadurch gewinnbar ist, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H.O, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert, trocknet und den Extrakt im Vakuum zu einem Rohextrakt einengt,
(e) den Rohextrakt mit Methanol und wenig Wasser aufnimmt und mit Heptan extrahiert,
(f ) die Methanolphase im Vakuum einengt,
(g) das gewonnene Rohprodukt durch Kieselgel-Flashchromatographie mit Methylenchlorid und einem Gemisch von Methylenchlorid/Methanol (98:2) als Laufmittel auftrennt,
(h) die anfallenden Fraktionen im Vakuum einengt und
(i) aus Methanol auskristallisiert und im Vakuum trocknet.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert, trocknet und den Extrakt im Vakuum zu einem Rohextrakt einengt,
(e) den Rohextrakt mit Methanol und wenig Wasser aufnimmt und mit Heptan extrahiert,
(f) die Methanolphase im Vakuum einengt,
(g) das gewonnene Rohprodukt durch Kieselgel-Flashchromatographie mit Methylenchlorid und einem Gemisch von Methylenchlorid/Methanol (98:2) als Laufmittel auftrennt,
(h) die anfallenden Fraktionen im Vakuum einengt und
(i) aus Methanol auskristallisiert und im Vakuum trocknet.
Anstelle von Probion PS können auch andere übliche Proteinsubstrate eingesetzt werden.
Ferner betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel
OH
Ferner betrifft die Erfindung eine heterozyklische Verbindung der Summenformel CJJH^NJOH und mit den folgenden Parametern: UV (Methanol): λmax (lg ε) = 280 nm (4,489).- NMR-Daten: s. Tabelle 2.-
Ferner betrifft die Erfindung eine heterozyklische Verbindung, dadurch gewinnbar, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert,
(e) die extrahierte Wasserphase mit n-Botanol extrahiert und die Butanolphase abtrennt,
(f) die Butanolphase vom Lösungsmittel befreit,
(g) die lösungsmittelfreie Phase einer Umkehrphasen-Chromatographie an RP-Kieselgel mit einem Gemisch von Methanol/Wasser (45:55) als Laufmittel unterwirft und die Fraktion mit einem Gehalt an heterozyklischer Verbindung im UV detektiert und abtrennt und
(h) die abgetrennte Fraktion einengt und die heterozyklische Verbindung gewinnt.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert,
(e) die extrahierte Wasserphase mit n-Botanol extrahiert und die Butanolphase abtrennt,
(f ) die Butanolphase vom Lösungsmittel befreit,
(g) die lösungsmittelfreie Phase einer Umkehrphasen-Chromatographie an RP-Kieselgel mit einem Gemisch von Methanol/Wasser (45:55) als Lauf ittel unterwirft und die Fraktion mit einem Gehalt an heterozyklischer Verbindung im UV detektiert und abtrennt und
(h) die abgetrennte Fraktion einengt und die heterozyklische Verbindung gewinnt.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein cytostati- sches Mittel, bestehend aus oder mit einem Gehalt an einer heterozyklischen Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls neben einem oder mehreren üblichen Trägern und/ oder Hilfsmitteln.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung durch experimentelle Daten näher erläutert.
A. Produk ionsbedingungen
A.l. Produktionsstamm: Das Bakterium Chondromyces robustus , nov. spec, Stamm Cm r8, Unterordnung Sorangineae, Ordnung Myxococcales.
Alternativ können für die Produktion des Hemmstoffes Apicularen A auch Stämme der Arten Chondromyces apicu- latus (z. B. Stamm Cm a8 oder Cm a22), Chondromyces la- nuginosus (z. B. Stamm Sy t4) oder Chondromyces pedi- culatus (z. B. Stamm Cm pl ) verwendet werden.
A.2. Herkunft des Produktionstammes Cm r8: Isoliert im Dezember 1995 an der GBF aus einer Bodenprobe.
A.3. Beschreibung des Produktionsstammes:
A.3.1. Die vegetativen Zellen von Cm r8 sind zylindrisch mit breit abgerundeten Enden, 0,8 x 6-8 μm. Auf festen Nährböden wächst der Organismus gut auf Hefeagar, z. B. VY/2 Agar (Backhefe 0,5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2 x 2H20 0,1 %, Cyanocobalamin 0,5 mg/1, Agar 1,5 %; pH 7,2). Auf reinen Glucose-Mineralsalz-Medien ist kein Wachstum zu beobachten. Proteine, z. B. Casein oder Einzellerprotein werden hydrolysiert . Chitin wird nicht angegriffen. Der Stamm wächst bevorzugt bei 30 °C, im neutralen pH-Bereich und aerob. Auf geeigneten Nährböden breitet sich die Kolonie allmählich über die Kulturplatte aus. Auf der Oberfläche bilden sich kurze breite radiale Gräben. Sind Hefezellen im Nährboden vorhanden, werden diese weitgehend abgebaut. Nach einigen Tagen können Fruchtkörper entstehen: Diese bestehen aus einem
weißen Schleimstiel, der am Ende eine Gruppe von dicken orangefarbenen Sporangiolen mit jeweils 1 bis 3 feinen Schwänzchen trägt. Die Fruchtkörper werden 200 bis 800 μm hoch.
In Flüssigmedien wächst der Stamm in kleinen Zellklümp- chen, sowohl in Schüttelkolben bei 160 UpM (100 ml Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben bzw. 400 ml Medium in 1000 ml Erlenmeyerkolben), als auch in Bioreaktoren (getestet bis zum 100 1 Maßstab). Als Kulturmedium ist z. B. PollA -Medium geeignet: Probion PS (Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst-Werke, Frankfurt) 0,3 %; Stärke 0,3 %; MgS04*7H20 0,1 %; CaCl2x2H20 0,05 % ; lml/1 Standard-Spurenelementlösung und lml/1 Standardvitaminlösung (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie 5. Auflage, Seite 168 ff.); pH 7,0. Die Kulturen werden bei 30 °C über 5-7 Tage gehalten. Der Stamm wächst auch gut auf der Basis von Magermilchpulver.
Cm r8 läßt sich konservieren: z. B. durch Einfrieren vegetativer Zellen von Agarplatten oder Flüssigkulturen in Peptonlösung bei -80 ° oder im flüssigen Stickstoff.
A.4. Leistungen des Produktionsstammes: In Zellextrakten von Cm r8 ist eine cytotoxische Aktivität gegen verschiedene Zellkulturen (z. B. L929 Mausfibroblasten) nachweisbar. Die verantwortliche Substanz wurde Apicularen A genannt.
A.5. Zugänglichkeit des Produktionsstamms: Cm rδ ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig unter der Nr. DSM 12054 hinterlegt.
A.6. Nachweis von Apicularen A: Zum qualitativen Nachweis von Apicularen A wird die Zellmasse bzw. das XAD (siehe unten) der produzierenden Kultur mit Aceton bzw. Metha-nol extrahiert. Aliquote der konzentrierten Extrakte werden gegen L929 Mausfibroblasten getestet. Die quanti-tative Bestimmung in den Extrakten erfolgt wie in Ab-schnitt B beschrieben mittels HPLC. Die Aufarbeitung, Isolierung und chemische Charakterisierung erfolgen ebenfalls gemäß Abschnitt B.
A.7. Produktionsbedingungen von Apicularen A: In Schüttelkolben wird Apicularen A während des Wachstums gebildet und erreicht nach 5-7 Tagen am Ende der loga-rithmischen bis frühen stationären Phase die höchste Aktivität.
Fermentationsbeispiel im Bioreaktor
Bioreaktor Firma Bioengineering mit 150 1 Gesamtvolumen und 90 1 Arbeitsvolumen, ausgestattet mit Blattrührer. Medium PollA: Probion PS (Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst-Werke Frankfurt) 0,3%; Stärke 0,3 %, MgS04.7H20 0,1%; CaCl2.2H20 0,05 %; Standard-Spurenelementlösung 1 ml/1 (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie, 5. Auflage, Seite 168 ff.), Cyanocobalamin 0,25 mg/1; pH 7,1. 85 1 Medium werden mit 5 1 Kultur aus gut bewachsenen Schüttelkolben beimpft. Die Belüftungsrate wird zu Beginn der Fermentation auf 200 NL/ Stunde, die Drehzahl auf 120 UpM eingestellt. Nach 44 Std. bis zum Ende der Fermentation (nach 240 Stunden) wird die Drehzahl auf 100 UpM erniedrigt. Wegen starker Schaumbildung des Mediums werden zusätzlich 0,03 % des Antischaummittels Tegosipon (Fa. Goldschmidt, Essen) zugesetzt. Der p02-Wert, der zu Beginn der Fer-
mentation 98 % Sättigung beträgt, sinkt bis zum Ende der Fermentation nach 240 Stunden bis auf 72,5 %. Der pH-Wert sinkt im
Verlauf der ersten 28 Stunden Fermentation von pH 7,1 auf pH 6,9; steigt dann kontinuierlich bis 160 Stunden bis auf pH 7,62 und wird bei diesem Wert durch Titration mit 30 % Essigsäure bis zum Ende der Fermentation nach 240 Stunden gehalten. Der Gehalt an Apicularen A beträgt am Ende der Fermentation 6,5 mg/1.
B. Gewinnung und Charakterisierung
1. Isolierung
Zellen und Amberlite XAD-16 Adsorberharz (900 g) aus einer 90 1 Fermentation von Chondromyces robustus Stamm Cm r8 wurden durch Zentrifugieren vom Fermentationsüberstand abgetrennt und dreimal mit 1,5 1 Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonex- trakte wurden filtriert und i. Vak. bis zur verbleibenden Wasserphase eingeengt, die bei neutralem pH-Wert mit insgesamt 600 ml Essigsäureethylester in zwei Portionen extrahiert wurde.
Apicularen A: Nach Trocknung mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde die organische Phase i. Vak. eingeengt. Der Rückstand (16 g) wurde in 275 ml Methanol mit 3% Wasser aufgenommen und zweimal mit je 200 ml Heptan extrahiert. Beim Einengen der Methanolphase i. Vak. verblieben 6 g Rohprodukt, das durch Kieselgel-Flashchromatographie aufgetrennt wurde (25 g Kieselgel LiChroprep Si 100,25-40 μ (Merck); Laufmittel : Methylenchlorid 120 ml und Methylenchlorid/Methanol (98:2) 120 ml. Die nach DC- Analytik reinste Produktfraktion wurden i. Vak. zu einem Rückstand (390 mg) eingeengt, der in methanolischer Lösung zu 156
mg Apicularen A kristallisierte. Zur Analytik wurde die Probe aus Methanol umkristallisiert und im Vakuum getrocknet.
Apicularen B: Die mit Essigsäureethylester extrahierte Wasserphase des Rohextraktes wurde anschließend dreimal mit insgesamt 450 ml n-Butanol extrahiert. Die Butanolphase wurde i. Vak. vollständig vom Lösungsmittel befreit und durch RP- Chromatographie (RP-Kieselgel ODS-AQ, 120 Ä, 15 μ (YMC); Laufmittel 45% Methanol in Wasser, Detektion UV-Absorption bei 280 nm) getrennt. Die Produktfraktion wurde i. Vak. zu 85 mg Apicularen B eingeengt. Zur Analytik wurde eine Probe durch Sephadex LH-20 Chromatographie gereinigt.
2.1 Substanzdaten von Apicularen A
DC-Analytik: Aluminiumfolie mit 0,2 mm Kieselgel 60 F254, (Merck, Darmstadt); Laufmittel Methylenchlorid:Methanol (9:1), R£ = 0,39, sichtbar als UV-Löschung bei 254 nm und nach Anfär- bung mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz, rosa-braun nach Erhitzen auf 120 °C. HPLC-Analytik: Säule 2 mm ID, 125 mm Länge mit Vorsäule 11 mm gefüllt mit RP-Kieselgel (Nucleosil 120-5 C1Br 5 μ) (Fa. Ma- cherey-Nagel, Düren); Laufmittel-Gradient mit Methanol:Wasser, 50 % Methanol isokratisch 4 min, dann auf 65 % Methanol in 6 min; Fluß 0,3 ml/min; UV-Detektion bei 278 nm; Rt = 7,7 min. Schmp.: 139-141 °C (Zers.) spez. Drehwert: [α]19 D = -36,1 (c = 1, in Acetonitril) .
UV (Methanol): λm (lg ε) = 278 (4,43).
IR-Spektrum (KBr) : vmax = 3288 (3597, 3510, 3417, 3194, 3067, 3031 sh), 2960, 2932, 2917, 2873, 1725, 1715, 1678, 1654, 1610,
1522, 1464, 1283, 1240, 1217, 1119, 1075, 1060, 957, 869, 803, 778, 722, 634 cm"1.
NMR-Daten: s. Tabelle.
MS: (EI): m/z (%) = 442 (5,4), 441 (23) M+, 423 (2) [M-18] + , 412 (5), 394 (2), 332 (9), 272 (4), 233 (7), 215 (15), 207 (9), 191 (50), 109 (100); (+)-DCI (i-Butan): m/z (%) = 442 (100), 443 (26); (-)-DCI (i-Butan): m/z (%) = 441 (100), 442 (20).
Hochauflösung :
C25H31N06 Ber. 441,2151 Gef. 441,2130 (EI-MS)
CxβH22N06 Ber. 332,1497 Gef. 332,1510 (EI-MS)
C7H90 Ber. 109,0653 Gef. 109,0647 (EI-MS)
2.2 Struktur
DC-Analytik: Aluminiumfolie mit 0,2 mm Kieselgel 60 F254, (Merck, Darmstadt); Laufmittel Methylenchlorid: Methanol (9:1), R£ = 0.1, (8:2), R£ = 0.43, sichtbar als UV-Löschung bei 254 nm und nach Anfärbung mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz, rosabraun nach Erhitzen auf 120°C-
HPLC-Analytik: Säule 2 mm ID, 125 mm Länge mit Vorsäule 11 mm gefüllt mit RP-Kieselgel (Nucleosil 120-5 C1B, 5 μ ) (Fa. Mache- rey-Nagel, Düren); Laufmittel-Gradient mit Methanol: Wasser, 50% Methanol isokratisch 4 min, dann auf 65% Methanol in 6 min; Fluß = 0,3 ml/min; UV-Detektion bei 278 nm; Rf = 3.9 min.- C33H44N2011 M = 644,71 spez. Drehwert: [ ]21 D = -5.5 (c= 0.3, in Methanol ).-
UV (Methanol) : λmax (lg ε) = 280 nm (4,489).-
NMR-Daten: s. Tabelle 2.-
DCI-MS [(+) (i-Butan) ] : m/z( % ) = 645 [M+H],;
DCI-MS [ (-)i-Butan] : m/z( % ) = 644 [14].-
Hochauflösung:
C33H44N2Ou Ber . 644 , 2945 ( 1 ) Gef . 644 . 2985 [ DCI ( - ) ]
3.2 Struktur
OH
C. Wirkungen von Apicularen A
C.l. Cytotoxische Aktivität
Apicularen A hat eine sehr starke cytotoxische Wirkung. Das Wachstum verschiedener humaner und tierischer Zellinien wird vollständig gehemmt. Unter Einfluß von Apicularen A werden abartige Spindelapparate beobachtet. Die Tabelle gibt die Konzentrationen für eine 50 %ige Hemmung [IC50] des Zellwachstums.
ERSATZBWπ (REGEL 26)
Tabelle 1. NMR. -Daten von Apicularen A in [d6] Aceton ('H: 600
MHz, 3C: 150 MHz)
H δ, m J m
1 1 169.28
2 2 125.44
3 3 154.23
4 6.77 dd 8.2,1 4 114.39
5 7.10 dd 8.2,7.7 5 130.20
6 6.69 dd 7.7, 1 6 122.24
7 7 140.15
8a 3.34 dd 14.8,9.8
8b 2.44 dd 14.8, 1.6 (br.) 8 40.26 t
9 3.87 dddd 9.8,8.5,4.8,1.6 9 73.64 d
10a 1.93 ddd 12.8,4.8,4.4
10b 1.48 ddd 12.8,8.5,8.5 10 39.60 t
11 3.98 dddd 8.5, 7.6, 5.3, 4.4 11 64.87 d
12a 1.68 ddd 12.8, 6.5, 5.3
12b 1.52 ddd 12.8,7.6,4.7 12 39.88 t
13 4.25 dddd 10.9,6.5,4.7,2.0 13 68.05 d
14a 1.83 ddd 14.5, 10.9, 10.9
14b 1.57 ddd 14.8,2.5,2.0 14 38.81 t
15 5.42 dddd 10.9,6.5,6.5,2.5 15 74.21
16 2.34 m - 16 36.37
17 5.26 dt 14.5, 7.2 17 108.09
18 6.89 ddt 10.2, 14.5, 1.6 18 126.24
19 19 163.64
20 5.74 ddd 11.6,1.5,1.5 20 120.84
21 6.84 ddd 11.6,11.5,1.3 21 136.77
22 7.51 dddt 11.5,10.9,1.6,1.6 22 125.37
23 5.80 dddt 10.9,1.3,1.1,7.7 23 141.48
24 2.27 ddq 7.7,1.6,7.6 24 21.00
25 1.00 t 7.6 25 14.30
3-OH 8.37 s br.
11-OH 3.79 m -
18-NH 9.08 d 10.2 (br.)
Tabelle 2. NMR-Daten von Apicularen B in [d Methanol
Claims
1. Verbindung der Formel
2. Heterozyklische Verbindung der Summenformel C25H31N06 und mit den folgenden Parametern:
IR-Spektrum (KBr): vmax = 3288 (3597, 3510, 3417, 3194, 3067, 3031 sh), 2960, 2932, 2917, 2873, 1725, 1715, 1678, 1654, 1610, 1522, 1464, 1283, 1240, 1217, 1119, 1075, 1060, 957, 869, 803, 778, 722, 634 cm"1;
UV-Spektrum (CH3OH): λmax (lg ε) = 278 (4,43).
3. Heterozyklische Verbindung, dadurch gewinnbar, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasser-
phase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert, trocknet und den Extrakt im Vakuum zu einem Rohextrakt einengt,
(e) den Rohextrakt mit Methanol und wenig Wasser aufnimmt und mit Heptan extrahiert,
(f ) die Methanolphase im Vakuum einengt,
(g) das gewonnene Rohprodukt durch Kieselgel-Flashchromatographie mit Methylenchlorid und einem Gemisch von Methylenchlorid/Methanol (98:2) als Laufmittel auftrennt,
(h) die anfallenden Fraktionen im Vakuum einengt und
(i) aus Methanol auskristallisiert und im Vakuum trocknet.
4. Verfahren zur Herstellung einer heterozyklischen Verbindung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet ,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert, trocknet und den Extrakt im Vakuum zu einem Rohextrakt einengt,
(e) den Rohextrakt mit Methanol und wenig Wasser aufnimmt und mit Heptan extrahiert,
(f) die Methanolphase im Vakuum einengt,
(g) das gewonnene Rohprodukt durch Kieselgel-Flashchromatographie mit Methylenchlorid und einem Gemisch von Methylenchlo-
rid/Methanol (98:2) als Laufmittel auftrennt,
(h) die anfallenden Fraktionen im Vakuum einengt und
(i) aus Methanol auskristallisiert und im Vakuum trocknet.
5. Verbindung der Formel
6. Heterozyklische Verbindung der Summenformel C33H44N2Ou und mit den folgenden Parametern:
UV (Methanol. : λmax (lg ε) = 280 nm (4,489).- NMR-Daten: s. Tabelle 2.-
7. Heterozyklische Verbindung, dadurch gewinnbar, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit
Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert,
(e) die extrahierte Wasserphase mit n-Botanol extrahiert und die Butanolphase abtrennt,
(f ) die Butanolphase vom Lösungsmittel befreit,
(g) die lösungsmittelfreie Phase einer Umkehrphasen-Chromatographie an RP-Kieselgel mit einem Gemisch von Methanol/Wasser (45:55) als Laufmittel unterwirft und die Fraktion mit einem Gehalt an heterozyklischer Verbindung im UV detektiert und abtrennt und
(h) die abgetrennte Fraktion einengt und die heterozyklische Verbindung gewinnt.
8. Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Chondromyces robustus Stamm Cm r8 DSM 12054 in einem Probion PS, Stärke, MgS04 x 7 H20, CaCl2 x 2 H20, Mineralsalze sowie Cyanocobalamin enthaltenden Medium aerob in Gegenwart eines Ad- sorberharzes kultiviert, wobei der pH einen Wert von 7,62 nicht überschreitet,
(b) Zellen und Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Aceton extrahiert,
(c) den Extrakt filtriert und bis zum Auftreten einer Wasserphase im Vakuum einengt,
(d) die gewonnene Wasserphase bei neutralem pH-Wert mit Ethyl- acetat extrahiert,
(e) die extrahierte Wasserphase mit n-Botanol extrahiert und die Butanolphase abtrennt,
(f ) die Butanolphase vom Lösungsmittel befreit,
(g) die lösungsmittelfreie Phase einer Umkehrphasen-Chromatographie an RP-Kieselgel mit einem Gemisch von Methanol/Wasser (45:55) als Laufmittel unterwirft und die Fraktion mit einem Gehalt an heterozyklischer Verbindung im UV detektiert und abtrennt und
(h) die abgetrennte Fraktion einengt und die heterozyklische Verbindung gewinnt.
9. Cytostatisches Mittel, bestehend aus oder mit einem Gehalt an der heterozyklischen Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, gegebenenfalls neben einem oder mehreren üblichen Trägern und/oder Hilfsmitteln.
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|---|---|---|---|---|
| WO2002012223A3 (en) * | 2000-08-04 | 2002-04-25 | Univ Texas | SYNTHETIC SALICYLIHALAMIDES, APICULARENS AND DERIVATIVES THEREOF |
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| EP1944307A3 (de) * | 2000-08-04 | 2008-07-30 | Board of Regents, The University of Texas System | Synthetische Salicylihalamide, Apicularene und Derivate davon |
| EP2185714A4 (de) * | 2007-08-17 | 2015-12-16 | Genotech Co Ltd | Verfahren zur extraktion und steigerung der ausbeute von tricycloverbindungen durch zugabe eines festen adsorberharzes als deren träger im fermentationsmedium |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3145999A (en) | 1999-10-11 |
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