DE4421113A1 - Chondramide, Gewinnungsverfahren, Mittel mit Chondramiden und Mischkultur zur Chondramid-Gewinnung - Google Patents

Chondramide, Gewinnungsverfahren, Mittel mit Chondramiden und Mischkultur zur Chondramid-Gewinnung

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DE4421113A1
DE4421113A1 DE19944421113 DE4421113A DE4421113A1 DE 4421113 A1 DE4421113 A1 DE 4421113A1 DE 19944421113 DE19944421113 DE 19944421113 DE 4421113 A DE4421113 A DE 4421113A DE 4421113 A1 DE4421113 A1 DE 4421113A1
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Gerhard Prof Dr Hoefle
Rolf Dr Jansen
Brigitte Dr Kunze
Florenz Dr Sasse
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Description

Die Erfindung betrifft Chondramide der Formel
mit den folgenden Bedeutungen:
R¹ = OCH₃ und R² = H oder
R¹ = OCH₃ und R² = Cl oder
R¹ - H und R² = H oder
R¹ = H und R² = Cl und
R³ = ein H-Atom, ein C₁-₈-Alkylrest, ein Arylrest, wie C₆H₆-, ein Alkarylrest, ein heterozyklischer Rest mit einem O-, S- oder N-Atom, ein Formiatrest, ein Hydrogencarbonatrest, ein H₂N- CO-O-Rest, ein C₁-₈-Alkoxyrest, ein Alkaryloxyrest, ein Alk­ oxyalkylrest, wie CH₃-O-CH₂- oder CH₃-O-CH(CH₃)-, oder ein Acyloxyalkylrest, wie Alkyl-CO-O-CH₂-
sowie deren pharmazeutisch akzeptable Alkali- oder Erdalkali­ salze.
Die Chondramide fallen bei der Gewinnung aus Chondromyces croca­ tus-Kulturen mit freier Hydroxylgruppe an (R³ - OH). Zur Derivati­ sierung kann auf Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 4. Auflage, G. Thieme-Verlag, Stuttgart & NY, verwiesen werden.
Ferner betrifft die Erfindung ein Chondramid der Summenformel C₃₆H₄₆N₄O₇ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm] (lg epsilon):
222 (4.56), 279 (3.79), 290 (3.67);
IR; ny [cm-1] : 3354, 1731, 1637, 1516, 1457, 1212.
Ferner betrifft die Erfindung ein Chondramid der Summenformel C₃₆H₄₅ClN₄O₇ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm) (lg epsilon):
222 (4.57), 279 (3.93), 290 (3.76);
IR; ny [cm-1) : 3346, 2931, 1731, 1638, 1517, 1452, 1212.
Ferner betrifft die Erfindung ein Chondramid der Summenformel C₃₅H₄₄N₄O₆ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm) (lg epsilon):
222 (4.60), 279 (3.82), 290 (3.70);
IR; ny [cm-1] : 1727, 1637, 1516, 1457.
Ferner betrifft die Erfindung ein Chondramid der Summenformel C₃₅H₄₃ClN₄O₆ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm] (lg epsilon):
222 (4.52), 279 (3.87), 290 (3.73);
IR; ny [cm-1) : 3407, 1726, 1640, 1516, 1452.
Ferner betrifft die Erfindung Chondramide, die dadurch gewinnbar sind, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8 963 (Mischkultur) in einem Kohlen­ stoffquellen, Stickstoffquellen, wachstumsfördernde Substanzen und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert und
  • (b) die Chondramide in an sich bekannter Weise anreichert, auf­ trennt und isoliert.
Ferner betrifft die Erfindung Chondramide, die dadurch gewinnbar sind, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8963 (Mischkultur) in einem Koh­ lenstoffquellen, Stickstoffquellen, wachstumsfördernden Sub­ stanzen, wie Vitamin B12, und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert,
  • (b) die Zellen vom Kulturmedium als Biofeuchtmasse abtrennt und mit einem aliphatischen Keton, wie Aceton, extrahiert,
  • (c) den wäßrigen Extrakt vom Lösungsmittel befreit und die ver­ bleibende Wasserphase mit Essigester extrahiert,
  • (d) den Extrakt nach fakultativem Trocknen einengt und in einem Methanol/Wasser-Gemisch aufnimmt,
  • (e) das erhaltene flüssige Gemisch mit Heptan extrahiert und die methanolische Phase isoliert,
  • (f) die isolierte methanolische Phase einengt und einer Um­ kehrphase-Mitteldruck-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel (RP = Umkehrphase); Laufmittel Methanol/Wasser-Gemisch, danach Methanol- Gradient bis 100% Methanol;
    und mit Hilfe einer UV-Detektion (beispielsweise Absorption bei etwa 220 nm)
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an einem ersten Chondramid (A) und
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an drei weiteren Chondramiden (B, C und D) gewinnt,
  • (g1) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid A
    • - einer HPLC-Chromatographie:
      Kieselgel;
      Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol; sowie danach
    • - einer Umkehrphase-HPLC-Chromatographie unterwirft:
      RP = Kieselgel;
      Laufmittel Methanol/Wasser;
      und Chondramid A isoliert,
  • (g2) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid B, C und D
  • (g21) einer HPLC-Chromatographie unterwirft:
    Kieselgel;
    Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid B und C sowie
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid C gewinnt,
  • (g22) die gemäß (g21) gewonnenen Fraktionen jeweils einer Umkehr­ phase
    HPLC-Chromatographie unterwirft:
    RP Kieselgel;
    Laufmittel: Methanol/Wasser;
    und Chondramid B und D beziehungsweise C isoliert.
Vorzugsweise sind die Chondramide dadurch gewinnbar, daß man bei der Stufe (a) Vitamin B12 als wachstumsfördernde Substanz und/oder ein Medium auf Basis von Einzellerprotein, wie Probion, verwendet und/oder bei etwa 30°C kultiviert.
Vorzugsweise sind die Chondramide dadurch gewinnbar, daß man bei der Stufe (d) in einem Methanol/Wasser-Gemisch (etwa 95 : 5) auf­ nimmt.
Vorzugsweise sind die Chondramide dadurch gewinnbar, daß man bei der Stufe (f) mit einem RP-Kieselgel (beispielsweise C₁₈ und bei­ spielsweise 100 Angström/20 µm) und/oder mit einem Methanol/Was­ ser-Gemisch (etwa 65 : 25) chromatographiert.
Vorzugsweise sind die Chondramide dadurch gewinnbar, daß man bei den Stufen (g1) und/oder (g2) mit Benzin/tertButylmethylether/-Me­ thanol (etwa 30 : 69,5 : 0,5) chromatographiert.
Vorzugsweise sind die Chondramide dadurch gewinnbar, daß man bei der Stufe (g1) und/oder (g2) mit einem RP-Kieselgel (C₁₈) und/oder mit Methanol/Wasser (etwa 60 : 40) chromatographiert.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Chondramid-Gewin­ nung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8 963 (Mischkultur) in einem Kohlen­ stoffquellen, Stickstoffquellen, wachstumsfördernde Substanzen und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert und
  • (b) die Chondramide in an sich bekannter Weise anreichert, auf­ trennt und isoliert.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Chondramid-Ge­ winnung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8963 (Mischkultur) in einem Koh­ lenstoffquellen, Stickstoffquellen, Vitamin B12 und Mineral­ salze enthaltenden Medium aerob kultiviert,
  • (b) die Zellen vom Kulturmedium als Biofeuchtmasse abtrennt und mit Aceton extrahiert,
  • (c) den wäßrigen Extrakt vom Lösungsmittel befreit und die ver­ bleibende Wasserphase mit Essigester extrahiert,
  • (d) den Extrakt trocknet, einengt und in einem Methanol/Wasser-Ge­ misch aufnimmt,
  • (e) das erhaltene flüssige Gemisch mit Heptan extrahiert und die methanolische Phase isoliert,
  • (f) die isolierte methanolische Phase einengt und einer Um­ kehrphase-Mitteldruck-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel (RP = Umkehrphase);
    Laufmittel Methanol/Wasser-Gemisch;
    und mit Hilfe einer UV-Detektion (Absorption bei etwa 220 nm)
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an einem ersten Chondramid (A) und
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an drei weiteren Chondramiden (B, C und D) gewinnt,
  • (g1) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid A
    • - einer HPLC-Chromatographie:
      Kieselgel;
      Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
      sowie danach
    • - einer Umkehrphase-HPLC-Chromatographie unterwirft:
      RP = Kieselgel;
      Laufmittel Methanol/Wasser;
      und Chondramid A isoliert,
  • (g2) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid B, C und D
  • (g21) einer HPLC-Chromatographie unterwirft:
    Kieselgel;
    Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid B und C sowie
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid C gewinnt
  • (g22) die gewonnenen Fraktionen jeweils einer Umkehrphase HPLC-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel;
    Laufmittel: Methanol/Wasser;
    und Chondramid B und D beziehungsweise C isoliert.
Ferner betrifft die Erfindung ein pharmazeutisches Mittel, beste­ hend aus oder enthaltend eins der vorstehend angeführten Chondra­ mide neben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Mittel mit an­ tifungaler und antineoplastischer Wirkung, auch gegen chemothera­ peutika-resistente Zellinien.
Ferner betrifft die Erfindung ein antibiotisches Mittel, bestehend aus oder enthaltend eins der vorstehend angeführten Chondramide neben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Erfindungsgemäße Mittel können eine wirksame Menge, insbesondere eine zur Prophylaxe oder Therapie wirksame Menge, des Wirkstoffs zusammen mit pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffen enthalten, die sich zur topischen, enteralen, beispielsweise oralen oder rek­ talen, oder parenteralen Verabreichung eignen, und anorganisch oder organisch und fest oder flüssig sein können. Zur oralen Ver­ abreichung verwendet man insbesondere Tabletten oder Gelatinekap­ seln, welche den Wirkstoff zusammen mit Verdünnungsmitteln, wie Lactose, Dextrose, Sucrose, Manit, Sorbit, Zellulose und/oder Gly­ zerin, und/oder Schmiermitteln, wie Kieselerde, Talk, Stearinsäure oder deren Salze, wie Magnesium- oder Kalziumstearat, und/oder Po­ lyethylenglykol enthalten. Tabletten können ebenfalls Bindemittel, wie Magnsesiumaluminiumsilikat, Stärken, wie Mais-, Weizen- oder Reisstärke, Gelatine, Methylzellulose, Natriumcarboxymethyl­ zellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon, und gegebenenfalls Sprengmittel, wie Stärken, Agar, Alginsäure oder deren Salze, wie Natriumalginat, und/oder Brausemischungen, oder Adsorptionsmittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und/oder Süßmittel enthalten. Ferner kann man pharmazeutisch bzw. pharmakologisch wirksame Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Form von parenteral verabreichbaren Präparaten oder von Infusionslösungen verwenden. Solche Lösungen sind vorzugsweise isotonische wäßrige Lösungen oder Suspensionen, wobei diese beispielsweise bei lyophilisierten Präparaten, welche den Wirkstoff allein oder zusammen mit einem Trägermaterial enthalten, beispielsweise Mannit, vor Gebrauch hergestellt werden können. Die pharmazeutischen Mittel bzw. Präparate können sterilisiert sein und/oder Hilfsstoffe, wie Konservier-, Stabili­ sier-, Netz- und/oder Emulgiermittel, Löslichkeitsvermittler, Salze zur Regulierung des osmotischen Drucks und/oder Puffer ent­ halten. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel, die gegebe­ nenfalls weitere pharmakologisch wirksame Stoffe, wie Antibiotika, enthalten können, werden in an sich bekannter Weise, beispiels­ weise mit Hilfe konventioneller Misch-, Granulier-, Dragier-, Lö­ sungs- oder Lyophilisierungsverfahren, hergestellt und enthalten beispielsweise etwa 0,01 bis 90%, im Fall von Lyophilisaten bis 100%, insbesondere etwa 0,1 bis etwa 50%, in erster Linie 1 bis 30% des bzw. der Wirkstoffe, wobei eine Wirkstoffkonzentration unterhalb von 1% insbesondere für topisch zu applizierende Präparate geeignet ist.
Schließlich betrifft die Erfindung Chondromyces crocatus DSM 8963 (Mischkultur) oder einen davon abgeleiteten Stamm.
Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert, insbesondere durch experimentelle Daten.
A. Produktionsbedingungen
  • A.1. Produzierende Kultur
    Das Bakterium Chondromyces crocatus, Stamm Cm c2, Unterord­ nung Sorangineae, Ordnung Myxobacterales, kontamiert mit kleinen Stäbchen eines unbekannten Begleitbakteriums.
  • A.2. Herkunft der produzierenden Mischkultur: Isoliert im Juni 1985 an der GBF aus einer Bodenprobe von Madeira.
  • A.3. Beschreibung der produzierenden Mischkultur
  • A.3.1. Die vegetativen Zellen von Cm c2 sind zylindrisch mit breit abgerundeten Enden, 0,8 × 6 bis 8 µm. Auf festen Nährböden wächst der Organismus in Gegenwart des Begleitbakteriums gut auf Hefeagar, z. B. VY/2 Agar (Backhefe 0,5%, bezogen auf Frischgewicht; CaCl₂·2H₂O 0,1%, Cyanocobalamin 0,5 mg/l, Agar 1,5%; pH 7,2). Auf reinen Glucose-Mineralsalz- Medien ist kein Wachstum zu beobachten. Proteine, z. B. Ca­ sein oder Einzellerprotein, werden hydrolysiert. Chitin wird nicht angegriffen. Der Stamm wächst bevorzugt bei 30 °C, im neutralen pH-Bereich und aerob. Auf geeigneten Nähr­ boden breitet sich die Kolonie allmählich über die Kultur­ platte aus. Auf der Oberfläche bilden sich kurze breite ra­ diale Gräben. Sind Hefezellen im Nährboden vorhanden, wer­ den sie weitgehend abgebaut. Nach einigen Tagen können Fruchtkörper von 500 bis 1000 µm Höhe entstehen: Diese bestehen aus orangefarbenen Sporangiolen, von 20 bis 30 µm Durchmesser und 30 bis 45 µm Länge, die auf einem verzweigten weißen Stiel sitzen. Im Innern der Sporangiolen findet man Myxosporen, die morphologisch den vegetativen Zellen sehr ähneln, physiologisch aber trocknungsresistente Ruhezellen darstellen.
    In Flüssigmedien wächst der Stamm, bevorzugt bei 30°C, in kleinen Zellklümpchen, sowohl in Schüttelkolben bei 160 Upm (100 ml Medium in 250 ml Erlenmeyerkolben bzw. 400 ml Me­ dium in 1000 ml Erlenmeyerkolben), als auch in Bioreaktoren (getestet bis zum 300 l Maßstab). Als Kulturmedium ist z. B. Poll-Medium geeignet: Probion PS (Einzellerprotein aus Methylomonas clarae; Hoechst, Frankfurt) 0,4%; Stärke 0,3 %; MgSO₄·7H₂O 0,1%; CaCl₂·2H₂O 0,05%; 1 ml/l Standard- Spurenelementlösung und 1 ml/l Standardvitaminlösung (bei­ des Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie); pH 7,0. Die Kul­ turen werden bei 30°C über 3 bis 4 Tage gehalten. Der Stamm wächst auch gut in Kulturmedien auf der Basis von So­ jamehl. Nach Abtrennung des unten beschriebenen Begleitbak­ teriums wächst Stamm Cm c2 wesentlich schlechter und ly­ siert nach wenigen Passagen.
    Stamm Cm c2 läßt sich konservieren: z. B. durch Einfrieren vegetativer Zellen von Agarplatten oder Flüssigkulturen in Peptonlösung bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff.
  • A.3.2. Bei dem Begleitbakterium von Chondromyces crocatus, Stamm Cm c2 handelt es sich um ein gramnegatives Stäbchen. Es läßt sich durch Ausstreichen der Mischkultur auf Komplett­ nährböden, z. B. Nutrient Agar, von Cm c2 abtrennen. Auf diesen Nährböden vermehrt es sich nur langsam. In den unter A.3.1. genannten Flüssigmedien vermehrt sich das Bakterium in etwa parallel zu Stamm Cm c2 und überwächst diesen nicht.
  • A.4. Leistungen der produzierenden Mischkultur: In Zellextrakten von Cm c2 ist eine antibiotische Aktivität gegen Hefen (z. B. Candida albicans) nachweisbar. Die aktiven Substanzen wurden Chondramide genannt. In Zellextrakten des von der Mischkultur abgetrennten Begleitbakteriums ist keine anti­ biotische Aktivität nachweisbar.
  • A.5. Zugänglichkeit der Mischkultur: Cm c2 (plus Begleitbakte­ rium) ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig unter der Nr. DSM 8963 hinterlegt.
  • A.6. Nachweis der Chondramide: Zum qualitativen Nachweis der Chondramide werden Zellmassen der produzierenden Kultur mit Aceton extrahiert. Aliquote der konzentrierten Extrakte werden im Agardiffusionstest gegen Candida albicans ge­ testet. Im dünnschichtchromatischen Test werden die ver­ schiedenen Chondramide (A bis D) im Vergleich mit isolier­ ter Reinsubstanz indentifiziert. Die Aufarbeitung, Isolie­ rung und chemische Charakterisierung erfolgt gemäß Ab­ schnitt B.
  • A.7. Produktionsbedingungen der Chondramide: In Schüttelkolben werden die Chondramide während des Wachstums gebildet und erreichen nach 3 bis 4 Tagen am Ende der logarithmischen bis zur frühen stationären Phase die höchste Aktivität.
Fermentationsbeispiel im Bioreaktor
Bioreaktor (300 l) der Fa. Braun Melsungen mit 2 × Intermagrührer und 250 l Inhalt. Medium: Probion PS (Einzellerprotein aus Methy­ lomonas clarae; Hoechst, Frankfurt) 0,4%; MgSO₄·7H₂O 0,1%; CaCl₂·2H₂O 0,05%; Standard-Spurenelementlösung 1 ml/l (Schlegel, Allgemeine Mikrobiologie) und 0,23 mg/l Cyanocobalamin; pH 7,0. 200 l Medium werden mit 50 l Kultur einer gut gewachsenen Kultur aus einem Vorfermenter beimpft. Die bevorzugte Kultivierungstempe­ ratur ist 30°C. Die Belüftungsrate wird auf 33 Normliter/Minute, die Drehzahl auf 100 UpM eingestellt. Wegen starker Schaumbildung des Mediums werden zusätzlich 0,05% des Antischaummittels Tegosi­ pon (Fa. Goldschmidt, Essen) zugesetzt. Der pO₂-Wert, der zu Be­ ginn der Fermentation 90% Sättigung beträgt, sinkt bis zum Ende der Fermentation nach 66 Stunden kontinuierlich bis auf 60%. Der pH-Wert steigt im Verlauf der Fermentation von 7,0 auf 7,5 an.
B. Isolierung und Charakterisierung 1. Isolierung
Durch Zentrifugieren einer 250 l Kultur des Stammes Cm c2 wurden ca. 2,8 kg Biofeuchtmasse gewonnen und anschließend nacheinander mit 9 l und 6 l Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonextrakte wurden durch Filtrieren von Feststoffen befreit und im Vakuum bis zur verbleibenden Wasserphase eingeengt. Diese wurde mit Essig­ ester extrahiert. Der Extrakt wurde mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand (32 g) wurde in 500 ml Me­ thanol/Wasser (95 : 5) aufgenommen und mit 800 ml Heptan extrahiert. Nach Einengen der Methanolphase im Vakuum verblieben 11,7 g Rohprodukt, das in 3 Portionen durch Reversed-Phase- Mitteldruckchromatographie [Glas-Säule: 60 mm ID, 530 mm Länge (Fa. Kronwald Separationstechnik, Sinsheim) gefüllt mit RP-Kiesel­ gel Eurosil Bioselect 100-20 C₁₈, 15 bis 25 µm; (Fa. Knauer, Ber­ lin); Laufmittel: Methanol/Wasser 65 : 25 für 140 min, dann Gradient auf 80% Methanol in 90 min, 80% Methanol für 100 min und Gradi­ ent auf 100% Methanol in 60 min, Fluß = 36 ml/min; Detektion: UV- Absorption bei 254 nm) aufgetrennt wurde. Die Peaks bei tR = 63 min (Fraktion 1) und tR = 71 min (Fraktion 2) wurden ohne die vor­ laufende Schulter vereinigt, im Vakuum zur verbleibenden Wasser­ phase eingeengt und mit Methylenchlorid extrahiert.
Der Rückstand aus Fraktion 1 (176 mg) wurde in zwei Portionen durch Si-HPLC (s. u.) (Fluß = 13 ml/min) gereinigt. Die Fraktionen des Hauptpeaks bei ca. tR = 15 min wurden vereinigt und im Vakuum zu 60 mg rohem Chondramid A eingeengt. Durch RP-HPLC (s. u.) (Fluß = 13 ml/min) wurden daraus 46 mg reines Chondramid A (tR = 29 min) isoliert. Fraktion 2 (540 mg) wurde in 5 Portionen durch Si-HPLC (s. u.) (Fluß = 14 ml/min) in Fraktion 2.1 (tR = 10 min, 120 mg) und Fraktion 2.2 (tR = 15,5 min, 171 mg) aufgetrennt. Fraktion 2.1 wurde in zwei Chromatographieläufen durch RP-HPLC (s. u.) (Fluß = 13 ml/min) in 61 mg Chondramid B (tR = 36,5 min) und 14 mg Chon­ dramid D (tR = 52 min) aufgetrennt.
Fraktion 2.2 wurde in zwei Chromatographieläufen durch RP-HPLC (s. u.) (Fluß = 14 ml/min) in weitere 35 mg Chondramid A (tR = 28 min) und 86 mg Chondramid C (tR = 39 min) aufgetrennt.
Si-HPLC: Säule: 20,5 mm ID, 250 mm Länge, Kieselgel (Nucleosil 100, 7 µm, Fa. Macherey-Nagel, Düren); Laufmittel: Benzin/tert.- Butylmethylether/Methanol 30 : 69, 5 : 0,5; Detektion: UV-Absorption bei 220 nm.
RP-HPLC: Säule 20,5 mm ID, 250 mm Länge, RP-Kieselgel (Nucleosil C₁₈, 7 µm, Fa. Macherey-Nagel, Düren); Laufmittel: Methanol/Wasser 60 : 40; Detektion: UV-Absorption bei 220 nm.
2. Strukturen
3. Charakterisierung der Chondramide
DC: Aluminiumfolie mit 0,2 mm Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merck, Darm­ stadt); Laufmittel Toluol/Ethanol (9 : 1), Chondramid A Rf = 0,19, Chondramid B Rf = 0,25, Chondramid C Rf = 0,20, Chondramid A Rf = 0,26, und Methylenchlorid/Methanol (9 : 1) alle Rf = 0,46, UV- Löschung bei 254 nm, Anfärbung mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz, Chondramid A und C violett, Chondramid B und D hellblau nach kur­ zem Erhitzen auf 120°C.
HPLC-Analytik: Säule 2 mm ID, 125 mm Länge mit Vorsäule 11 mm (Fa. Macherey-Nagel, Düren) gefüllt mit RP-Kieselgel (Nucleosil 120-5 C₁₈, 5 µm); Laufmittelgradient mit Methanol/Wasser, 65% auf 95% Methanol in 8 min, danach 95% Methanol isokratisch, Fluß = 0,3 ml/min, UV-Detektion bei 222 nm, Chondramid A tR = 3,88 min; Chon­ dramin B tR = 4,27 min; Chondramid C tR = 4,37 min; Chondramid D tR = 4,81 min.
Spez. Drehwerte [α] der Chondramide in Methanol
UV-Daten der Chondramide in Methanol
IR-Daten der Chondramide {( [cm-1] Intensität}
NMR-Daten der Chondramide
¹H-NMR Daten der Chondramide in [d₆] DMSO [600 MHz]
¹³C-NMR Daten der Chondramide in [d₆]DMSO [150 MHz]
MS-Daten der Chondramide Chondramid A
El-MS (70 eV, 180°C): m/z (%)= 646 (12) [M⁺], 616 (1), 574 (1), 525 (3), 485 (3), 436 (1), 356 (11), 291 (42), 267 (9), 236 (5), 208 (7), 173 (19), 170 (100), 130 (26).-
(+)-FAB-MS (3-NBA): m/z (%) = 669 (100) [(M + Na)⁺], 647 (38) [(M + H)⁺].-
Hochauflösung: Ber. 646.3367 Gef. 646.3388 C₃₆H₄₆N₄O₇.
Chondramid B
El-MS (70 eV, 190°C): m/z (%)= 682 (2.7), 680 (6.4), 645 (100), 615 (2), 559 (15), 544 (6), 517 (3), 485 (9), 470 (4), 461(53), 430 (5), 356 (39), 325 (38), 267 (68), 236 (36), 208 (31), 207 (50), 204 (62), 185 (11), 171 (18), 164 (33), 150 (10), 137(11), 122 (25).-
(+)-FAB-MS (3-NBA): m/z (%) = 681(59) [(³⁵Cl-M + H)⁺], 682 (16), 683 (15) [(³⁷Cl-M + H)⁺], 645 (15)[(M-Cl)⁺], 169 (100).- (-)-FAB-MS (3-NBA): m/z (%) = 833 (10) [(M + 3-NBA - H)-], 679 (100) [(³⁵Cl-M - H)-], 680 (40), 681 (36) [(³⁷Cl-M - H)-].-
Hochauflösung: Ber. 680.2977 Gef. 680.2971 C₃₆H₄₅³⁵ClN₄O₇.
Chondramid C
El-MS (70 eV, 190°C): m/z (%)= 616 (100), 577 (1), 487 (3), 446 (94), 415 (3), 350 (8), 267 (41), 236 (24), 235 (10), 208 (23), 186 (13), 173 (22), 170 (29), 162 (35), 130 (39).-
Hochauflösung: Ber. 616.3261 Gef. 616.3260 C₃₅H₄₄N₄O₆.
Chondramid D
El-MS (70 eV, 200 °C): m/z (%)= 650 (0.5) [(M³⁵Cl)⁺], 615 (17), 487 (0.5), 431(8), 400 (2), 349 (2), 267 (13), 236 (9), 208 (8), 207(6), 185 (10), 171(5), 149 (11), 145 (16), 129 (8), 111(12), 109(8).-
Cl-MS (i-Butan): m/z (%)= 651 (3.01) [(³⁵Cl-M + H)⁺], 652 (1.02) [(¹³C³⁵Cl-M + H)⁺], 653 (1.16) [(³⁷Cl-M + H)⁺], 152 (100).-
Hochauflösung: Ber. 650.2871 Gef. 650.2857 C₃₅H₄₃ClN₄O₆
C. Biologische Charakterisierung der Chondramide C.1. Antimikrobielle Aktivität
Die antibiotische Aktivität wird im Agardiffusionstest anhand der Hemmhofdurchmesser bestimmt. Die Chondramide hemmen das Wachstum einiger Hefen. Chondramide sind mit 20 µg/Testblättchen wirksam gegen:
C.2. Cytostatische Aktivität
Die vier Chondramide wirken gegen Säugerzellen in Kulturen im gleichen Konzentrationsbereich und hemmen auch das Wachstum von Zellinien, die gegen andere Cytostatika restistent sind.
D. Formulierungsbeispiel
Tabletten, enthaltend 20 mg an Wirkstoff, und zwar eines der erfindungsgemäßen Chondramide, werden in folgender Zusammen­ setzung in üblicher Weise hergestellt:
Zusammensetzung
Menge
Wirkstoff|20 mg
Weizenstärke 60 mg
Milchzucker 50 mg
kolloidale Kieselsäure 5 mg
Talk 9 mg
Magnesiumstearat 1 mg
insgesamt 145 mg
Zur Herstellung wird der Wirkstoff mit einem Teil der Weizen­ stärke, mit Milchzucker und mit kolloidaler Kieselsäure ver­ mischt, wonach die Mischung durch ein Sieb getrieben wird. Ein weiterer Teil der Weizenstärke wird mit der 5-fachen Menge Wasser auf dem Wasserbad verkleistert, und die Pulver­ mischung wird mit diesem Kleister angeknetet, bis eine schwach plastische Masse entstanden ist.
Die plastische Masse wird durch ein Sieb einer Maschenweite von etwa 3 mm gedrückt und getrocknet, und das erhaltene trockene Granulat wird nochmals durch ein Sieb getrieben. Darauf werden die restliche Weizenstärke, Talk und Magnesium­ stearat zugemischt und die Mischung zu Tabletten von 145 mg Gewicht mit Bruchkerbe verpreßt.

Claims (18)

1. Chondramide der Formel mit den folgenden Bedeutungen:
R¹ = OCH₃ und R² = H oder
R¹ = OCH₃ und R² = Cl oder
R¹ = H und R² = H oder
R¹ = H und R² = Cl und
R³ = ein H-Atom, ein C1-8-Alkylrest, ein Arylrest, ein Aralkyl­ rest, ein heterozyklischer Rest mit einem O-, S- oder N-Atom, ein Formiatrest, ein Hydrogencarbonatrest, ein H₂N-CO-O-Rest, ein C1-8-Alkoxyrest, ein Alkaryloxyrest, ein Alkoxyalkylrest oder ein Acyloxyalkylrest,
sowie deren pharmazeutisch akzeptable Alkali- oder Erdalkali­ salze.
2. Chondramid der Summenformel C₃₆H₄₆N₄O₇ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm] (lg epsilon):
222 (4.56), 279 (3.79), 290 (3.67); IR; ny [cm-1): 3354, 1731, 1637, 1516, 1457, 1212.
3. Chondramid der Summenformel C₃₆H₄₅ClN₄O₇ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm] (lg epsilon):
222 (4.57), 279 (3.93), 290 (3.76);
IR; ny [cm-1]: 3346, 2931, 1731, 1638, 1517, 1452, 1212.
4. Chondramid der Summenformel C₃₅H₄₄N₄O₆ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm] (lg epsilon):
222 (4.60), 279 (3.82), 290 (3.70);
IR; ny [cm-1]: 1727, 1637, 1516, 1457.
5. Chondramid der Summenformel C₃₅H₄₃ClN₄O₆ und mit den folgenden Spektren:
UV (Methanol); lambdamax [nm] (lg epsilon):
222 (4.52), 279 (3.87), 290 (3.73);
IR; ny [cm-1): 3407, 1726, 1640, 1516, 1452.
6. Chondramide, dadurch gewinnbar, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8 963 (Mischkultur) in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, wachstumsfördern­ de Substanzen und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert und
  • (b) die Chondramide in an sich bekannter Weise anreichert, auftrennt und isoliert.
7. Chondramide, dadurch gewinnbar, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8963 (Mischkultur) in einem Koh­ lenstoffquellen, Stickstoffquellen, wachstumsfördernde Sub­ stanzen und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kulti­ viert,
  • (b) die Zellen vom Kulturmedium als Biofeuchtmasse abtrennt und mit einem aliphatischen Keton, wie Aceton, extrahiert,
  • (c) den wäßrigen Extrakt vom Lösungsmittel befreit und die ver­ bleibende Wasserphase mit Essigester extrahiert,
  • (d) den Extrakt nach fakultativem Trocknen einengt und in einem Methanol/Wasser-Gemisch aufnimmt,
  • (e) das erhaltene flüssige Gemisch mit Heptan extrahiert und die methanolische Phase isoliert,
  • (f) die isolierte methanolische Phase einengt und einer Um­ kehrphase-Mitteldruck-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel (RP = Umkehrphase);
    Laufmittel Methanol/Wasser-Gemisch, danach Methanol- Gradient bis 100% Methanol;
    und mit Hilfe einer UV-Detektion (beispielsweise Absorption bei etwa 220 nm)
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an einem ersten Chondramid (A) und
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an drei weiteren Chondramiden (B, C und D) gewinnt,
  • (g1) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid A
    • - einer HPLC-Chromatographie: Kieselgel;
      Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
      sowie danach
    • - einer Umkehrphase-HPLC-Chromatographie unterwirft:
      RP = Kieselgel;
      Laufmittel Methanol/Wasser;
      und Chondramid A isoliert,
  • (g2) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid B, C und D
  • (g21) einer HPLC-Chromatographie unterwirft:
    Kieselgel;
    Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid B und C sowie
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid C gewinnt,
  • (g22) die gemäß (g21) gewonnenen Fraktionen jeweils einer Um­ kehrphase-
    HPLC-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel;
    Laufmittel: Methanol/Wasser;
    und Chondramid B und D beziehungsweise C isoliert.
8. Chondramide nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (a) Vitamin B12 als wachstumsfördernde Sub­ stanz und/oder ein Medium auf Basis von Einzellerprotein, wie Probion, verwendet und/oder bei etwa 30°C kultiviert.
9. Chondramide nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gewinnbar, daß man bei der Stufe (d) in einem Methanol/Wasser-Gemisch (etwa 95 : 5) aufnimmt.
10. Chondramide nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gewinn­ bar, daß man bei der Stufe (f) mit einem RP-Kieselgel (beispielsweise C₁₈ und beispielsweise 100 Angström/20 m) und/oder mit einem Methanol/Wasser-Gemisch (etwa 65 : 25) chromatographiert.
11. Chondramide nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gewinn­ bar, daß man bei den Stufen (g1) und/oder (g2) mit Ben­ zin/tert-Butylmethylether/Methanol (etwa 30 : 69,5 : 0,5) chromatographiert.
12. Chondramide nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch ge­ winnbar, daß man bei der Stufe (g1) und/oder (g2) mit einem RP-Kieselgel (C₁₈) und/oder mit Methanol/Wasser (etwa 60 : 40) chromatographiert.
13. Verfahren zur Chondramid-Gewinnung, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8 963 (Mischkultur) in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, wachstumsfördernde Substanzen und Mineralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert und
  • (b) die Chondramide in an sich bekannter Weise anreichert, auftrennt und isoliert.
14. Verfahren zur Chondramid-Gewinnung, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • (a) Chondromyces crocatus DSM 8963 (Mischkultur) in einem Koh­ lenstoffquellen, Stickstoffquellen, Vitamin B12 und Mine­ ralsalze enthaltenden Medium aerob kultiviert,
  • (b) die Zellen vom Kulturmedium als Biofeuchtmasse abtrennt und mit Aceton extrahiert,
  • (c) den wäßrigen Extrakt vom Lösungsmittel befreit und die ver­ bleibende Wasserphase mit Essigester extrahiert,
  • (d) den Extrakt trocknet, einengt und in einem Methanol/Wasser- Gemisch aufnimmt,
  • (e) das erhaltene flüssige Gemisch mit Heptan extrahiert und die methanolische Phase isoliert,
  • (f) die isolierte methanolische Phase einengt und einer Um­ kehrphase-Mitteldruck-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel (RP = Umkehrphase);
    Laufmittel Methanol/Wasser-Gemisch;
    und mit Hilfe einer UV-Detektion (Absorption bei etwa 220 nm)
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an einem ersten Chondramid (A) und
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an drei weiteren Chondramiden (B, C und D) gewinnt,
  • (g1) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid A
    • - einer HPLC-Chromatographie:
      Kieselgel;
      Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
      sowie danach
    • - einer Umkehrphase-HPLC-Chromatographie unterwirft:
      RP = Kieselgel;
      Laufmittel Methanol/Wasser;
      und Chondramid A isoliert,
  • (g2) die Fraktion mit dem überwiegenden Gehalt an Chondramid B, C und D
  • (g21) einer HPLC-Chromatographie unterwirft:
    Kieselgel;
    Laufmittel: Benzin/tert-Butylmethylether/Methanol;
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid B und C sowie
    • - eine Fraktion mit einem überwiegenden Gehalt an Chondramid C gewinnt,
  • (g22) die gewonnenen Fraktionen jeweils einer Umkehrphase- HPLC-Chromatographie unterwirft:
    RP-Kieselgel;
    Laufmittel: Methanol/Wasser;
    und Chondramid B und D beziehungsweise C isoliert.
15. Pharmazeutisches Mittel, bestehend aus oder enthaltend ein Chondramid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 neben einem üb­ lichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
16. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 15 mit antifungaler und antineoplastischer Wirkung, auch gegen chemotherapeutika-re­ sistente Zellinien.
17. Antibiotisches Mittel, bestehend aus oder enthaltend ein Chon­ dramid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 neben einem üblichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
18. Chondromyces crocatus DSM 8963 (Mischkultur) oder ein davon abgeleiteter Stamm.
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