DE2723225A1

DE2723225A1 - Phytochinoid mit der bezeichnung jacaranon

Info

Publication number: DE2723225A1
Application number: DE19772723225
Authority: DE
Inventors: Geoffrey Alan Cordell; Norman Robert Farnsworth; Masaru Ogura
Original assignee: University of Illinois
Current assignee: University of Illinois
Priority date: 1976-05-24
Filing date: 1977-05-23
Publication date: 1977-12-15
Also published as: JPS5320410A; US4078145A

Description

PFEr-IMlMQ - MAAS MEINIG - LEMKE - SPOTT

8CHLEIf:3HEIMEHSTR. 299 βΟΟΟ MÜNCHEN 40

GBO O96

University of Illinois Foundation, Urbana, Illinois, V.St.A.

Phytochinoid mit dar Bezeichnung Jacaranon

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Es wird ein neues Phytochinoid mit der Bezeichnung Jacaranon beschrieben, das man erhält, indem man die Pflanze Jacaranda caucana (Bignoniaceae) mit Alkohol extrahiert und den dabei erhaltenen Extrakt durch Lösungsmittelextraktion fraktioniert und chromatographiert. Das auf diese Weise erhaltene Material ist antitumoral wirksam, wie entsprechende in vivo-Untersuchungen gegenüber dem lymphozytären Leukämiesystem P-388 gezeigt haben.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein neues Phytochinoidderivat mit antitumoraler Wirkung. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein neues Phytochinoidderivat, das aus Zweig-Blatt-Teilen und Stamm-Rinden-Teilen von Jacaranda caucana Pittier isoliert worden ist, sowie auf ein Verfahren zu seiner Isolierung.

Pflanzen der Spezies Jacaranda gibt es in Zentralamerika, dem Norden von Südamerika und den Westindischen Inseln. Man kennt etwa 74 Jacaranda-Spezies, doch ist dieser Pflanzengenus bis heute nur wenig untersucht worden. Aus Cancer Res. 22:981 (1963) geht hervor, daß sich ein wässriger Extrakt von Jacaranda lasiogyne in dem System L-1210 als antitumoral wirksam erwiesen hat. Eine systematische Untersuchung der Flora des Dhawar-Gebietes zeigte, daß die Blätter der Jacaranda mimosifolia Alkaloidspuren enthalten (J. Karnatak Univ. 14:49 (1969).

Es wurde nun gefunden, daß ein Methanolextrakt der Zweig-Blatt-Teile und der Stamm-Rinde-Teile von Jacaranda caucana gegenüber dem lymphozytären Leukämiesystem P-383 in vivo äußerst stark antitumoral wirksam ist. Der dabei erhaltene Methanolextrakt wurde weiter fraktioniert, indem man ihn mit Wasser verdünnte und dann zuerst mit Petroläther und anschließend mit Chloroform extrahierte. Dieses Verfahren führte zu 4 Fraktionen: Einer in Petroläther löslichen Fraktion, einer in Chloroform löslichen Fraktion, einer in einem Gemisch aus Chloroform und Wasser unlöslichen Fraktion und einer in Wasser löslichen Fraktion. Die in der folgenden Tabelle I angeführten bio-

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logischen Beurteilungswerte für die einzelnen Fraktionen zeigen, daß sowohl bei den Stamm-Rinde-Teilen als auch den Zweig-Blatt-Teilen der größte Teil der Aktivität in der in Chloroform löslichen Fraktion vorliegt.

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Tabelle I

„-, ^·ι m j. ι - -ι · ι. . τ, ^. ι -j-^ löslich in CHCl- unlöslich in CHCl -.Wasser ,-,... Pflanzenteil Tumorsystem löslich in Petroläther 3 3 löslich in Wasser

CD CO 00

J. caucana	P-388^a	200/106	200/134	200/123	200/134
Stamm-Rinde J. caucana	9KB^b P-388	100 200/123	8,3 200/163	8,6 200/125	1 200/115
Zweig-Blatt	9KB	100	7,6	2,3	100

Dosis in mg/kg / T/C

ED₁. -Wert in Mg/ml

Durch eine chromatographische Aufarbeitung des aus Zweig-Blatt-Teilen der Pflanze erhaltenen und in Chloroform löslichen Materials über Silicagel (Florisil) gelangt man zu 5 Fraktionen. Entsprechende Untersuchungen zeigen dabei, daß die Antitumorwirksamkeit in den ersten beiden Fraktionen konzentriert ist. Durch weitere chromatographische Aufarbeitung einer jeden dieser beiden Fraktionen gelangt man zu einem fahlgelben öl, das mit dem Namen Jacaranon bezeichnet worden ist. Dieses öl kristallisiert beim Stehen langsam, doch sind entsprechende Versuche zur Umkristallisierung dieses Materials bis heute ergebnislos verlaufen. Das NMR-Spektrum dieses Materials weist auf die Gegenwart einer Methoxygruppe (delta = 3,740 ppm) und einer freien Methylenfunktion (delta = 2,713 ppm) hin. Nach Zugabe von D₃O verschwindet ein breites Singlett bei delta = 4,120. Die Zuordnung dieser Absorption zu einer Hydroxygruppe wird durch das Infrarotspektrum bestätigt, das bei 3320 cm eine starke breite Absorption zeigt. Zwei Gruppen von Multipletts, in denen jeweils zwei Protonen zusammengefaßt und die bei delta = 6,167 und 6,981 ppm zentriert sind, zeigen eine vorherrschende Kupplungskonstante von 8,8 Hz. Dieses Verhalten ist für ein 1,4-subötiLuierLes aromatisches System charakteristisch und wird durch das Infrarotspektrum bestätigt, in dem sich bei 865 cm eine starke Absorption zeigt. Im Carbonylbereich des Infrarotspektrums läßt sich die Methoxygruppe als Esterfunktion (1745 cm"¹) deuten. Die bei 1680 und 1635 cm"¹ auftretenden Banden lassen sich einem p-chinoiden System zuordnen.

Eine massenspektroskopische Untersuchung von Jacaranon unter hoher Auflösung ergibt eine Molekularformel von CqH_1nO₄. Die Sauerstoffatome von Jacaranon stammen von Hydroxy-, Ester- und Chinoidfunktionen, und die Kohlenstoffatome kommen von einem sechsgliedrigen Ring, sowie von Methylen- und Carbomethoxygruppen.

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Auf Basis obiger Beobachtungen wird dem Jacaranon folgende Struktur zugeordnet:

CH₂CO₂CH₃

Die Erfindung wird anhand folgender Ausführungen weiter erläutert:

Pflanzenmaterial

Zweig-Blatt-Fraktionen und Stamm-Rinde-Fraktionen von Jacaranda caucana Pittier sind im Februar 1974 in Columbien gesammelt worden. Das entsprechende Material ist an der Luft getrocknet worden. Eine Herbariumprobe hiervon ist im Herbarium der National Arboretum, Agricultural Research Service, U. S. Department of Agriculture, Washington, D. C. hinterlegt worden.

Extraktionsverfahren

Man extrahiert jeweils etwa 1 kg der jeweiligen gemahlenen Pflanzenzteile jeweils getrennt durch Perkolation mit Methanol bei Raumtemperatur. Für Arbeiten in großem Maßstab extrahiert man Stamm-Rinde-Material (22 kg) und Zweig-Blatt-Material (2 4 kg) getrennt mit Methanol in einer Soxhlet-Apparatur.

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Vorfraktionierung

Die durch Extraktion von 1,3 kg der Zweig-Blatt-Pflanzenteile von J. caucana erhaltene Methanolösung wird zu einem zähen Sirup eingedampft und mit Wasser (2 Liter) versetzt, worauf man das Gemisch mit Petroläther (5 Liter) extrahiert. Durch nachfolgendes Verdampfen des Petrolätherextrakts unter Vakuum erhält man 15,9 g eines Rückstands. Die wässrige Schicht extrahiert man mit Chloroform(2 χ 1 Liter) worauf man die Chloroformschicht trocknet (Natriumsulfat), filtriert und unter Vakuum eindampft, wodurch man 52,5 g Rückstand erhält. Durch Filtrieren der wässrigen Schicht gelangt man zu einem in Chloroform-Wasser unlöslichen Rückstand (12 g). Die filtrierte wässrige Schicht wird lyophilisiert.

Die durch Extraktion von 870 g Stamm-Rinde-Pflanzenteilen von J. caucana erhaltene Methanollösung wird zu einem zähen Sirup eingedampft und mit Wasser (800 ml) versetzt, worauf man das Gemisch mit Petroläther (2 Liter) extrahiert. Durch nachfolgendes Verdampfen des Petrolätherextrakts unter Vakuum gelangt man zu 6,6 g Rückstand. Die wässrige Schicht wird mit Chloroform (2 χ 400 ml) extrahiert, worauf man die Chloroformschicht trocknet (Natriumsulfat), filtriert und unter Vakuum eindampft, wodurch man 7,64 g Rückstand erhält. Durch Filtrieren der wässrigen Schicht gelangt man zu einem in Chloroform-Wasser unlöslichen Rückstand (4,5 g). Die filtrierte wässrige Schicht wird lyophilisiert.

Biologische Untersuchung der Erstfraktionen

Die vier aus jedem Pflanzenteil erhaltenen Erstfraktionen untersucht man bezüglich ihrer in vivo-Wirksamkeit gegenüber dem lymphozytären Leukämiesystem P-388 sowie gegenüber dem Karzinom 9KB des Nasopharynx in einer Zellkultur. Die dabei

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erhaltenen Ergebnisse sind in der oben angeführten Tabelle I zusammengefaßt. Sie zeigen, daß die Aktivität in dem in Chloroform löslichen Material konzentriert ist.

Isolierung und Strukturaufklärung von Jacaranon

Eine Teilmenge (31,2 g) des aus Zweig-Blatt-Teilen der Pflanze erhaltenen chloroformlöslichen Materials chromatographiert man über Silicagel (250 g) (Florisil), wobei man der Reihe nach mit Chloroform (2 χ 1 Liter), Chloroform ^Methanol (9:1) (2 χ 1 Liter) und Methanol (1 Liter) eluiert. Eine entsprechende biologische Untersuchung zeigt, daß die ersten beiden Fraktionen den wirksamen Bestandteil enthalten. Die in vivo-Wirksamkeiten in dem System P-388 liegen für die erste Fraktion T/C 153 bei 100 mg/kg und für die zweite Fraktion T/C 142 bei 50 mg/kg.

Die erste Fraktion (2,5 g) wird über Silicagel (Merck Silica PF₂₅₄) (100 g) chromatographiert und der Reihe nach mit Benzol (4 Liter), Benzol-.Äthylacetat (20:1) (1 Liter), Benzol:Äthylacetat (10:1) (3 Liter) und Methanol (1 Liter) in 20 ml Fraktionen eluiert. Die hierbei von der Säule erhaltenen Fraktionen 321 bis 398 v/erden vereinigt, und der hieraus erhaltene Rückstand (950 mg) wird erneut über Silicagel (25 g) chromatographiert und mit Chloroform eluiert, wodurch man zu Jacaranon (440 mg) gelangt. Weitere Fraktionen dieser Säule führen zu einer bestimmten Menge an Rohjacaranon (150 mg).

Aus der zweiten Fraktion (800 mg) erhält man durch Chromatographieren über Silicagel (100) eine weitere Menge an Rohjacaranon (725 mg).

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Eine Teilmenge (5 g) des aus Stamm-Rinde-Teilen der Pflanze erhaltenen chloroformlöslichen Materials chromatographiert man über Silicagel (25 g), wobei man der Reihe nach mit Chloroform (800 ml), Chloroform:Methanol (100:1) (400 ml) und Methanol (1 Liter) Fraktionen von jeweils 20 ml eluiert. Aus den Fraktionen 53 bis 62 dieser Säule erhält man reines Jacaranon (100 mg).

Das Jacaranon fällt in Form eines fahlgelben Öls an, das beim Stehen langsam kristallisiert. Es verfügt über folgende weitere Eigenschaften: Schmelzpunkt =53-54 °; UV-Spektrum: lambda max (C₂H-OH) = 225 nm (log epsilon 4,16); IR-Spektrum: ny max (Dünnfilm) = 3320 (m), 1745 (s), 1680 (ss), 1635 (s), · 1450 (m), 1185 (m), 1170 (m), 1075 (m), i040(m), 1005 (m) und 865 (s) cm"¹; NMR-Spektrum: (CDCl₃,. 60 MHz): delta = 2,713 (2H,s), 3,740 (3H,s), 4,120 (1H,b, durch D₃O entfernt), 6,167 (2H,m) und 6,981 (2H,m); EMR-Spektrum: (CDCl₃, 25,1 MHz) (entkoppeltes Protonenrauschen): delta = 43,4 (C-7), 52,3 (C-9), 67,3 (C-4), 128,2 (C-2,6), 149,0 (C-3,5), 171,0 (C-8) und 185,0 (C-1); MS-Werte M⁺: m/e - 182 (13 %) 150 (20), (15), 109 (100), 81 (30) und 74 m,u (94). Ein entsprechendes

/ 4.

Massenspektrum unter hoher Auflösung ergibt folgendes: M m/e - 182.05892 (berechnet für C₉H₁₀O₄, 182,05791).

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Claims

Patentansprüche

1»J Phytochinoid mit der Bezeichnung Jacaranon der Formel

CH₂CO₂CH₃
2. Extrakt der Pflanze Jacaranda caucana Pittier mit einem für eine antitumorale Wirksamkeit in vivo ausreichenden Gehalt an Jacaranon.
3. Verfahren zur Herstellung des Extrakts nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Zweig-Blatt-Teile oder Stamm-Rinde-Teile von Jacaranda caucana Pittier mit einem niederen aliphatischen Alkohol extrahiert und von dem so erhaltenen Extrakt dann eine Teilmenge oder die Gesamtmenge an Alkohol entfernt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet , daß man als niederen aliphatischen Alkohol Methanol verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man das erhaltene konzentrierte Methanolgemisch ferner mit Wasser verdünnt, das dabei anfallende wässrige Gemisch zuerst mit Petroläther und anschließend mit Chloroform extrahiert, den dabei erhaltenen Chloroformextrakt trocknet und den Chloroformextrakt schließlich eindampft, wodurch man zu einem Rückstand mit antitumoraler Wirksamkeit in vivo gelangt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn

zeichnet , daß man den hiernach erhaltenen Rückstand in Form einer Chloroformlösung über Silicagel chromatographiert und den so gereinigten Rückstand dann mit Chloroform eluiert.
7. Arzneimittel mit antitumoraler Wirksamkeit in vivo,

gekennzeichnet durch eine therapeutisch wirksame Menge an Jacaranon.
8. Arzneimittel mit antitumoraler Wirksamkeit in vivo,

gekennzeichnet durch eine therapeutisch wirksame Menge eines Extrakts von Zweig-Blatt-Teilen oder Stamm-Rinde-Teilen der Pflanze Jacaranda caucana Pittier.

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