DE2440931A1

DE2440931A1 - Verfahren zur n-demethylierung von indolalkaloiden durch s. albogriseolus

Info

Publication number: DE2440931A1
Application number: DE2440931A
Authority: DE
Inventors: Donald Ray Brannon; Norbert Neuss
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1973-09-19
Filing date: 1974-08-27
Publication date: 1975-03-20
Also published as: GB1483292A; FR2243996B1; AU7126274A; CA1023289A; IL45283A; FR2243996A1; DE2440931C2; IE39605B1; US4082754A; IL45283A0; ZA744485B; US3989593A; HU167750B; BE819078A

Description

PATENTANWALTS

OR. I. WAAS
DR. C. S F'OTT

80C"> : r. ϊ-.¹GI ""N 40
Hl-K"- zy.'£H AEh. ITR. 299
TEL. 3 332201/205

Eli Lilly and Company , Indianapolis/ Indana, V.St.A.

Verfahren zur N-Pemethylierung von Indolalkaloiden durch

S. albogrlseolus

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Demethylierung von Vindolin und Vinblastin durch submerse Fermentation mit S. albogriseolus.

Verschiedene natürlich vorkommende dimere Alkaloide, die sich aus Vinca rosea erhalten lassen, sind wirksam zur Behandlung experimentell hervorgerufener Erkrankungen bei Tieren= Hierzu gehören Leurosin, Vincaleukoblastin (Vinblastin oder VLB), Leurosidin (Vinrosidin) und Leurocristin (VCR oder Vincristin}. Zwei dieser Alkaloide, nämlich VLB und Vincristin, befinden sich nun als Heilmittel zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Leukämien und damit verwandten Erkrankungen beim Menschen, auf dem Markt» Vinblastin und Vincristin lassen sich durch die folgende Formel I angeben, der sich ebenfalls das übliche Numerierungssystem für die dimeren Indolalkaloide entnehmen läßt.

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CH₂-CHs

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CHs-O-

1 7

CHa-CHs

Falls der Substituent R in obiger Formel I für Methyl steht/ dann handelt es sich bei dieser Verbindung um Vinblastin, falls der Substituent R Formyl bedeutet, dann ist diese Verbindung Vincristin.

Bei den Verbindungen der Formel I wird das untere Ringsystem normalerweise als der Vindolinteil bezeichnet, da Vinblastin ein in Stellung 15 substituiertes Vindolin ist und Vincristin ein in Stellung 15 substituiertes Derivat eines modifizierten (eher in Stellung 1 formylierten als in Stellung 1 methylierten) Vindolins ist. N-Desraethylvinblastin (1-Desmethylvinblastin) oder Desformylvincristin ist ferner ein in Stellung 15 substituiertes modifiziertes Vindolin. In Stellung 15 substituierte Vindoline werden hergestellt, indem man Vindolin mit verschiedenen Indolderivaten, wie Perivinol, 18-Hydroxydihydrocleavamin, 18-Hydroxyibogamin oder Vobasinol, umsetzt.

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Die Fermentation von Vindolin nit S. albogriseolus zur Herstellung anderer Metaboliten wurde von Mallet et al. in den Abstracts der 151. Tagung der American Chemical Society (1967) in Pittsburgh, Pa. berichtet.

N-Desmethyl-(I-Desmethyl)-vindolin wurde bisher nicht beschrieben. .

Erfindungsgeraäß wird nun ein Verfahren zur N-Demethylierung von Indolalkaloiden geschaffen, das darin besteht, daß man eine Verbindung der Formel II

worin R für Methyl steht und R' Wasserstoff oder den Rest

CHa-CH3■\

bedeutet, einer subraersen Fermentation des Mikroorganismus S. albogriseolus (A17178) unterwirft, wodurch man eine N-deraethylierte Verbindung gemäß obiger Formel II erhält, in dor R für Wasserstoff steht und R¹ die oben angegebene Bedeutung besitzt.

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Der Organismus S. albogriseolus (A17178) ist beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, unter der Nummer NRRL 5748 hinterlegt. Er ist im übrigen in Antibiotics and Chemotherapy, 4, 653-6 (1954) und in Int. J. Syst. Bact., 18, 279-392 (1968) erschöpfend beschrieben.

Falls bei der obigen Formel II der Substituent R* Wasserstoff bedeutet, dann bezeichnet man diese Verbindung als Vindolin, und falls der Substituent R' den komplexen Indolrest (ein Cleavaminderivat) darstellt, dann wird diese Verbindung als Vinblastin bezeichnet.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen neuen Fermentation beimpft man ein vegetatives Maismaische-Soja-Medium mit einer Kultur von S. albogriseolus und inkubiert das Ganze dann auf einem Rotationsschüttler 2 bis 3 Tage bei 30 ⁰C. Am Ende dieser Zeit wird ein 8-prozentiges Inokulum der Kultur auf eine Reihe von Flaschen übertragen, die ein Pepton-Amin-Medium enthalten, und man läßt die Kultur in diesem Medium auf einem Rotationsschüttler etwa 24 Stunden bei 30 C wachsen. Zu diesem Zeitpunkt versetzt man das Kulturmedium mit Vindolin oder Vinblastin, und zwar normalerweise in Form einer 1:1-Aceton:Wasser-Lösung, die etwa 50 mg des Alkaloids auf je 2 ml Lösungsmittel enthält. Jeder Kolben enthält etwa 150 ml Medium, und das Alkaloid wird so zugegeben, daß sich 50 mg pro 150 ml Medium ergeben. Die Fermentation wird 5 bis 6 Tage unter Schütteln bei etwa 30 ⁰C durchgeführt. Das Ernten der Kultur erfolgt durch Ansäuern, Filtrieren, Basischstellen auf einen pH-Wert zwischen 9 und 10 und anschließendes Extrahieren des Alkaloidmaterials, das in dem alkalischen Medium unlöslich ist, mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Methylendichlorid. Das durch Eindampfen des Extraktionsmittels zurückbleibende Alkaloidmaterial wird dann durch

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ORIGINAL INSPECTED

Gradienten-pH-Trennverfahren, durch Hochdruckchromatographie über Aluminiumoxid oder durch sonstige, zum Trennen eng verwandter Indolalkaloide übliche Verfahren abgetrennt. Andere Produkte, die bei der Fermentation mit S. albogriseolus unter Verwendung von Vindolih als Substrat gebildet werden, sind in Mallet et al. (loc. cit.) beschrieben.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen neuen Fermentation verwendet man S. albogriseolus (S17178) oder eine morphologische Variante hiervon<> Wie bereits erwähnt, wurde dieser Stamm beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, hinterlegt, und dort mit dem Kennzeichen NRRL 5748 versehen. Für den Fachmann ergibt es sich von selbst, daß auch andere verwandte Organismen, die morphologisch Varianten von S. albogriseolus darstellen, zur Demethylierung von Vindolin oder Vinblastin in einer Fermentation mit submerser Kultur geeignet sind. · ■ ₉

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Des-N-methylvindolin

S. albogriseolus (A17178„5) läßt man auf Maismalsche-Soja-Schrägagar (CSS XII) wachsen, der folgende Zusammensetzung hat; 15 g Cerelose, 15 g Sojabohnenmehl (Nährsojaschnitzel) , 8 ml Maismaischefeststoffe, 5 g Natriumchlorid, 2 g Calciumcarbonat, Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der pH-Wert des Mediums wird auf 6,0 eingestellt, und das Medium sterilisiert man durch 25 Minuten langes Behandeln im Autoklaven. Der auf diese Weise gewachsene S. albogriseolus

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wird von den CSS XII-Schrägen auf ein vegetatives Medium übertragen, das 100 ml CSS XII Medium je 500 ml Kolben enthält. Die vegetative Kultur wird unter Schütteln auf einem Rotationsschüttler mit einer Geschwindigkeit von etwa 250 Umdrehungen pro Minute bei 30 ⁰C inkubiert. Nach 72 Stunden überträgt man ein 8-prozentiges Inokulum von so hergestelltem S. albogriseolus in 500 ml fassende Erlenmeyerkolben, die jeweils 150 ml PNZ-Medium enthalten, das wie folgt zusammengesetzt ist: 25 g Cerelose, 10 g lösliche Stärke, 40 g Pepton, 4 g NZ-Amin-A, 5 g MgSO₄.7H₂O, 5 g Portweinmelasse (blackstrap molasses),2g Calciumcarbonat, Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 7,6 eingestellt, und das Medium behandelt man vor der Verwendung 25 Minuten im Autoklaven. Das mit PNZ inokulierte Medium, wird bei 30 ⁰C auf einem Rotationsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach 24 Stunden langem Wachsen setzt man Vindolin in einer Menge von 50 mg pro Flasche als Lösung in 2 ml eines 1:1-Gemisches aus Aceton und Wasser zu. Die Fermentation wird 5 Tage fortgeführt, und am Ende dieser Zeit erfolgt die Ernte durch Einstellen des pH-Wertes des Mediums auf 3,4 und anschließendes Filtrieren. Der pH-Wert des Mediums wird dann auf einen pH-Wert zwischen 9 und 10 eingestellt, und die basenunlöslichen Materialien, hauptsächlich Vindolin und Vindolinfermentationsprodukte, werden hieraus mit Methylendichlorid extrahiert. Der MethylendiChloridextrakt wird getrocknet, und das Methylendichlorid entfernt man hiervon im Vakuum. Die zurückbleibenden Alkaloide werden dann wie folgt weiter gereinigt: 2 g des Alkaloidextrakts werden in Benzol gelöst, und die Benzollösung Chromatograph i er t man über 100 g Siliciumdioxid in einer 3,2 cm Säule. Das Chromatogramm wird mit 1,5 Liter Benzol, 2 Liter eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat (95 : 5), 400 ml eines Gemisches aus Benzol und Xthylacetat (3:1) und schließ lich 1 Liter eines Lösungsmittels aus Benzol und Äthylacetat (1:1) entwickelt. Eine weitere Elution mit einem Liter des

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letzten Lösungsmittelgemisches ergibt vier Fraktionen, die insgesamt 95 mg Des-N-methylvindolin enthalten, das bei etwa 102 bis 104 ⁰C schmilzt. Das Produkt hat eine typische NH-Bande bei 3420 cm" , die beim Vindolin selbst nicht vorhanden ist. Das NMR-Spektrum ist durch ein Fehlen von N-CH₃-Protonen bei delta 2,68 ppm und das Auftreten zweier neuer Peaks bei delta 4,50 ppm (NH Doublet) sowie delta 4,15 ppm (C-2 Protondoublet) gekennzeichnet. Der Rest des NMR-Spektrums ist wie erwartet und ähnelt im Aussehen und in chemischen Verschiebungen dem Vindolinspektrum. Die Struktur der Verbindung wurde ferner durch Massenspektroskopie bestätigt, die das vorhergesagte Molekulargewicht und ein Muster für die Molekularbruchstücke ergab, welche für Verbindungen dieser Art typisch sind.

Beispiel 2 Des-N-methyIvinblastin

Die Fermentation wird in ähnlicher Weise wie bei Beispiel 1 durchgeführt, wobei man anstelle von Vindolin jedoch Vinblastin in einer Menge von 50 mg pro 150 ml NPZ-Medium zusetzt, und die Fermentation anstelle von 5 Tagen über eine Zeitspanne von 6 Tagen laufen läßt. Am Ende der Fermentation säuert man 3 Liter Fermentationsbrühe mit 10-prozentiger wässriger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 4,6 an. Die saure Brühe wird filtriert und dann zweimal mit je einem Liter Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte werden vereinigt und getrocknet, und nach Entfernen des Methylendichlorids durch Eindampfen im Vakuum erhält man einen Rückstand von etwa 537 mg. Der Rückstand wird einem pH-Gradientenextraktionsverfahren unterworfen, indem man ihn in 50 ml einer 0,1 m Zitronensäure bei pH 2,3 löst. Die so erhaltene Lösung extrahiert

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man zweimal mit je 25 ml Methylendichlorid, und die Methylendichloridextrakte werden vereinigt. Der pH-Wert der Lösung wird hierauf auf pH 3,0 angehoben, worauf man die Extraktion wiederholt und in gleicher Weise bis zu pH 5,0 hinauf verfährt. Die Ergebnisse dieses pH-Gradienten-Extraktionsverfahrens sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle

p_H Rückstand in mg

A. 2,3 230

B. 3,0 87

C. 3,5 60

D. 4,0 25

E. 4,5 12

F. 5,0 9

Die Fraktionen "D" und ^HE" enthalten Des-N-methylvinblastin, was sowohl durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie als auch durch Hochdruckflüssigchromatographie über Aluminiumoxid festgestellt wurde. Das dabei erhaltene Des-N-methylvinblastin verhält sich identisch wie authentisches Des-N-methylvinblastin, das nach dem in US-PS 3 354 163 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Des-N-methylvinblastin läßt sich aus dem gemischten Alkaloidfermentationsprodukt ferner durch Chromatographie herstellen, insbesondere durch Hochdruckflüssigchromatographie .

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Claims

P atentansprüche

1. Verfahren zur N-Demethylierung von Indolalkaloiden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel

i ^-CHs-CHs !

worin R für Methyl steht und R¹ Wasserstoff oder

CHa-CHa

bedeutet, in einer submersen Kulturfermentation mit

S. albogriseolus fermentiert, wodurch man eine N-demethylierte Verbindung erhält, in der R für Wasserstoff steht und R¹ die oben angegebene Bedeutung hat, und" diese N-demethylierte Verbindung dann aus dem Fermentationsmedium abtrennt.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Vindolin in Des-N-methylvindolin umwandelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Vinblastin in Des-N-methylvinblastin umwandelt.

4. Des-N-methylvindolin.

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