DE2440931A1 - Verfahren zur n-demethylierung von indolalkaloiden durch s. albogriseolus - Google Patents
Verfahren zur n-demethylierung von indolalkaloiden durch s. albogriseolusInfo
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Description
PATENTANWALTS
OR. I. WAAS
DR. C. S F'OTT
DR. C. S F'OTT
80C"> : r. ϊ-.1GI ""N 40
Hl-K"- zy.'£H AEh. ITR. 299
TEL. 3 332201/205
Hl-K"- zy.'£H AEh. ITR. 299
TEL. 3 332201/205
Eli Lilly and Company
,
Indianapolis/ Indana, V.St.A.
S. albogrlseolus
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Demethylierung von Vindolin und Vinblastin durch submerse Fermentation
mit S. albogriseolus.
Verschiedene natürlich vorkommende dimere Alkaloide, die sich aus Vinca rosea erhalten lassen, sind wirksam zur
Behandlung experimentell hervorgerufener Erkrankungen bei Tieren= Hierzu gehören Leurosin, Vincaleukoblastin
(Vinblastin oder VLB), Leurosidin (Vinrosidin) und Leurocristin
(VCR oder Vincristin}. Zwei dieser Alkaloide,
nämlich VLB und Vincristin, befinden sich nun als Heilmittel
zur Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Leukämien und damit verwandten Erkrankungen beim Menschen,
auf dem Markt» Vinblastin und Vincristin lassen sich durch die folgende Formel I angeben, der sich ebenfalls das übliche Numerierungssystem für die dimeren Indolalkaloide
entnehmen läßt.
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CH2-CHs
3440931
CHs-O-
1 7
CHa-CHs
Falls der Substituent R in obiger Formel I für Methyl
steht/ dann handelt es sich bei dieser Verbindung um Vinblastin, falls der Substituent R Formyl bedeutet,
dann ist diese Verbindung Vincristin.
Bei den Verbindungen der Formel I wird das untere Ringsystem normalerweise als der Vindolinteil bezeichnet,
da Vinblastin ein in Stellung 15 substituiertes Vindolin ist und Vincristin ein in Stellung 15 substituiertes Derivat
eines modifizierten (eher in Stellung 1 formylierten als in Stellung 1 methylierten) Vindolins ist. N-Desraethylvinblastin
(1-Desmethylvinblastin) oder Desformylvincristin
ist ferner ein in Stellung 15 substituiertes modifiziertes Vindolin. In Stellung 15 substituierte Vindoline werden
hergestellt, indem man Vindolin mit verschiedenen Indolderivaten,
wie Perivinol, 18-Hydroxydihydrocleavamin,
18-Hydroxyibogamin oder Vobasinol, umsetzt.
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Die Fermentation von Vindolin nit S. albogriseolus zur
Herstellung anderer Metaboliten wurde von Mallet et al.
in den Abstracts der 151. Tagung der American Chemical Society (1967) in Pittsburgh, Pa. berichtet.
N-Desmethyl-(I-Desmethyl)-vindolin wurde bisher nicht beschrieben. .
Erfindungsgeraäß wird nun ein Verfahren zur N-Demethylierung
von Indolalkaloiden geschaffen, das darin besteht, daß man eine Verbindung der Formel II
worin R für Methyl steht und R' Wasserstoff oder den Rest
CHa-CH3■\
bedeutet, einer subraersen Fermentation des Mikroorganismus
S. albogriseolus (A17178) unterwirft, wodurch man eine
N-deraethylierte Verbindung gemäß obiger Formel II erhält,
in dor R für Wasserstoff steht und R1 die oben angegebene
Bedeutung besitzt.
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Der Organismus S. albogriseolus (A17178) ist beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois,
unter der Nummer NRRL 5748 hinterlegt. Er ist im übrigen in Antibiotics and Chemotherapy, 4, 653-6 (1954) und
in Int. J. Syst. Bact., 18, 279-392 (1968) erschöpfend beschrieben.
Falls bei der obigen Formel II der Substituent R* Wasserstoff
bedeutet, dann bezeichnet man diese Verbindung als Vindolin, und falls der Substituent R' den komplexen Indolrest
(ein Cleavaminderivat) darstellt, dann wird diese Verbindung als Vinblastin bezeichnet.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen neuen Fermentation beimpft man ein vegetatives Maismaische-Soja-Medium mit
einer Kultur von S. albogriseolus und inkubiert das Ganze dann auf einem Rotationsschüttler 2 bis 3 Tage bei 30 0C.
Am Ende dieser Zeit wird ein 8-prozentiges Inokulum der Kultur auf eine Reihe von Flaschen übertragen, die ein
Pepton-Amin-Medium enthalten, und man läßt die Kultur in diesem Medium auf einem Rotationsschüttler etwa 24 Stunden
bei 30 C wachsen. Zu diesem Zeitpunkt versetzt man das Kulturmedium mit Vindolin oder Vinblastin, und zwar normalerweise
in Form einer 1:1-Aceton:Wasser-Lösung, die etwa
50 mg des Alkaloids auf je 2 ml Lösungsmittel enthält. Jeder Kolben enthält etwa 150 ml Medium, und das Alkaloid wird
so zugegeben, daß sich 50 mg pro 150 ml Medium ergeben. Die Fermentation wird 5 bis 6 Tage unter Schütteln bei etwa
30 0C durchgeführt. Das Ernten der Kultur erfolgt durch
Ansäuern, Filtrieren, Basischstellen auf einen pH-Wert zwischen 9 und 10 und anschließendes Extrahieren des Alkaloidmaterials,
das in dem alkalischen Medium unlöslich ist, mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie
Methylendichlorid. Das durch Eindampfen des Extraktionsmittels zurückbleibende Alkaloidmaterial wird dann durch
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ORIGINAL INSPECTED
Gradienten-pH-Trennverfahren, durch Hochdruckchromatographie über Aluminiumoxid oder durch sonstige, zum Trennen eng verwandter
Indolalkaloide übliche Verfahren abgetrennt. Andere Produkte, die bei der Fermentation mit S. albogriseolus unter
Verwendung von Vindolih als Substrat gebildet werden, sind in Mallet et al. (loc. cit.) beschrieben.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen neuen Fermentation
verwendet man S. albogriseolus (S17178) oder eine morphologische
Variante hiervon<> Wie bereits erwähnt, wurde dieser
Stamm beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, hinterlegt, und dort mit dem Kennzeichen NRRL 5748
versehen. Für den Fachmann ergibt es sich von selbst, daß auch andere verwandte Organismen, die morphologisch Varianten
von S. albogriseolus darstellen, zur Demethylierung von Vindolin
oder Vinblastin in einer Fermentation mit submerser Kultur geeignet sind. · ■ 9
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 Des-N-methylvindolin
S. albogriseolus (A17178„5) läßt man auf Maismalsche-Soja-Schrägagar
(CSS XII) wachsen, der folgende Zusammensetzung hat; 15 g Cerelose, 15 g Sojabohnenmehl (Nährsojaschnitzel)
, 8 ml Maismaischefeststoffe, 5 g Natriumchlorid, 2 g Calciumcarbonat, Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt.
Der pH-Wert des Mediums wird auf 6,0 eingestellt, und das
Medium sterilisiert man durch 25 Minuten langes Behandeln im Autoklaven. Der auf diese Weise gewachsene S. albogriseolus
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wird von den CSS XII-Schrägen auf ein vegetatives Medium übertragen, das 100 ml CSS XII Medium je 500 ml Kolben
enthält. Die vegetative Kultur wird unter Schütteln auf einem Rotationsschüttler mit einer Geschwindigkeit von
etwa 250 Umdrehungen pro Minute bei 30 0C inkubiert. Nach
72 Stunden überträgt man ein 8-prozentiges Inokulum von so hergestelltem S. albogriseolus in 500 ml fassende
Erlenmeyerkolben, die jeweils 150 ml PNZ-Medium enthalten,
das wie folgt zusammengesetzt ist: 25 g Cerelose, 10 g lösliche Stärke, 40 g Pepton, 4 g NZ-Amin-A, 5 g MgSO4.7H2O,
5 g Portweinmelasse (blackstrap molasses),2g Calciumcarbonat,
Leitungswasser auf 1 Liter aufgefüllt. Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 7,6 eingestellt, und das Medium behandelt
man vor der Verwendung 25 Minuten im Autoklaven. Das mit PNZ inokulierte Medium, wird bei 30 0C auf einem Rotationsschüttler
bei 250 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Nach 24 Stunden langem Wachsen setzt man Vindolin in einer
Menge von 50 mg pro Flasche als Lösung in 2 ml eines 1:1-Gemisches
aus Aceton und Wasser zu. Die Fermentation wird 5 Tage fortgeführt, und am Ende dieser Zeit erfolgt die
Ernte durch Einstellen des pH-Wertes des Mediums auf 3,4 und anschließendes Filtrieren. Der pH-Wert des Mediums
wird dann auf einen pH-Wert zwischen 9 und 10 eingestellt, und die basenunlöslichen Materialien, hauptsächlich Vindolin
und Vindolinfermentationsprodukte, werden hieraus mit Methylendichlorid extrahiert. Der MethylendiChloridextrakt
wird getrocknet, und das Methylendichlorid entfernt man hiervon im Vakuum. Die zurückbleibenden Alkaloide werden
dann wie folgt weiter gereinigt: 2 g des Alkaloidextrakts werden in Benzol gelöst, und die Benzollösung Chromatograph
i er t man über 100 g Siliciumdioxid in einer 3,2 cm
Säule. Das Chromatogramm wird mit 1,5 Liter Benzol, 2 Liter eines Gemisches aus Benzol und Äthylacetat (95 : 5), 400 ml
eines Gemisches aus Benzol und Xthylacetat (3:1) und schließ lich 1 Liter eines Lösungsmittels aus Benzol und Äthylacetat
(1:1) entwickelt. Eine weitere Elution mit einem Liter des
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letzten Lösungsmittelgemisches ergibt vier Fraktionen, die
insgesamt 95 mg Des-N-methylvindolin enthalten, das bei
etwa 102 bis 104 0C schmilzt. Das Produkt hat eine typische
NH-Bande bei 3420 cm" , die beim Vindolin selbst nicht vorhanden ist. Das NMR-Spektrum ist durch ein Fehlen von N-CH3-Protonen
bei delta 2,68 ppm und das Auftreten zweier neuer Peaks bei delta 4,50 ppm (NH Doublet) sowie delta 4,15 ppm
(C-2 Protondoublet) gekennzeichnet. Der Rest des NMR-Spektrums
ist wie erwartet und ähnelt im Aussehen und in chemischen Verschiebungen dem Vindolinspektrum. Die Struktur der
Verbindung wurde ferner durch Massenspektroskopie bestätigt, die das vorhergesagte Molekulargewicht und ein Muster für
die Molekularbruchstücke ergab, welche für Verbindungen dieser Art typisch sind.
Beispiel 2 Des-N-methyIvinblastin
Die Fermentation wird in ähnlicher Weise wie bei Beispiel 1
durchgeführt, wobei man anstelle von Vindolin jedoch Vinblastin in einer Menge von 50 mg pro 150 ml NPZ-Medium zusetzt,
und die Fermentation anstelle von 5 Tagen über eine Zeitspanne von 6 Tagen laufen läßt. Am Ende der Fermentation
säuert man 3 Liter Fermentationsbrühe mit 10-prozentiger wässriger Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 4,6
an. Die saure Brühe wird filtriert und dann zweimal mit je einem Liter Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte
werden vereinigt und getrocknet, und nach Entfernen des Methylendichlorids durch Eindampfen
im Vakuum erhält man einen Rückstand von etwa 537 mg. Der Rückstand wird einem pH-Gradientenextraktionsverfahren
unterworfen, indem man ihn in 50 ml einer 0,1 m Zitronensäure bei pH 2,3 löst. Die so erhaltene Lösung extrahiert
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man zweimal mit je 25 ml Methylendichlorid, und die Methylendichloridextrakte
werden vereinigt. Der pH-Wert der Lösung wird hierauf auf pH 3,0 angehoben, worauf man die Extraktion
wiederholt und in gleicher Weise bis zu pH 5,0 hinauf verfährt. Die Ergebnisse dieses pH-Gradienten-Extraktionsverfahrens
sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:
p_H Rückstand in mg
A. 2,3 230
B. 3,0 87
C. 3,5 60
D. 4,0 25
E. 4,5 12
F. 5,0 9
Die Fraktionen "D" und HE" enthalten Des-N-methylvinblastin,
was sowohl durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie als auch durch Hochdruckflüssigchromatographie
über Aluminiumoxid festgestellt wurde. Das dabei erhaltene Des-N-methylvinblastin verhält sich identisch
wie authentisches Des-N-methylvinblastin, das nach dem in US-PS 3 354 163 beschriebenen Verfahren hergestellt
wurde. Des-N-methylvinblastin läßt sich aus dem gemischten Alkaloidfermentationsprodukt ferner durch Chromatographie
herstellen, insbesondere durch Hochdruckflüssigchromatographie .
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Claims (4)
1. Verfahren zur N-Demethylierung von Indolalkaloiden,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel
i ^-CHs-CHs !
worin R für Methyl steht und R1 Wasserstoff oder
CHa-CHa
bedeutet, in einer submersen Kulturfermentation mit
S. albogriseolus fermentiert, wodurch man eine N-demethylierte
Verbindung erhält, in der R für Wasserstoff steht und R1 die oben angegebene Bedeutung hat, und" diese N-demethylierte
Verbindung dann aus dem Fermentationsmedium abtrennt.
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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Vindolin in Des-N-methylvindolin umwandelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Vinblastin in Des-N-methylvinblastin umwandelt.
4. Des-N-methylvindolin.
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