DE2801453A1 - Verfahren zur gewinnung von ergosin - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von Ergosin
• Verfahren zur Gewinnung von Ergosin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Ergosin.
• Anwendungsgebiet der Erfindung: Von den über 50 o bisher natürlich bekannten Mutterkornalkaloiden besitzen die Vertreter der Peptidgruppe eine große Bedeutung in der Medizin, so z.B. Ergotamin, Ergocornin, Ergokryptin und Ergocristin. Das Ergosin steht dem Ergotamin sehr nahe und unterscheidet sioh vom letzteren nur durch Austausch der Aminosäure Phenylalanin gegen die Aminosäure leucin in der Cyclolseitenkette.
• Ergosin wirkt wie andere Mutterkornalkaloide vom Peptidtyp uterotonisch sowie vasokonstriktorisch und ist deshalb für die Medizin von Bedeutung. Auch ist das Ergosin eine Schlüsselverbindung für Partialsynthesen.(Zu den Strukturen der genannten Peptidalkaloide vergleiche Abb.1.) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Bisher sind kaum Verfahren bekannt geworden, nach denen saprophytisch Ergosin gewonnen werden kann.
• In einem Britischen Patent ist beschrieben, daß neben Ergokryptin, Ergocornin und Ergometrin als Hauptalkaloide (30%, 28% bzw. 22X) auch Ergosin in Mengen von 5; gebildet wird (Brit. Pat. 1 401 406 vom 20.7.1973).
• In anderen Patenten wird die gleichzeitige Gewinnung von Ergocornin und Ergosin, zwei Peptidalkaloiden, nebeneinander geschützt. Der geschützte Stamm bildet beide Alkaloide bzw.
• ihre Isomeren Ergocorninin und Ergosinin in etwa gleichen Mengen bei einem Gesamtalkaloidgehalt von etwa 900-1100 µg/ml Nährlösung (Brit. Patent 1- 184 o39 vom 21.2.1969).
• Ein großer Nachteil der genannten Verfahren ist einmal der geringe Anteil an Ergosin bzw. das Vorliegen von eng verwandten Peptidalkaloiden nebeneinander, die erst auf kompliziertem Wege voneinander getrennt werden müssen.
• Ziel der Brfindung: Das Giel der BrSindung besteht darin, ein Verfahren zur Gewinnung von Brgosin zu entwickeln, bei dem die ökonomisch aufwendige Abtrennung verwandter Peptidalkaloide nicht erforderlich ist.
• Darlegung des Wesens der Erfindung: Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Stämme zu isolieren, die 1. in der Lage sind, saprophytisch Ergosin zu bilden, das nahezu frei ist von Nebenalkaloiden, und 2. sich durch Stabilität und gute Fermentationseigenschaften auszeichnen.
• Es wurde von Wildstämmen (PUR 13, PUR 50) der Art Claviceps purpurea (Fr) Tul., isoliert im Raum Halle (DDR), von auf Roggen gewachsenen Sklerotien, die Ergotamin bildeten, ausgegangen. Diese Wildstämme waren in saprophytischer Kultur frei von Alkaloiden. Durch Mutation dieser Linien mit UV-Licht konnten Stämme isoliert werden, die saprophytisch frei von alkaloiden waren, die aber deutliche morphologische Veränderungen (plektenchymatische Strukturen) aufwiesen. Bei einigen Stämmen waren die Aktivitäten von Enzymen der Aromatenbiosynthese, verglichen mit der Ausgangsform deutlich erhöht. Nach Zweitmutation der morphologisch veränderten Selektanten konnte aus etwa 2000 Linien ein Stamm isoliert werden der fähig ist, Ergosin zu bilden.
• Im Verlaufe der Arbeiten war es möglich, saprophytisoh alkaloidfreies Pilzmaterial in eine produzierende Linie umzuwandeln und gleichzeitig das Alkaloidsprektrum - bezogen auf das Sklerotium -umzusteuern. Der isolierte Stamm hat die Bezeichnung Cl.purpurea (Fr) Tul. MUT 168 und ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung IMET PA 134 hinterlegt. Er zeichnet sich vor allem dadurch aus, daß er Ergosin und dessen Isomeres Ergosinin in Mengen bis zu 90% neben 10% eines leicht abtrennbaren Clavingemisches bildet. Der neue Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften.
• Die Kultivation zur Charakteristik Voll C1. puprurea .iiUT 168 erfolgte auf den in Tab.1 zusammengestellten Agarmedien.
• Mikroskopisches Aussehen uf den in der Tabelle 1 genannten garmedien bestehen die Kolonien aus mehr oder weniger stark verzweigtem fiycel, das eine Dicke von durchschnittlich 4-5 µ besitzt. An den Verzweigungen wurden 7-8 µ gemessen. Konidien wurden nicht beobachtet, auf üblichen Sporulationsmedien (z.B. M10) zerfiel dagegen das Mycel in z.T. sehr kleine Bruchstücke (auch in flüssiger M10-Kultur).
• Fetttröpfchen in relativ geringer anzahl konnten nur auf Medium 846 und 829 beobachtet werden.
• Das Mycel der submersen Kulturen (ca. 14 Tage alt, Produktionsmedium) besteht aus langen, verzweigten Hyphen mit einer Dicke von ca. 5 µ. Die Hyphen haben z.T. kugelförmig abgerundete inschwellungen und enthalten viele Fetttröpfchen, Konidien wurden nicht beobachtet.
• Makroskopisches kuss ehen Das makroskopische Aussehen wurde bei Kulturen festgestellt, die bei 24 + 1°C auf Agarschalen (# 10 cm) während 14-16 Tagen gewachsen waren. Die Zusammensetzung der iiedien ist Tab.1 zu entnehmen.
• Medium M10: sehr gutes Wachstum mit gefalteter, sich teilweise abhebender Oberfläche, braune Pigmentierung, Rückseite teilweise mit dunklen Flecken, keine konidien Medium 846: gutes Wachstum, Kolonien mit gefalteter, gekröseartiger Oberfläche, braun, Rückseite hellbraun, keine Konidien Medium 829: gutes Wachstum. Die Hellbraunen bis braunen Kolonien besitzen eine gefaltete, krause Überflitohe und einen unregelmäßigen Rand. Die Rückseite ist hellbraun Medium 784: gutes Wachstum. Die Kolonien haben eine braune Oberseite und eine farblose Unterseite. ,ie sind gefaltet, kraus und besitzen einen unregelmäßigen Rand. Keine Konidien.
• Die Kultivation des Pilzes zur produktion erfolgt zweckmäßigerweise in flüssigen Wuhrmedien in emerser und/oder submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie beispielsweise Saccharose, Glucose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronen- oder Bernsteinsäure; eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydrolysat oder ein Ammoniumsalz sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in Fernbach-, Erlenmeyer- oder Schüttelkolben oder im Fermenter erfolgen. Die Alkaloide sind größtenteils (>80%) im Nährmedium enthalten und können auf üblichem Wege erhalten werden.
• Die Kultivation erfolgt zweckmäßigerweise ein- bis dreistufig.
• Es ist vorteilhaft, wenn die Vorkultur 5-12 Tage alt ist und das Impfverhältnis Vor- : Hauptkultur 1:5 bis 1:20 beträgt. Der pH-Wert kann zwischen 4.0 und 6.2, die Temperatur zwischen 20 und 30°C liegen. Die Stammerhaltung kann über Röhrchen oder durch Tiefkuhllagerung unter Verwendung von Schutzkolloiden, wie z.B. 60% Saccharoselösung + Magermilch = 2:1, auf übliche leise erfolgen.
• Ausführungsbeispiele: Die folgenden Beispiele sollen die erfindung erläutern; Beispiel 1 Ausgehend von Schrägröhrchen des Stammes MUT 168 wurden durch Zermörsern des Mycels Vorkulturen von 100 ml Medium 821 in 900 ml Schüttelkolben beimpft. Das Medium hat folgende Zusammensetzung: Saccharose 200 g Ammoniumcitrat 15 g Ca(NO3)2 1 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,3 g FeSO4.7H2O 10 mg ZnSO4.7H2O 30,8 mg KCl os1 g Hefeextrakt 3,0 g Wasser ad 1ooo.o pII (vor dem Sterilisieren) 5.8 - 6.o Sterilisation 30 Min. bei 110°C Die Kolben wurden 7 Tage bei 24 + 10C bei 200 Upm bebrütet.
• 100 der erhaltenen Kulturen dienten dazu, 500 ml Kolben mit Je 1oo ml Medium 720 der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: Saccharose 200 g mmoniumoitrat 15 g Ca(NO3)2 1 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,3 g FeSO4.7H2O 10 mg ZnSO4.7H2O 30,8 mg KCl o,1 g Wasser ad 1000.0 pH (vor dem Sterilisieren) 5.8 - 6.o Sterilisation 30 Min. bei 110°C.
• Nach 12-21-tägiger Bebrütung unter den für die Vorkulturen beschriebenen Bedingungen enthielten die Kulturen 180-280 µg/ml Gesamtalkaloid, bestehend aus 90% eines Gemisches von Ergosin und Ergosinin und 10% eines Clavinalkaloidgemisches. Die Alkaloide können nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden.
• Beispiel 2 10% der iii Beispiel 1 beschriebenen Vorkultur wurden in 400 ml Fernbachkolben mit 100 cll des Mediums 720 ilberführt. Bei 24 + 1 0C wurden die Kolben bebrütet und nach 20 Tagen Kultivation das emerse Mycel vom Medium abgetrennt. Die Kolben enthielten 250-350 µg Gesamtalkaloid pro ml Nährmedium, das die gleiche Zusammensetzung besaß, wie in Beispiel 1 beschrieben ist.
• Die Identifizierung der Alkaloide erfolgte in der folgend beschriebenen weise: Nach 20tägiger Fermentation der Oberflächenkultur enthalten die Kulturen 300 Xug/ml Alkaloidgemisch. 10 ml werden alkalisiert und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf 5 ml eingeengt und davon 2 ml durch präparative Schichtchromatographie an Kieselgel mit Fluorescenzindikator (Lösungsmittelsystem Chloroform:Äthanol (8:2) getrennt. Die hlkaloidflecke werden abgeschabt und mit einer Ilischung von Wasser:Methanol: Eisessig (45:45:10) aufgenommen und anschließend mit van Urk's Reagenz im Verhältnis (1:2) versetzt. Die blau gefärbten Lösungen werden zentrifugiert, der Überstand mit einer Quarzlampe 5 min bestrahlt und die Extinktion im photometer bestimmt. Die Alkaloidmengen können unter gleichen Bedingungen aufgestellten Eichkurven entnommen werden. Das hlkaloidgemisch dieses Stammes hat folgende Zusammensetzung: Ergosin 65; rgosinin 25%, Clavine 10%.
• Die präparative Gewinnung der Peptidalkaloide kann auf folgende Weise durchgeführt werden: 2,5 liter Nährlösung werden alkalisch gestellt (pH 9) und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte dampft man im Vakuum ein. Daraus resultieren 690 mg Rohalkaloidgemisch. Dieses Material wird in wenig Chloroform gelöst und an einer Kieselgel-Säule chromatographiert. Als Elutionsmittel dient Chloroform, dem steigende lWengen Äthanol (bis 15%) zugesetzt werden. Es bilden stich zwei getrennte, im W-Licht blau fluorescierende Zonen. Die rascher wandernde Zone ergab Ergosinin. Nach Umkristallisieren aus Methanol werden 150 mg Ergosinin (C30H3705N5) erhalten, Fp 2250C. [α]D29= +3940 (c - 1 Chloroform). Hochaufgelöstes Massenspektrum m/e:547 (M+); Gef. 547,2807, Ber. 547,2794 für C30H3705N5. Weitere prominente Fragmente m/e:280; 267; 224; 221; 210; 167; 154.
• Das Eluat der langsamer wandernden Zone enthielt 350 mg Ergosin (C30H37O5N5). Massenspektrum m/e: 547 (M+). Weitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154.
• In beiden Fällen ist die Keller'sche und van Urk'sche Reaktion positiv, und daß Absorptionsspektrum im UV zeigt bei # = 312 ein Maximum.
• Bei der saueren Hydrolyse entstehen Jeweils Leucin und Prolin.
• Die alkalische Hydrolyse liefert Lysergsäure (Ergosin) bzw.
• Isolysergsäure (Ergosinin).
• Nuch das chromatographische Verhalten der beiden isolierten Peptidalkaloide stimmt mit authentischem Ergosin bzw. Ergosinin überein. Line Umwandlung der Alkaloide ineinander nach bekannten Methoden ist möglich.
• Beispiel 3 ausgehend von Schrägröhrchen werden nach dem in Beispiel 1 genannten Verfahren Vorkulturen in 500 ml Schüttelkolben mit 100 ml des Mediums 815, dessen Zusammensetzung nachfolgend angegeben ist, angesetzt.
• Saccharose 300 g KH2PO4 0,5 g NaNO3 2,0 g Hefeextrakt o,1 g MgSO4.7H2O 0,6 g KCl 0,5 g FeSO4.7H2O 10 mg Wasser ad looo.o ml pH (vor dem Sterilisieren) 5,5 - 5,8 Sterilisation 30 Min. bei 110°C Nach der Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen wurden 10% der Vorkultur in Soo ml Schüttelkolben mit loo ml Medium 833 übertragen, das die folgende Zusammensetzung hat: Saccharose 300 g ammoniumcitrat 20 g Ca(NO3)2 1 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,3 g FeSO4.7H2O 10 mg ZnSO4.7H2O 30,8 mg Wasser ad 1000.0 ml pH (vor dem Sterilisieren) 5,4 - 5,7 Sterilisation 30 Min. bei 110°C Nach 14tägiger Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen enthielten die Kolben 180-200 µg/ml Gesamtalkaloid der gleichen Zusammensetzung, die in Beispiel 1 genannt wurde.
• Tab. 1 Zur Kultivation auf Agar verwendete Medien Medien Komponenten M10 NL 846 NL 829 NL 784 Biewürze (ungehopfte Vorderwürze, 15 %) 330 ml Hefeextrakt 3 g 0,5 g 3.0 g Saccharose 100,0 g 100,0 g Glucose 50,0 g Ammoniumcitrat 15,0 g L-Asparagin 10,0 g Neo-Pepton 3s0 g Ca(NO3)2 1,0 g 1,0 g KH2PO4 0,25g 0,25g 0,5 g FeS04.7H20 10,0 mg 20 mg 20 mg ZnSO4.7H20 4,4 mg 20 mg 17,6mg MgSO4.7H2O 0,3 g 0,25g 0,3 g KCl 0,2 g Agar-Agar 25-30 g 30 g 25-30 g 25-30 g Wasser ad 1000.0 ad 1ooo.o ad 1ooo.o ad 1000.0 pH 5.5 5.6-5.8 5.4-5.6 5.5 Sterilisa- 30 Min., 30 Min., 30 Min., 30 Min., tion 110°C 110°C 110°C 110°C

Claims (1)

1. Patentansprüche 1. Claviceps purpurea (Fr) Tul. MUT 168 2. Verfahren zur Darstellung von Ergosin, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Clavices)s purpurea (Fr) Tul.

   MUT 168 in aerober submerser oder emerser Fermentation in einem flüssigen Nährmedium, welches eine Kohlenstoff-, eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 20-30°C und einem pH-Wert von 4.o-6.2 während eines Zeitraumes von 10-35 Tagen kultiviert und das gebildete Alkaloidgemisch aus etwa 90% Ergosin/Ergosinin und etwa 10% leicht abtrennbarer Clavinalkaloide auf dem üblichen Wege isoliert und getrennt wird 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei 22-250C und pH 5.2-5.9 durchgeführt wird.