DD212749A1 - Verfahren zur herstellung von ergocristin - Google Patents

Abstract

Um Ergocristin in ausreichenden Mengen fuer die Therapie zur Verfuegung zu stellen, wurde die Aufgabe gestellt, durch saprophytische Kultur eines Pilzstammes dieses Alkaloid zu produzieren, wobei ein hoher Anteil Ergocristin im Gesamtalkaloidgemisch erreicht werden sollte. Die Aufgabe wird geloest, indem man zur Herstellung von Ergocristin den sporenbildenen Stamm Claviceps purpurea (Fr.) Tul. DH82, ZIMET 43695, seine Mutanten oder Varianten einsetzt. Der Stamm wird, ausgehend von Sporen als Impfmaterial, in aerober submerser Fermentation unter Verwendung eines fluessigen Naehrmediums, welche eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthaelt, bei einer Temperatur von 20-30 Grad C und einem ph-Wert von 4,0-6,4 kultiviert. Der Stamm bildet nach 10 Tagen submerser Kultivation ein Gesamtalkaloidgemisch von 600-1000 myg/ml Kultursuspension, von denen 400-550 myg/ml Ergocristin sind.Mindestens 60% der Alkaloide sind aus dem Kulturfiltrat isolierbar.

Description

Verfahren zur Herstellung von Ergocristin

Anwendung sg et>i et der Erfindung

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ergocristin durch !Cultivation eines Stammes der Art Ciaviceps purpurea.

Von den mehr als 50 in der Natur gefundenen Mutterkornalkaloiden besitzen die Vertreter der Peptidgruppe die' bisher größte Bedeutung in der Medizin, so z.B. Ergotoxin-Alkaloide und Ergotamin. Zur Gruppe der Ergotoxin-Alkaloide gehört neben Ergocornin und Ergokryptin auch das Ergocristin. Das Ergocristin-Molekül setzt sich aus D-Lysergsäure und einem amidartigen Cyclolteil zusammen, der aus L-Valin, L-Prolin und L-Phenylalanin besteht. Dieses Alkaloid zeigt hypotensive Eigenschaften und wird vorteilhaft zur Therapie von peripheren Gefäßstörungen eingesetzt, oftmals in Kombination mit gleichen Teilen Ergocornin und Ergokryptin. Andererseits kann das Ergocristin zu Partialsynthesen als Schlüsselverbindung eingesetzt werden. . .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Ergocristin gehört zu den typischen Alkaloiden der Art CIaviceps purpurea (Fr.) TuI. und kommt in vielen parasitischen Stämmen vor. Ebenso bildet eine Reihe von Stämmen Ergocristin saprophytisch. Aber nur wenige Fälle sind bislang bekannt geworden, in denen das Alkaloid Ergocristin durch submerse Fermentation in befriedigender Menge produziert wird.

Diese Verfahren weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf. Beispielsweise ist der Stamm Claviceps purpurea F.I. S40 (ATCC 20103) in der Lage, Ergocristin in Mengen "bis zu •950 yug/ml zu "bilden. Nebenalkaloide wurden nicht erwähnt. Der Stamm bildet keine Sporen (US-Pat. 3.567.583). In der BRD-OS 2 816 773 wird mitgeteilt, daß infolge fehlender Sporen Mycelbruchstücke des Stammes ATCC 20 103 einer Mutation (UV) unterworfen wurden, um auf diesem Wege auxotrophe Mutanten zu erzeugen. Mit Hilfe der gewonnenen Mutanten sind Derivate des Ergocristins gewinnbar, indem Analoge von Aminosäuren, gegenüber denen der Stamm auxotroph ist, verfüttert werden. Der neuisolierte Stamm bildet bis zu 750 yug Peptidalkaloide/ml Kultursuspension, von denen je nach Art der verfütterten Aminosäure 35 # Ergocristin darstellen.

Der Stamm Claviceps purpurea ATCC 20 103 und seine Mutanten neigen stark zur Sektorenbildung, da es sich um Heterokarien handelt (siehe z.B. C. SPALLA et al. in "Fermentation Advances", ed. D. PERIMAN, Acad. Press 1969, 611-628). Die einzelnen Sektoren zeigern z.T. sehr verschiedene physiologische Eigenschaften durch Segregation der einzelnen Kerne. So lassen einzelne Sektoren in ihrer Fähigkeit zur Alkaloidbildung sehr stark nach. Die Alkaloidbildung kann unter Umständen ganz ausbleiben. Diese Eigenschaft stellt ein Hindernis für eine kontinuierliche Produktion dar, da ständig umfangreiche Selektionsmaßnahmen notwendig werden. Außerdem sind der eingesetzte Stamm und dessen Mutanten frei von Konidien, so daß zur Kultivation aufwendige Vorarbeiten gehören, wie z.B. ein· Homogenisieren des Mycels. Auf diese Weise ist z.B. eine ausreichende Standardisierung des Impfmaterials, die eine entscheidende Voraussetzung für eine rationelle Produktion darstellt, schwer möglich.

Schweizer Autoren berichten über die Mischkultur eines Stammes, der Ergocristin bildet, mit einem ergocornin- und ergokryptinbildenden Stamm, um ein dem natürlichen Ergotoxin entsprechendes Alkaloidgemisch zu erhalten. Der ergocristinbildende Stamm Eoh k 420 wurde durch Isolation von einem

Sklerotium und nachfolgende Mutation erhalten. Er "besitzt Sporen,und nach mindestens 14 Tagen Kulturzeit enthält die Kultur suspension "bis 200 - 330 /ig Ergocristin/Ergocristinin pro ml (Schweiz. Pat. 577 556). Weiterhin ist eine Kultivati-on des Stammes nur in Mischfermentation "beschrieben. Es fehlen bislang alle Angaben über die Eignung des Stammes Ech k Λ20 für eine Einzelkultur. Außerdem befindet sich unter den Nebenalkaloiden auch das Peptidalkaloid Ergosin. Durch die sich daraus ergebenden technischen Probleme bei der Isolierung wird die ökonomische Effektivität des Verfahrens beeinträchtigt . ,

₁ der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, Ergocristin nach einem ökonomisch vorteilhaften Verfahren zu produzieren, um es für den Einsatz in der Medizin in ausreichenden Mengen zur "Verfügung zu stellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem durch saprophytische Kultivation eines. Pilzstammes Ergocristin herstellbar ist, wobei der ergocristinbildende Stamm folgende Eigenschaften aufweisen soll:

1. Stabilität und gute Fermentationseigenschaften,

2. einen hohen Anteil Ergocristin im Alkaloidspektrum,

3. Fähigkeit zur Sporenbildung,

4. Vorliegen eines homokaryotischen Mycels.

Erfindungsgemäß werden zur Herstellung von Ergocristin der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. DH 82, seine Mutanten oder Varianten verwendet.

Der neue Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. DH 82 ist beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR in Jena unter der Bezeichnung ZIMET'α3^35~ hinterlegt. Er bildet eine für stabile fermentationstechnische Bedingungen äußerst vorteilhafte

Menge von Sporen mit einer hohen Potenz zur Alkaloidsynthese und mit Hilfe assimilierbarer Kohlen- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthaltender Nährmedien in Submerskultur innerhalb von 10 Tagen ein Gesamtalkaloidgemisch von 600 1000 /ig/ml Kultur suspension "bzw. 400 - 550/ig Ergocristin/ml Kultursuspension. Isolation und Reinigung können auf den an sich "bekannten Wegen erfolgen, wobei mindestens 60 ⁰Zo der Alkaloide aus dem Kulturfiltrat isolierbar sind. Die bei der Aufarbeitung anfallenden isomeren Alkaloide Ergocristin und Ergocristinin können auf übliche Weise ineinander überführt werden. ^:

Der neue Stamm bildet auf festen Medien keine Sektoren, da er kein Heterokaryon ist. In Verbindung mit der Sporenbildung ist so die Gewinnung von leistungsstabilem, standardisiertem Impfmaterial für die Fermentation erleichtert und das erfindungsgemäfie Verfahren ökonomisch vorteilhaft.

Die Kultivation zur Charakterisierung von Claviceps pur^urea (Fr.) TuI. DH 82, Zni3T*J6?r, erfolgt auf bzw. in den in. Tabelle 1 zusammengestellten Medien. Der neue Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften:

Makroskopisches Aussehen:

Alter der Agarkulturen: 4 Wochen

Agarmedium: Nährboden 829

Rasen gefurchte graubraunviolette Oberfläche, samtig.

EK: erhabene krater- und napfkuchenartige Form,

jÖ 0,5 - 1 cm « Oberfläche*-samtig, Barbe graubraun-violett

Vorkultur NL 187: '

4 Tage alt: hellbeige, breiartig, vorwiegend fasriges Mycel;

Hauptkultur NL 720:

10 Tage alt: feinfasriges, teilweise grießartiges Myeel.. Die Mycelsuspension ist "braun-violett. Die Kultur zeigt im UV-Licht starke Fluoreszenz.

Mikroskopisches Aussehen:

Yorkultur NL 187:

4 Tage alt: dünnes, filamentöses Mycel, 0 3-4 jum, wandständiges Plasma.

Hauptkultur NL 720:

10 Tage alt: stark segmentiertes Mycel, "semmelartig", mit blasenartigen Anschwellungen. Die Zellwand ist verdickt. Das Plasma ist zentralständig, 0 5-13 /im.

Das Mycel enthält Lipidtröpfchen.

Die Anzucht von Konidiosporen erfolgt als Schrägagarkultur mit assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen "sowie Nähr- und Spurenelemente enthaltenden Medien in üblichen, Kulturgefäßen.

Die aerobe Fermentation des Pilzes zur Produktion von Ergocristin erfolgt zweckmäßigerweise in flüssigen Nährmedien in submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie beispielsweise Saccharose, Glucose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronensäure, eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydrolysat oder ein Ammoniumsalz sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in Schüttelkolben oder in Fermentoren durchgeführt werden. Sie erfolgt ein- bis dreistufig. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Vorkultur 3-6 Tage alt und das Impfverhältnis Vorkultur : Hauptkultur 1:5 bis 1:20 ist. Die Hauptkultur dauert 7 bis 10 Tage. Der pH-Wert kann zwischen 4,0 und 6,4, die Temperatur zwischen 20 und 30 ⁰C liegen. Optimal verläuft die Ferraenta tion bei 22 - 25 ⁰C und pH 5,2 - 5,9. Die Stammerhaltung kann über Schrägagarkulturen (Röhrchen

oder Eprouvetten), durch Tiefkühllagerung unter Verwendung von Schutskolloiden, wie z.B. 60 # Saccharoselösung: Mager_: milch (2:1), oder durch lyophilisierte Konserven auf übliche Weise erfolgen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Die verwendeten Nährmedien sind Tabelle 1 zu entnehmen.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Zur Anzucht von Konidiosporen wird aus einer lyophil getrocknete Sporen enthaltenden Stammkonserve des Stammes CIaviceps purpurea (Fr.) TuI. DH 82, ZIMET eine Suspension hergestellt, die auf den Nährboden 829 (vgl. Tab. 1) übertragen und als Schrägagarkultur 14 - 18 Tage bei 24 ⁰C bebrütet wird

Als Impfmaterial für Submerskulturen werden nach diesem Ver-

7 R

fahren in 25-ml-Röhrchen zwischen 10 - 10 3poren/Röhrchen erhalten, mit denen bei Bedarf bis zu 1200 ml Nährlösung beimpft werden können.

Beisj>iel_2

Die Sporen einer gemäß Beispiel 1 angezogenen Impfmaterialkultur werden suspendiert und ein Teil davon als Inokulura auf Stehrundkolben (Fassungsvermögen 500 ml) mit je 120 ml Vorkulturmedium NL 187 (vgl. Tab. 1) verteilt. Die Kolben werden^ bei ^24 ⁰Q auf^, einex Rundschwings^chüttelma^chin.e _k (190 U/min) geschüttelt. Nach 4 Tagen wird der Inhalt der Kolben im Verhältnis 1:10 auf Stehrundkolben (Fassungsvermögen 500 ml) mit je 120 ml Hauptkulturmedium NL 720 (vgl. · Tab.* 1). überimpft. Diese Kolben werden unter den gleichen Bedingungen wie zuvor geschüttelt.

Nach 10 Tagen Kulturseit unter den beschriebenen Bedingungen enthielten die Kulturen 920 yug Gesamtalkaloid/ml Kulturfiltrat bzw. 510 yug Ergocristin/Ergocristinin/ml Kultursus-

pension, die nach "bekannten Verfahren aufgearbeitet und isoliert werden.

BeispjLel_3 .

Mit je 150 ml der im Beispiel 2 "beschriebenen Vorkultur werden 8 Glasfermenter (Fassungsvermögen 2 l) "beimpft. Die Fermenter enthalten je 1,5 1 Nährlösung 174 B (vgl. Tab. 1). Die Fermentation erfolgt bei 24 ⁰C. Die Belüftungsrate beträgt 23 1 Luft/lgj/h, nach Bedarf erfolgt eine Antischaummittelzugabe. Mit Kulturende enthält die Kulturflüssigkeit 920 jug Gesamtalkaloid/ml Kulturfiltrat und 400 /ig Ergocristin/ Ergocristinin/ml Kultursuspension.

Beispiel 4

Zur Identifizierung der Alkaloide werden 10 ml Kultursuspension alkalisiert und mit Hilfe eines Homogenisators (Ultra-Turrax) mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf 5 ml eingeengt und davon 2 ml durch präparative Schichtchromatographie an Kieselgel mit Fluoreszenzindikator (Lösungsraittelsystem Chloroform : Methanol : Eisessig = 85 : 10 : 5) getrennt. Die Alkaloidflecke werden abgeschabt, mit einer Mischung von Methanol : V/asser : Eisessig = 45 : 45 : 10 aufgenommen und mit van Urk's Reagens zentrifugiert. Der Überstand wird mit einer Quarzlampe 5 Minuten bestrahlt und die Extinktion im Photometer bestimmt. Die Zuordnung der Alkaloide erfolgte durch Cochromatographie mit reinen Testsubstanzen. Die Alkaloidmengen können unter gleichen Bedin-,gungen aufgestellten Eichkurven entnommen werden. Die präparative Gewinnung der Peptidalkaloide wird auf folgende Weise durchgeführt: Mehrere Liter Kultursuspension werden alkalisch gestellt (pH = 8,0), erschöpfend mit Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Rohalkal.oidgemisch wird in wenig Chloroform gelöst und mit präparativer Schicht- oder Säulenchromatographie getrennt (Kieselgel 1^254 ^0<3-^er Kieselgel; Fließmittel Chloroform : Methanol : Eisessig =85 : 10 : 5). Die Identifizierung des Ergocristins erfolgt mittels

Massenspektroskopie: m/e.'395, 378, 363, 342, 31.4, 272, 262, 250, 244, 223, 201, 180, 173, 167, 153. Ein Molpeak ist nicht nachweisbar. Die charakteristischen Peaks sind unterstrichen. Diese Verbindung gibt die Keller¹sehe und van TJrk'sche Reaktion.

Tabelle 1

Zusammensetztmg der verwendeten Nährlösungen (Angaben in g/l)

NL 829 NL 187 NL 720

NL 174 B

Saocharöse	100,0	100,0	200,0	200,0
Sojamehl	-	5,0		-
Maisquellwasser	-	5 ml	—	—
Zitronensäure	-	-	-	18,5
Ammoniumcitrat p.a.	—	—	15,0	-
Ammoniak	. —	-	-	13,5ml
Asparagin	10,0	-	-	-
Hefeextrakt	0,5	—	—	-
Ca(N03)2 pur.	1,0	—	1,0	-
KHpPO, pur.	0,25	0,5	0,25	0,75
MgSO. . 7H2O p.a.	0,25	0,3	0,3	0,9
FeSO. . 7H2O p.a.	0,020	0,007	0,010	0,03
ZnSO. · 7H2O p.a.	0,02	0,006	0,0308	0,012
KCl p.a.	-	-	0,1	0,1
Aqua dest. ad	1000,0	1000,0	1000,0	1000,0
Agar-Agar	30,0		-	-.
pH vor dem Sterilisieren	5,4	5,2 5	,2-5,4.	5,3-5,4
pH-Einstellung mit	NaOH	NaOH	NaOH	NH.OH

Autoklavieren

jeweils einheitlich bei 110 ⁰C für 30 Min.

Claims (2)

1. Erfindun^sanspruch . .

   1. Verfahren zur Herstellung von Ergocristin, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. DH 82, ZIMET&?6&S~₉ seine Mutanten und Varianten verwendet werden.

   .JZ, Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit

   dem Stamm Claviceps purpurea (Fr.) TuI. DH 82, ZIMET *369S~ unter saprophytisehen Bedingungen Konidiosporen angezogen, diese Sporen als Impfmaterial für Submerskulturen verwen- J det, diese Kulturen in einem flüssigen Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, aerob bei einer Temperatur von 20 - 30 ⁰C und einem pH-Wert von 4,0 bis 6,4 während eines Zeitraumes von 7-10 Tagen fermentiert und das gebildete Ergocristin/Ergocristinin aus den Kultursuspensionen auf an sich bekannte Weise isoliert wird.
2. 3. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentati'
   durchgeführt wird.

   daß die Fermentation bei 22 - 25 ⁰G und pH 5,2 - 5,9