CH637657A5

CH637657A5 - Process for the production of ergosine

Info

Publication number: CH637657A5
Application number: CH121778A
Authority: CH
Inventors: Detlef Prof Dr Groeger; Sc Hans-Peter Dr Schmauder; Siegfried Prof Dr Johne; Walter Dr Maier; Dieter Dr Erge
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1977-02-04
Filing date: 1978-02-03
Publication date: 1983-08-15
Also published as: HU181031B; DD129801A1; DE2801453A1; DD129801B1; SU956560A1; YU24778A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Ergosin. The invention relates to a method for the production of ergosine.

Anwendungsgebiet der Erfindung: Field of application of the invention:

Von den über 50 bisher natürlich bekannten Mutterkornal-kaloiden besitzen die Vertreter der Peptidgruppe eine grosse Bedeutung in der Medizin, so z.B. Ergotamin, Ergocornin, Ergokryptin und Ergocristin. Das Ergosin steht dem Ergotamin sehr nahe und unterscheidet sich vom letzteren nur durch Austausch der Aminosäure Phenylalanin gegen die Aminosäure Leucin in der Cyclolseitenkette. Of the over 50 naturally occurring ergot kaloids, the representatives of the peptide group are of great importance in medicine, e.g. Ergotamine, Ergocornin, Ergocryptin and Ergocristin. Ergosine is very close to ergotamine and differs from the latter only by replacing the amino acid phenylalanine with the amino acid leucine in the cyclol side chain.

Ergosin wirkt wie andere Mutterkornalkaloide vom Pep-tidtyp utretonisch sowie vasokonstriktorisch und ist deshalb für die Medizin von Bedeutung. Auch ist das Ergosin eine Schlüsselverbindung für Partialsynthesen. (Zu den Strukturen der genannten Peptidalkaloide vergleiche Abb. 1.) Like other ergot alkaloids of the peptide type, ergosine has a utretonic and vasoconstrictive effect and is therefore of importance for medicine. Ergosine is also a key link for partial syntheses. (For the structures of the peptide alkaloids mentioned, see Fig. 1.)

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Characteristics of the known technical solutions:

Bisher sind kaum Verfahren bekannt geworden, nach denen saprophytisch Ergosin gewonnen werden kann. So far, hardly any methods have been known by which ergosine can be obtained saprophytically.

In einem Britischen Patent ist beschrieben, dass neben Ergokryptin, Ergocornin und Ergometrin als Hauptalkaloide (30%, 28% bzw. 22%) auch Ergosin in Mengen von 5% A British patent describes that in addition to ergocryptin, ergocornin and ergometrin as main alkaloids (30%, 28% and 22%), ergosin in amounts of 5%

gebildet wird (Brit. Pat. 1401406 vom 20.7.1973). is formed (British Pat. 1401406 dated July 20, 1973).

In anderen Patenten wird die gleichzeitige Gewinnung von Ergocornin und Ergosin, zwei Peptidalkaloiden, nebeneinander geschützt. Der geschützte Stamm bildet beide Alka-loide bzw. ihre Isomeren Ergocorninin und Ergosinin in etwa gleichen Mengen bei einem Gesamtalkaloidgehalt von etwa 900-1100 [ig/ml Nährlösung (Brit. Patent 1 184039 vom 21.2.1969). In other patents, the simultaneous production of ergocornin and ergosin, two peptide alkaloids, is protected side by side. The protected strain forms both alkaloids or their isomers ergocorninin and ergosinin in approximately equal amounts with a total alkaloid content of approximately 900-1100 [ig / ml nutrient solution (British Patent 1 184039 of February 21, 1969).

Ein grosser Nachteil der genannten Verfahren ist einmal der geringe Anteil an Ergosin bzw. das Vorliegen von eng verwandten Peptidalkaloiden nebeneinander, die erst auf kompliziertem Wege voneinander getrennt werden müssen. A major disadvantage of the processes mentioned is the low proportion of ergosin or the presence of closely related peptide alkaloids next to one another, which first have to be separated from one another in a complicated manner.

Ziel der Erfindung: Purpose of the invention:

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Gewinnung von Ergosin zu entwickeln, bei dem die ökonomisch aufwendige Abtrennung verwandter Peptidalkaloide nicht erforderlich ist. The aim of the invention is to develop a process for the production of ergosin in which the economically complex separation of related peptide alkaloids is not necessary.

Darlegung des Wesens der Erfindung: State of the Invention:

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Stämme zu isolieren, die 1. in der Lage sind, saprophytisch Ergosin zu bilden, das nahezu frei ist von Nebenalkoloiden, und 2. sich durch Stabilität und gute Fermentationseigenschaften auszeichnen. The invention is therefore based on the object of isolating strains which are 1. able to form saprophytic ergosine which is almost free of secondary alkoloids, and 2. are characterized by stability and good fermentation properties.

Es wurde von Wildstämmen (PUR 13, PUR 50) der Art Claviceps purpurea (Fr) Tul., isoliert im Raum Halle (DDR), It was isolated from wild trunks (PUR 13, PUR 50) of the species Claviceps purpurea (Fr) Tul. In the Halle area (GDR),

von auf Roggen gewachsenen Sklerotien, die Ergotamin bildeten, ausgegangen. Diese Wildstämme waren in von Alka-loiden. Durch Mutation dieser Linien mit UV-Licht konnten Stämme isoliert werden, die saprophytisch frei von Alka-loiden waren, die aber deutliche morphologische Veränderungen (plektenchymatische Strukturen) aufwiesen. Bei einigen Stämmen waren die Aktivitäten von Enzymen der Aromatenbiosynthese, verglichen mit der Ausgangsform deutlich erhöht. Nach Zweitmutation der morphologisch veränderten Selektanten konnte aus etwa 2000 Linien ein Stamm isoliert werden, der fähig ist, Ergosin zu bilden. Im Verlaufe dieser Arbeiten war es möglich, saprophytisch alkaloidfreies Pilzmaterial in eine produzierende Linie umzuwandeln und gleichzeitig das Alkaloidspektrum - bezogen auf das Sklero-tium - umzusteuern. Der isolierte Stamm hat die Bezeichnung CI. purpurea (Fr) Tul.Mut 168 und ist am 28. Januar 1977 beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Beuthenbergstr. 11, DDR-6900 Jena, unter der Bezeichnung IMET PA 134 hinterlegt worden; der Stamm ist der Öffentlichkeit zugängig. Er zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass er Ergosin und dessen Isomeres Ergosinin in Mengen bis zu etwa 90% neben etwa 10% eines leicht abtrennbaren Clavingemisches bildet. Der neue Stamm besitzt die folgenden makroskopischen und mikroskopischen Eigenschaften. from sclerotia grown on rye, which formed ergotamine. These wild tribes were in Alka-loiden. By mutating these lines with UV light, it was possible to isolate strains that were saprophytically free from alkaloids, but that showed clear morphological changes (plectic-chymatic structures). For some strains, the activities of aromatics biosynthesis enzymes were significantly increased compared to the starting form. After a second mutation of the morphologically modified selectants, a strain could be isolated from about 2000 lines that is capable of producing ergosine. In the course of this work, it was possible to convert saprophytically alkaloid-free mushroom material into a production line and at the same time to redirect the alkaloid spectrum - based on the sclerotium. The isolated strain is called CI. purpurea (Fr) Tul.Mut 168 and is on January 28, 1977 at the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of the GDR, Beuthenbergstr. 11, DDR-6900 Jena, deposited under the name IMET PA 134; the tribe is open to the public. It is particularly characterized by the fact that it forms ergosin and its isomer ergosinin in amounts of up to about 90% in addition to about 10% of an easily separable claving mixture. The new strain has the following macroscopic and microscopic properties.

Die Kultivation zur Charakteristik von Cl. pupurea MUT 168 erfolgte auf den in Tab. 1 zusammengestellten Agarme-dien. The cultivation of the characteristics of Cl. pupurea MUT 168 was performed on the agar services listed in Table 1.

Mikroskopisches Aussehen: Microscopic appearance:

Auf den in der Tabelle 1 genannten Agarmedien bestehen die Kolonien aus mehr oder weniger stark verzweigtem Mycel, das eine Dicke von durchschnittlich 4-5 u besitzt. An den Verzweigungen wurden 7-8 gemessen. Konidien wurden nicht beobachtet, auf üblichen Sporulationsmedien (z.B. MIO) zerfiel dagegen das Mycel in z.T. sehr kleine Bruchstücke (auch in flüssiger M10-Kultur). Fetttröpfchen in relativ geringer Anzahl konnten nur auf Medium 846 und 829 beobachtet werden. On the agar media mentioned in Table 1, the colonies consist of more or less branched mycelium, which has an average thickness of 4-5 u. 7-8 were measured at the branches. Conidia were not observed, on the other hand the mycelium disintegrated in part on common sporulation media (e.g. MIO). very small fragments (also in liquid M10 culture). A relatively small number of fat droplets could only be observed on medium 846 and 829.

Das Mycel der submersen Kulturen (ca. 14 Tage alt, Produktionsmedium) besteht aus langen verzweigten Hyphen mit einer Dicke von ca. 5 ji. Die Hyphen haben z.T. kugelförmig abgerundete Anschwellungen und enthalten viele Fetttröpfchen, Konidien wurden nicht beobachtet. The mycelium of the submerged cultures (approx. 14 days old, production medium) consists of long branched hyphae with a thickness of approx. 5 ji. Some of the hyphae spherical rounded swellings and contain many fat droplets, conidia were not observed.

Makroskopisches Aussehen: Macroscopic appearance:

Das makroskopische Aussehen wurde bei Kulturen festgestellt, die bei 24 ± 1°C auf Agarschalen (0 10 cm) während 14-16 Tagen gewachsen waren. Die Zusammensetzung der Medien ist Tab. 1 zu entnehmen. The macroscopic appearance was observed in cultures grown on agar plates (0-10 cm) at 24 ± 1 ° C for 14-16 days. The composition of the media is shown in Tab. 1.

Medium M10: sehr gutes Wachstum mit gefalteter, sich teilweise abhebender Oberfläche, braune Pigmentierung, Rückseite teilweise mit dunklen Flecken, keine Konidien. Medium 846: gutes Wachstum, Kolonien mit gefalteter, gekröseartiger Oberfläche, braun, Rückseite hellbraun, keine Konidien-Medium 829: gutes Wachstum. Die hellbraunen bis braunen Kolonien besitzen eine gefaltete, krause Oberfläche und einen unregelmässigen Rand. Die Rückseite ist hellbraun. Medium 784: gutes Wachstum. Die Kolonien haben eine braune Oberseite und eine farblose Unterseite. Sie sind gefaltet, kraus und besitzen einen unregelmässigen Rand. Keine Konidien. Medium M10: very good growth with a folded, partially lifting surface, brown pigmentation, the back partly with dark spots, no conidia. Medium 846: good growth, colonies with a folded, crumb-like surface, brown, reverse light brown, no conidia medium 829: good growth. The light brown to brown colonies have a folded, frizzy surface and an irregular border. The back is light brown. Medium 784: good growth. The colonies have a brown top and a colorless bottom. They are folded, frizzy and have an irregular border. No conidia.

2 2nd

s s

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

3 3rd

637 657 637 657

Die Kultivation des Pilzes zur Produktion erfolgt in flüssigen Nährmedien in emerser oder submerser Kultur. Die Nährmedien enthalten eine assimilierbare C-Quelle, wie beispielsweise Saccharose, Mannit, Sorbit, Glycerin, Zitronenoder Bernsteinsäure; eine assimilierbare N-Quelle, wie beispielsweise Ammoniak, Asparagin, Pepton, Caseinhydro-Iysat oder ein Ammoniumsalz, sowie Mineralsalze. Die Fermentation kann beispielsweise in Fernbach-, Erlenmeyer-oder Schüttelkolben oder im Fermenter erfolgen. Die Alka-loide sind grösstenteils (>80%) im Nährmedium enthalten und können auf üblichem Wege erhalten werden. Insgesamt wird während 10 bis 35 Tagen kultiviert. The mushroom is cultivated for production in liquid nutrient media in emersed or submerged culture. The nutrient media contain an assimilable C source, such as sucrose, mannitol, sorbitol, glycerin, citric or succinic acid; an assimilable N source, such as ammonia, asparagine, peptone, casein hydro-iysate or an ammonium salt, and mineral salts. The fermentation can take place, for example, in Fernbach, Erlenmeyer or shake flasks or in the fermenter. The alkali loids are mostly (> 80%) contained in the nutrient medium and can be obtained in the usual way. Cultivation takes a total of 10 to 35 days.

Die Kultivation erfolgt zweckmässigerweise ein- bis dreistufig. Es ist vorteilhaft, wenn die Vorkultur 5-12 Tage alt ist und das Impfverhältnis Vor- : Hauptkultur 1:5 bis 1:20 beträgt. Der pH-Wert liegt zwischen 4,0 und 6,2, die Temperatur beträgt 20 bis 30°C. Die Stammerhaltung kann über Röhrchen oder durch Tiefkühllagerung unter Verwendung von Schutzkolloiden, wie z.B 60% Saccharoselösung + Magermilch = 2:1, auf üblicher Weise erfolgen. The cultivation is expediently carried out in one to three stages. It is advantageous if the pre-culture is 5-12 days old and the vaccination ratio pre: main culture is 1: 5 to 1:20. The pH is between 4.0 and 6.2, the temperature is 20 to 30 ° C. The strain can be kept in the usual way via tubes or by deep-freeze storage using protective colloids, such as 60% sucrose solution + skim milk = 2: 1.

Ausführungsbeispiele: Examples:

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern: The following examples are intended to illustrate the invention:

Beispiel 1 example 1

Ausgehend von Schrägröhrchen des Stammes MUT 168 wurden durch Zermörsern des Mycels Vorkulturen von 100 ml Medium 821 in 500 ml Schüttelkolben beimpft. Das Medium hat folgende Zusammensetzung: Starting from oblique tubes of the strain MUT 168, precultures of 100 ml of medium 821 in 500 ml shaking flasks were inoculated by crushing the mycelium. The medium has the following composition:

Saccharose 200 g Sucrose 200 g

Ammoniumeitrat 15 g Ammonium citrate 15 g

Ca(NÛ3)2 1 g Ca (NÛ3) 2 1 g

KH2PO4 0,25 g KH2PO4 0.25 g

MgS04-7H20 0,3 g MgS04-7H20 0.3 g

FeS04-7H20 10 mg FeS04-7H20 10 mg

ZnSCWHîO 30,8 mg ZnSCWHîO 30.8 mg

KCl 0,1 g KCl 0.1 g

Hefeextrakt 3,0 g Yeast extract 3.0 g

Wasser ad 1000.0 Water ad 1000.0

pH (vor dem Sterilisieren) 5,8 - 6,0 Sterilisation 30 Min. bei 110°C. pH (before sterilization) 5.8 - 6.0 Sterilization 30 min at 110 ° C.

Die Kolben wurden 7 Tage bei 24 ± 1°C bei 200 Upm bebrütet. 10% der erhaltenen Kulturen dienten dazu, 500 ml Kolben mit je 100 ml Medium 720 der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: The flasks were incubated for 7 days at 24 ± 1 ° C at 200 rpm. 10% of the cultures obtained were used to inoculate 500 ml flasks with 100 ml medium 720 of the following composition:

Saccharose 200 g Sucrose 200 g

Ammoniumeitrat 15 g Ammonium citrate 15 g

Ca(NCh)2 1 g Ca (NCh) 2 1 g

KH2PO4 0,25 g KH2PO4 0.25 g

MgS04-7H20 0,3 g MgS04-7H20 0.3 g

FeS04-7H20 10 mg FeS04-7H20 10 mg

ZnS04 • 7H2O 30,8 mg ZnS04 • 7H2O 30.8 mg

KCl 0,1 g KCl 0.1 g

Wasser ad 1000.0 Water ad 1000.0

Nach 12—21 tägiger Bebrütung unter den für Vorkulturen beschriebenen Bedingungen enthielten die Kulturen 180-280 ji.g/ml Gesamtalkaloid, bestehend aus 90% eines Gemisches von Ergosin und Ergosinin und 10% eines Clavi-nalkaloidgemisches. Die Alkaloide können nach an sich bekannten Verfahren isoliert und gereinigt werden. After incubation for 12-21 days under the conditions described for pre-cultures, the cultures contained 180-280 ji.g / ml total alkaloid, consisting of 90% of a mixture of ergosin and ergosinin and 10% of a Clavinalkaloid mixture. The alkaloids can be isolated and purified by methods known per se.

Beispiel 2 Example 2

10% der in Beispiel 1 beschriebenen Vorkultur wurden in 400 ml Fernbachkolben mit 100 ml des Mediums 720 überführt. Bei 24 ± 1 °C wurden die Kolben bebrütet und nach 20 Tagen Kultivation das emerse Mycel vom Medium abgetrennt. Die Kolben enthielten 250-350 (ig Gesamtalkaloid pro ml Nährmedium, das die gleiche Zusammensetzung besass, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Identifizierung der Alkaloide erfolgte in der folgend beschriebenen Weise: 10% of the preculture described in Example 1 was transferred to 400 ml Fernbach flasks with 100 ml medium 720. The flasks were incubated at 24 ± 1 ° C and after 20 days of cultivation the emerse mycelium was separated from the medium. The flasks contained 250-350 (ig total alkaloid per ml of nutrient medium, which had the same composition as described in Example 1. The alkaloids were identified in the following manner:

Nach 20tägiger Fermentation der Oberflächenkultur enthalten die Kulturen 300 jxg/ml Alkaloidgemisch. 10 ml werden alkalisiert und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird auf 5 ml eingeengt und davon 2 ml durch präparierte Schichtchromatographie an Kieselgel mit Fluorescenzindikator (Lösungsmittelsystem Chloroform: Äthanol (8:2)) getrennt. Die Alkaloidflecke werden abgeschabt und mit einer Mischung von Wasser: Methanol: Eisessig (45:45:10) aufgenommen und anschliessend mit van UrkTs Reagenz im Verhältnis (1:2) versetzt. Die blau gefärbten Lösungen werden zentrifugiert, der Überstand mit einer Quarzlampe 5 Min. bestrahlt und die Extinktion im Photometer bestimmt. Die Alkaloidmengen können unter gleichen Bedingungen aufgestellten Eichkurven entnommen werden. Das Alkaloidgemisch dieses Stammes hat folgende Zusammensetzung: Ergosin 65%; Ergosinin 25%, Clavine 10%. After 20 days of fermentation of the surface culture, the cultures contain 300 μg / ml alkaloid mixture. 10 ml are alkalized and extracted exhaustively with chloroform. The extract is concentrated to 5 ml and 2 ml of it are separated by prepared layer chromatography on silica gel with a fluorescence indicator (solvent system chloroform: ethanol (8: 2)). The alkaloid stains are scraped off and taken up with a mixture of water: methanol: glacial acetic acid (45:45:10) and then mixed with van UrkT's reagent in the ratio (1: 2). The blue colored solutions are centrifuged, the supernatant is irradiated with a quartz lamp for 5 minutes and the extinction is determined in the photometer. The amounts of alkaloid can be found under the same conditions as calibration curves. The alkaloid mixture of this strain has the following composition: Ergosin 65%; Ergosinin 25%, Clavine 10%.

Die präparative Gewinnung der Peptidalkaloide kann auf folgende Weise durchgeführt werden: 2,5 Liter Nährlösung werden alkalisch gestellt (pH 9) und erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte dampft man im Vakuum ein. Daraus resultieren 690 mg Rohalkaloidgemisch. Dieses Material wird in wenig Chloroform gelöst und an einer Kieselgel-Säule chromatographiert. Als Elutionsmittel dient Chloroform, dem steigende Mengen Äthanol (bis 15%) zugesetzt werden. Es bilden sich zwei getrennte, im UV-Licht blau fluorescierende Zonen. Die rascher wandernde Zone ergab Ergosinin. Nach Umkristallisieren aus Methanol werden 150 mg Ergosinin (C30H37O5N5) erhalten, Fp 225°C. Md = +394° (c = 1% Chloroform). Hochaufgelöstes Massenspektrum m/e: 547 (M+); Gef. 547,2807, Ber. 547,2794 für C30H37O5N5. Weitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221 ; 210; 167; 154. Das Eluat der langsamer wandernden Zone enthielt 350 mg Ergosin (C30H37O5N5). Massenspektrum m/E: 547 (M+). Weitere prominente Fragmente m/e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154. The preparative preparation of the peptide alkaloids can be carried out in the following way: 2.5 liters of nutrient solution are made alkaline (pH 9) and extracted exhaustively with chloroform. The combined extracts are evaporated in vacuo. This results in 690 mg crude alkaloid mixture. This material is dissolved in a little chloroform and chromatographed on a silica gel column. Chloroform is used as the eluent, to which increasing amounts of ethanol (up to 15%) are added. Two separate zones are formed which fluoresce blue in UV light. The faster moving zone gave ergosinin. After recrystallization from methanol, 150 mg of ergosinin (C30H37O5N5) are obtained, mp 225 ° C. Md = + 394 ° (c = 1% chloroform). High-resolution mass spectrum m / e: 547 (M +); Found 547.2807, calc. 547.2794 for C30H37O5N5. Other prominent fragments m / e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154. The slow moving zone eluate contained 350 mg ergosine (C30H37O5N5). Mass spectrum m / E: 547 (M +). Other prominent fragments m / e: 280; 267; 224; 221; 210; 167; 154.

In beiden Fällen ist die Keller'sche und van Urk'sche Reaktion positiv, und das Absorptionsspektrum im UV zeigt bei X = 312 m/(i ein Maximum. In both cases, the Keller and Van Urk reactions are positive and the absorption spectrum in the UV shows a maximum at X = 312 m / (i.

Bei der sauren Hydrolyse entstehen jeweils Leucin und Prolin. Die alkalische Hydrolyse liefert Lysergsäure (Ergosin) bzw. Isolysergsäure (Ergosinin). Acid hydrolysis produces leucine and proline, respectively. Alkaline hydrolysis provides lysergic acid (ergosin) or isolysergic acid (ergosinin).

Auch das chromatographische Verhalten der beiden isolierten Peptilalkaloide stimmt mit authentischem Ergosin bzw. Ergosinin überein. Eine Umwandlung der Alkaloide ineinander nach bekannten Methoden ist möglich. The chromatographic behavior of the two isolated peptile alkaloids also agrees with authentic ergosin and ergosinin. The alkaloids can be converted into one another by known methods.

Beispiel 3 Example 3

Ausgehend von Schrägröhrchen werden nach dem in Beispiel 1 genannten Verfahren Vorkulturen in 500 ml Schüttelkolben mit 100 ml des Mediums 815, dessen Zusammensetzung nachfolgend angegeben ist, angesetzt. Starting from inclined tubes, precultures are prepared in 500 ml shake flasks with 100 ml of the medium 815, the composition of which is given below, using the method mentioned in Example 1.

Saccharose 300 g Sucrose 300 g

KH2PO4 0,5 g KH2PO4 0.5 g

NaN03 2,0 g NaN03 2.0 g

Hefeextrakt 0,1 g Yeast extract 0.1 g

MgS04-7H20 0,6 g MgS04-7H20 0.6 g

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

637 657 637 657

4 4th

KCl KCl

FeS04-7H20 Wasser ad pH (vor dem Sterilisieren) 5,5-5,8 Sterilisation 30 Min. bei 110°C. FeS04-7H20 water ad pH (before sterilization) 5.5-5.8 sterilization 30 min. At 110 ° C.

0,5 g 10 mg 1000.0 ml 0.5 g 10 mg 1000.0 ml

Nach der Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen wurden 10% der Vorkultur in 500 ml Schüttelkolben mit 100 ml Medium 833 übertragen, das die folgende Zusammensetzung hat: After the incubation under the conditions mentioned in Example 1, 10% of the preculture was transferred to 500 ml shake flasks with 100 ml medium 833, which has the following composition:

Saccharose Ammoniumeitrat Sucrose ammonium citrate

300 g 20 g 300 g 20 g

Ca(N03> Ca (N03>

KH2PO4 KH2PO4

MgS04-7H20 MgS04-7H20

FeS04-7H20 FeS04-7H20

ZnS04-7H20 ZnS04-7H20

Wasser ad pH (vor dem Sterilisieren) 5,4-5,7 Sterilistion 30 Min. bei 110°C. Water ad pH (before sterilization) 5.4-5.7 Sterilization 30 min. At 110 ° C.

lg 0,25 g 0,3 g 10 mg 30,8 mg 1000.0 ml lg 0.25 g 0.3 g 10 mg 30.8 mg 1000.0 ml

10 Nach 14tägiger Inkubation unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen enthielten die Kolben 180-220 [ig/ml Gesamtalkaloid der gleichen Zusammensetzung, die in Beispiel 1 genannt wurde. 10 After 14 days of incubation under the conditions mentioned in Example 1, the flasks contained 180-220 [ig / ml total alkaloid of the same composition that was mentioned in Example 1.

Tabelle I Table I

Zur Kultivation auf Agar verwendete Medien Media used for cultivation on agar

Komponenten Components

MIO MILL

Medien media

NL846 NL829 NL846 NL829

NL784 NL784

Bierwürze Wort

(ungehopfte Vorderwürze, 15%) 330 ml (bare front wort, 15%) 330 ml

Hefeextrakt 3 g Yeast extract 3 g

Saccharose Glucose Sucrose glucose

Ammoniumeitrat Ammonium citrate

L-Asparagin L-asparagine

Neo-Pepton Neo-peptone

Ca(NCb)2 Ca (NCb) 2

KH2PO4 KH2PO4

FeS04-7H20 FeS04-7H20

ZnS04-7H20 ZnS04-7H20

MgS04-7H20 MgS04-7H20

KCl KCl

Agar-Agar Agar Agar

Wasser ad pH Water ad pH

Sterilisation sterilization

25-30 g 1000.0 5.5 25-30 g 1000.0 5.5

30 Min., 110°C 30 min., 110 ° C

ad ad

100,0 g 15,0g 100.0 g 15.0 g

1,0 g 0,25 g 10,0 mg 4,4 mg 0,3 g 0,2 g 30 g 1000.0 5.6-5.8 1.0 g 0.25 g 10.0 mg 4.4 mg 0.3 g 0.2 g 30 g 1000.0 5.6-5.8

30 Min., 110°C 30 min., 110 ° C

ad ad

0,5 g 100,0 g 0.5 g 100.0 g

10,0g 10.0g

1,0 g 0,25 g 20 mg 20 mg 0,25 g 1.0 g 0.25 g 20 mg 20 mg 0.25 g

25-30 g 25-30 g

1000.0 1000.0

5.4-5.6 5.4-5.6

30 Min., 110°C 30 min., 110 ° C

ad ad

3,0 g 50,0 g 3.0 g 50.0 g

3,0 g 3.0 g

0,5 g 20 mg 17,6 mg 0,3 g 0.5 g 20 mg 17.6 mg 0.3 g

25-30 g 1000.0 5.5 25-30 g 1000.0 5.5

30 Min., 110°C 30 min., 110 ° C

Risj-I/Rj? Risj-I / Rj?

«C Û «C Û

H .CO-MH-^ . >-CH5 , h 'Rj H .CO-MH- ^. > -CH5, h 'Rj

(1) R3— — CHz (1) R3— - CHz

: Ergotamin : Ergotamine

-ch5 . -ch5.

(2) R1.R2-HJ R3= CM2-C>I' - : Ergosin (2) R1.R2-HJ R3 = CM2-C> I '-: Ergosin

CH5 CH5

(3) Ri, ß2= ch5; R3- -cfH* : Ergocornin (3) Ri, β2 = ch5; R3- -cfH *: Ergocornin

CHj CHj

(4) Ri,R2=CHj; r3—ch2-ch 5 : oc-Ergokryptin (4) Ri, R2 = CHj; r3-ch2-ch 5: oc-ergocryptin

CH^ CH ^

Abb. 1. Strukturformeln einiger Cyclolalkaloide des Mutterkorns Fig. 1. Structural formulas of some ergot cyclol alkaloids

Claims

637657 PATENT CLAIMS

1. Process for the preparation of ergosin, characterized in that the strain Claviceps purpurea (Fr) Tul. IMET PA 134 in aerobic submerged or emersal fermentation in a liquid nutrient medium containing a carbon, a nitrogen source and mineral salts, at a temperature of 20 to 30 ° C and a pH of 4.0 to 6.2 for a period cultivated for 10 to 35 days and the alkaloid mixture formed is isolated and separated from approximately 90% ergosin / ergosinin and approximately 10% easily separable clavinalkaloids.

2. The method according to claim 1, characterized in that the fermentation is carried out at 22 to 25 ° C and pH 5.2 to 5.9.