DE3119196A1

DE3119196A1 - "METHOD FOR OBTAINING NEW MUSHROOM STEMS SUITABLE FOR THE PRODUCTION OF ANTIBIOTICS"

Info

Publication number: DE3119196A1
Application number: DE19813119196
Authority: DE
Inventors: Karl Prof. Dr. Dipl.-Biologe 4630 Bochum Esser; Walter Dipl.-Biologe Minuth; Miroslav Dipl.-Biologe 6000 Frankfurt Mracek; Georg Dr. 6238 Hofheim Nesemann
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1981-05-14
Filing date: 1981-05-14
Publication date: 1982-12-09
Also published as: EP0065257A3; JPS57198083A; EP0065257A2

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT* HOE* 8*1"'/F 1Ü2HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT * HOE * 8 * 1 "'/ F 1Ü2

Dr.MD/crDr MD/cr

Verfahren zur Gewinnung neuer, zur Antibiotika-Herstellung geeigneter PilzstammeProcess for obtaining new strains of fungi suitable for the production of antibiotics

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung neuer Pilzstämme, mit denen Antibiotika hergestellt werden können, durch Protoplasten- und Kernverschmelzung.The invention relates to a method for obtaining new fungal strains with which antibiotics are produced can, through protoplast and nuclear fusion.

Es ist aus der deutschen Offenlegungsschrift 29 16 736 bekannt, daß man verschiedene Stämme von Acremonium chryj.ogenum durch Protoplasten- und Kern verschmilz ung kreuzen kann. Dadurch können neue Stämme von A.chrysogenum erhalten werden, die besonders vorteilhafte Eigenschaften der beiden Mutterstamme auf sich vereinigen und Cephalosporin C in guten Ausbeuten produzieren können.It is from the German Offenlegungsschrift 29 16 736 known that different strains of Acremonium chryj.ogenum are fused by protoplasts and nuclei can cross. This enables new strains of A.chrysogenum to be obtained which have particularly advantageous properties of the two mother lines to unite and Can produce cephalosporin C in good yields.

Bei diesem bekannten Verfahren sind jedoch lediglich verschiedene Stämme der gleichen Art, nämlich von A.chrysogenum gekreuzt worden. Die Methode der Protoplasten- und Kernverschmelzung ist bisher noch nicht dafür eingesetzt worden, Pilzstamme unterschiedlicher Arten oder sogar unterschiedlicher Gattungen zu kreuzen und so neue Pilzstämme zu erhalten, die zur Antibiotika-Herstellung vorteilhaft eingesetzt werden können.In this known method, however, only different strains of the same species, namely of A.chrysogenum has been crossed. The method of protoplast and core fusion is not yet for it been used, different mushroom strains To cross species or even different genera and thus to obtain new strains of fungi that are used for the production of antibiotics can be used advantageously.

Es stellte sich deshalb die Aufgabe, aus bekannten, Antibiotika bildenden Pilzstämmen durch Protoplasten- und Kernfusion mit Pilzstämmen anderer Arten oder sogar anderer Gattungen neue Pilzstämme zu gewinnen, aus denen verbesserte Hochleistungsstämme herausselektioniert werden können. Von ganz besonderem Interesse sind dabei Kreuzungsprodukt.e von ß-Lactam-Antibiotika erzeagenden Pilzstämmen. Hierbei kann man es sich zu Nutze machen, daß eine recht große Anzahl von Pilz stammen bekannt ist, die über die Fälligkeit zur Bildung von ß-Lactam-Antibiotika verfügen, aber nur wenige davon kommerziell eingesetzt werden, wie A.chrysogenum oder PaniciIlium chrysogenum. Gerade solche bisher noch nicht für die technische Her-The task therefore arose, from known, antibiotic-forming fungal strains by protoplasts and Nuclear fusion with fungal strains of other species or even other genera to obtain new fungal strains from which improved high-performance strains can be selected out. Are of particular interest Crossing products of ß-lactam antibiotics ore agendas Mushroom stems. Here you can take advantage of the fact that a large number of mushroom origin is known, which have the due date for the formation of ß-lactam antibiotics, but only a few of them are used commercially like A.chrysogenum or PaniciIlium chrysogenum. Especially those that have not yet been used for technical manufac-

O f> · A β · 0 «Β* * β O f> A β 0 «Β * * β

stellung von ß-Lactam-Antibiotika verwendete Stämme, z.B. andere Acremonium-Arten, aber auch Vertreter anderer Gattungen wie Paecilomyces, Emericellopsis oder Penicillium-Arten können als aussichtsreiche Kombinationspartner für z.B. A.chrysogenum angesehen werden, falls bei derartigen Fusionen von Pilzstämmen unterschiedlicher Arten oder sogar unterschiedlicher Gattungen überhaupt noch lebens- und wachstumsfähige Hybride entstehen.strains used in the preparation of β-lactam antibiotics, e.g. other Acremonium species, but also representatives of other genera such as Paecilomyces, Emericellopsis or Penicillium species can as a promising combination partner for e.g. A.chrysogenum, if different in such fusions of fungal strains Species or even different genera still viable and viable hybrids emerge.

Es wurde nun gefunden, daß sich zur Antibiotika-Herstellung geeignete Pilzstämme durch Protoplasten- und Kernverschmelzung gewinnen lassen, wenn man Pili:stämme unterschiedlicher Arten oder unterschiedlicher Gattungen in einer isotonischen, 10 bis 40 Gew.-% Polyäthylenglykol enthaltenden Lösung bei einem pH zwischen 6 und 8,5 mischt und die dabei entstehenden Hybrid-Stiimme in an sich bekannter Weise herausselektioniert.It has now been found that fungal strains suitable for the production of antibiotics by protoplasts and Letting nuclear fusion win by making pili: tribes different species or different genera in an isotonic, 10 to 40 wt .-% polyethylene glycol containing solution at a pH between 6 and 8.5 and the resulting hybrid voices in selected out in a known manner.

Die Protoplasten der beiden zur Verschmelzung vorgesehenen Mutterstamme werden gewonnen, in dem man die Myzelien beider Stämme getrennt voneinander in Schüttelkolben in einer geeigneten Nährlösung nach an sich bekannter Weise kultiviert. Gegen Ende der Wachstumsphase haben sich große Mengen fädiger Myzelien gebildet, die aus dem 5 Kulturmedium abfiltriert und gründlich gewaschen werden.The protoplasts of the two parent strains intended for fusion are obtained by removing the mycelia both strains separately in shake flasks cultivated in a suitable nutrient solution in a manner known per se. Towards the end of the growth phase large amounts of filamentous mycelia are formed, which are filtered off from the culture medium and washed thoroughly.

Zur Erhöhung der Protoplasten-Ausbeute werden dann die Myzelien bis zu 3 Stunden, vorzugsweise 1/2 bis 2 Stunden lang, bei 20 bis 4O⁰C und in einem pH-Bereich zwischen 6 und 8,5 in einer isotonischen Lösung, die 0,3 bis 3 Gew.-!, vorzugsweise 0,5 Gew.-%, 2-Mercaptoäthanol enthält, suspendiert. Durch diese Behandlung steigt die Protoplastenausbeute auf den 2- bis 3-fachen Wert gegenüber einem unbehandelten Ansatz.The mycelia are then up to 3 hours, preferably 1/2 to 2 hours, at 20 to 4O ⁰ C and in a pH range from 6 to 8.5 in an isotonic solution containing 0 to increase the protoplast yield 3 to 3% by weight, preferably 0.5% by weight, 2-mercaptoethanol, suspended. This treatment increases the protoplast yield to 2 to 3 times that of an untreated batch.

Die so vorbehandolten Myzelien werden nun der Einwirkung von die Zellwände abbauenden Enzymen unterworfen, um die Protoplasten isolieren zu können. Geeignete Enzyme hierfür,The mycelia pretreated in this way are now exposed to the action subjected to enzymes that break down the cell walls To be able to isolate protoplasts. Suitable enzymes for this,

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z.B. der Trichoderma harzianum-Enzymkomplex, das Enzyni L₁, SuIfaLäse und Zymolase können käuflich erworben werden und werden einzeln oder in Mischung bei neutralem pH und einer Temperatur zwischen 24 und 35⁰C in einem isotonischen Medium eingesetzt. Zweckmäßig wird die Myzel-Suspension dabei geschüttelt. Der Abbau der Zellwände erfordert für unterschiedliche Pilzkulturen auch unterschiedliche Zeiten, ist aber nach 30 bis 3 60 Min. in der Pegel im wesentlichen abgeschlossen.For example, the Trichoderma harzianum enzyme complex, the Enzyni L ₁ , SuIfaLäse and Zymolase can be purchased and are used individually or in a mixture at neutral pH and a temperature between 24 and 35 ^° C. in an isotonic medium. The mycelium suspension is expediently shaken. The breakdown of the cell walls also requires different times for different fungal cultures, but is essentially complete after 30 to 36 minutes.

Im allgemeinen werden bei diesem Verfahren aus in 20 ml Medium suspendierten 1 g Myzelium etwa 10 bis 10 Protoplasten/ml gewonnen. Diese können nach dem Waschen - z.B. in einer isotonischen, 10 bis 30 Gew.-% Glycerin enthaltenden Lösung - und Abtrennen restlicher Myzel-Stücke bei -20⁰C etwa 10 Tage regenerationsfähig gehalten werden.In general, about 10 to 10 protoplasts / ml are obtained in this process from 1 g of mycelium suspended in 20 ml of medium. These can after washing - residual mycelial pieces at -20 ⁰ C for about 10 days are held capable of regeneration and separation - for example, in an isotonic, 10 to 30 wt .-% glycerol containing solution.

Zur Verschmelzung der Protoplasten werden nun etwa gleiche Mengen beider Protoplasten-Sorten miteinander vermischt und etwa 5 Min. zentrifugiert. Das Sediment wird dann in einer 10 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise 20 bis 30 Gew.-% Polyäthylenglykol enthaltenden, neutralen und isotonischen Lösung suspendiert. Der Zusatz von Polyäthylenglycol erfolgt hierbei, um die sonst sehr geringe Verschmelzungjrate der Protoplasten zu steigern. Bevorzugt wird hierfür ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000 bis 6 000. Eine weitere Verbesserung der Protoplasten-Verschmelzung wird schließlich durch den Zusatz von Calciumionen erreicht. Deshalb ist die Zugabe einer 0,1 bis 0,5 molaren Calciumchlorid-Lösung von Vorteil.To fuse the protoplasts, approximately equal amounts of both types of protoplasts are mixed together and centrifuged for about 5 min. The sediment is then in a 10 to 40 wt .-%, preferably 20 to 30 wt .-% Suspended neutral and isotonic solution containing polyethylene glycol. The addition of polyethylene glycol takes place at the otherwise very low rate of merger of protoplasts to increase. A polyethylene glycol with a molecular weight of 2000 to 6,000. A further improvement in protoplast fusion is finally achieved by the addition of Reached calcium ions. It is therefore advantageous to add a 0.1 to 0.5 molar calcium chloride solution.

Besonders gute Resultate v/erden erhalten, wenn man eine oder beide Protoplastensusponsionen vor der Verschmelzung einigt» Minuten unter ständigem Rühren mit öV-hicht bostrahlt. Particularly good results are obtained if one or both protoplast suspensions are blasted for a few minutes with constant stirring with public transport.

Die so vorbehandelte Protoplasten-Mischung wird dann bei 24 bis 35⁰C etwa 5 bis 20 Minuten, vorzugsweise etwa 10 Minuten inkubiert und dann das Polyäthylenglykol durchThe pretreated protoplast mixture is then stirred at 24 to 35 ⁰ C for about 5 to 20 minutes, preferably about 10 minutes and then incubated the polyethylene glycol by

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Zentrifugieren abgetrennt. Die nunmehr fusionierten Protoplasten werden dann in einer isotonischen, neutralen Lösung resuspendiert und zur Stimulierung der Kernfusionsfrequenz erneut für 5 bis 20 Sekunden mit UV-Licht in einer Petrischale bestrahlt.Separated by centrifugation. The now fused protoplasts are then in an isotonic, neutral Solution resuspended and to stimulate the nuclear fusion frequency again for 5 to 20 seconds with UV light irradiated in a petri dish.

Die nach diesem Verfahren entstandenen Hybride können nun in an sich bekannter Weise durch Selektion gefunden und dann kultiviert werden. Hierbei ist es von großem Nutzen, wenn genetisch markierte Mutterstämme zur Verfügung stehen, die sich durch besondere Auxotrophien, Farben, oder Arzneimittelresistenzen auszeichnen. Weist z.B. einer der Mutterstämme eine Auxotrophie für bestimmte Aminosäuren wie Histidin, Methionin oder Arginin auf, dann wird er auf einem diese Aminosäuren nicht enthaltenden Minimalmedium nicht wachsen, während der durch Kernverschmelzung entstandene Hybrid wegen seiner andersartigen genetischen Konstitution von diesen Aminosäuren nicht abhängig zu sein braucht und deshalb unbehindert wachsen kann.The hybrids produced by this process can now be found by selection in a manner known per se and then be cultivated. Here it is of great use if genetically marked parent strains are available that are characterized by special auxotrophies, colors, or drug resistance. Knows E.g. one of the parent strains has an auxotrophy for certain amino acids such as histidine, methionine or arginine, then it will not grow on a minimal medium not containing these amino acids during the Fusion emerged hybrid because of its different nature genetic constitution does not need to be dependent on these amino acids and is therefore unhindered can grow.

Ebenso können Arzneimittelresistenzen die Selektion erleichtern. Verfügt nur einer der beiden Mutterstämme über eine Resistenz gegenüber einem bestimmten Arzneimittel und wird diese Resistenz auf den Hybrid-Stamm übertragen, dann kann der andere Mutterstamm, der auf einem ein derartiges Arzneimittel enthaltenden-Medium nicht wächst, abgetrennt werden.Drug resistance can also make selection easier. Has only one of the two parent lines a resistance to a particular drug and will this resistance be transferred to the hybrid strain, then the other parent strain, which does not grow on a medium containing such a drug, can be separated.

Der durch derartige Methoden in reiner Form hergestellte Hybridstamm kann dann auf einem geeigneten Nährmedium kultiviert und das von ihm gebildete Antibiotikum nach bekannten Verfahren isoliert werden.The one produced in pure form by such methods The hybrid strain can then be cultivated on a suitable nutrient medium and the antibiotic produced by it after known methods can be isolated.

Von allen Kreuzungsprodukten wurde nach der Agarstück- -Jlethode die ß-Lactam-Produktion bestimmt und mit der der Mutterstämme verglichen. Dabei zeigte sich in einigen Fällen eine erhöhte ß-Lactam-Produkt i on der erf indungsgemäßThe ß-lactam production of all cross products was determined by the agar piece -Jlethode and with that of the Maternal strains compared. In some cases, this showed an increased β-lactam production according to the invention

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herge.-'.tellten Hybride. Damit ist die grundsätzliche Eignung dieser genetischen Methode für die Stamniverbesserung nachgewiesen. Ebenso konnte bei einigen Hybriden eine deutl i.che Verbesserung der Sporulation gefunden werden.manufactured hybrids. So that is the fundamental Proven suitability of this genetic method for strain improvement. Likewise, with some hybrids a clear improvement in sporulation can be found.

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example 1

Eine aus dem Stamm A.chrysogenum (ATCC14 553) abgeleitete Linie mit den genetischen Markierungen his-, met- und BL und eine Acremonium species (ATCC 18 739) mit den — ros res + genetischen Miirkierungen arg , nys , gri , sp und ehr wurde für die im folgenden beschriebene Kreuzung zweier unterschiedlicher Acremonium-Arten verwendet.One derived from the A.chrysogenum strain (ATCC14 553) Line with the genetic markings his-, met- and BL and an Acremonium species (ATCC 18 739) with the - ros res + genetic changes arg, nys, gri, sp and ore was used for the crossing of two different Acremonium species described below.

Die Abkürzungen his", met" und arg" bedeuten Auxotrophien für Histidin, Methionin und Arginin, nys^res die re s
Resistenz gegen Nystatin, gri die Resistenz gegen Griseofulvin, BL die Fähigkeit der ß-Lactam Antibiotika-Bildung, sp die Sporulationsfähigkeit und ehr die Produktion des gelben Pigments Chrisogenin.The abbreviations his ", met" and arg "mean auxotrophies for histidine, methionine and arginine, nys ^res die re s
Resistance to nystatin, resistance to griseofulvin, BL the ability to form ß-lactam antibiotics, sp the ability to sporulate and or rather the production of the yellow pigment chrisogenin.

Die beiden Stämme wurden im folgenden flüssigen Medium getrennt voneinander vorgezüchtet:The two strains were pre-grown separately in the following liquid medium:

Bactoextract DifcoBactoextract Difco 0,30.3 GlukoseGlucose 0,50.5 NatriumchloridSodium chloride 0,50.5 Aqua destAqua dest pH 6,8pH 6.8

Von diesem Medium wurden jeweils 50 ml in zwei 300 ml 5 Erlenineyerkolben abgefüllt und sterilisiert. In den einen50 ml of this medium were in each case in two 300 ml 5 Erlenineyer flasks filled and sterilized. In the one

2
Erlenrtieyerkolben wurden ca. 50 cm eines 10-12 Tage alten Myzeliums übertragen, das aus der aus ATCC 14 553 gewonnenen Linie in einer Rouxflaschenkultur gebildet worden war. Dieses Myzel wurde nun bis zum Auskeimen 0 der Arthrosporen etwa 50 bis 60 Stunden lang auf einer Rotationsschüttelmaschine kultiviert.2
Erlenrtieyer flasks were transferred about 50 cm of a 10-12 day old mycelium which had been formed from the line obtained from ATCC 14 553 in a Roux bottle culture. This mycelium was then cultivated on a rotary shaker for about 50 to 60 hours until the arthrospores had germinated.

In den zweiten Erlenmeyerkolben wurde ca. 1 cm eines 10 bis 12 Tage alten Myzeliums der Acremonium species (ATCC 18 739) aus einer Stockkultur übertragen υ ad 30 bis 40 Stunden kultiviert. Nach der Heendigunq der Vorkultivierung wurden die beiden Myzelien einzeln durch Filtration oder Zentrifugieren von der Kulturlos; mg ge-About 1 cm of a 10 to 12 day old mycelium of the Acremonium species (ATCC 18 739) transferred from a stock culture υ cultivated for 30 to 40 hours. After completion of the The two mycelia were pre-cultivated individually by filtration or centrifugation from the culture lot; mg ge

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-S--S-

trenn , zweimal rait destilliertem Wasser gewaschen, in einer isotonischen, neutralen, 0,5 % 2-Mercaptoäthanol enthaltenden Lösung suspendiert und bei 30⁰C 30 Min. stationär inkubiert. Danach werden die Myzelien mit einer isotonischen, neutralen Lösung gewaschen.separate, washed twice with distilled water, suspended in an isotonic, neutral solution containing 0.5% 2-mercaptoethanol and ^{incubated stationary at 30 °} C. for 30 minutes. The mycelia are then washed with an isotonic, neutral solution.

Die eigentliche Protoplastertoildung erfolgt bei der aus A.chrysogenum (ATCC 14 553) gewonnenen Linie durch die Einwirkung von 12 mg/ml des Cytophaga-Enzyms L.. und von 2 mg/ml Zymolase in einer isotonischen, neutralen Lösung in einem 20 0 ml Erlenmeyerkolben bei leichtem Schütteln auf einer Schüttelmaschine und einer Temperatur von 30⁰C im Verlaufe einer etwa dreistündigen Inkubation.The actual protoplast formation takes place in the line obtained from A.chrysogenum (ATCC 14 553) by the action of 12 mg / ml of the Cytophaga enzyme L .. and of 2 mg / ml zymolase in an isotonic, neutral solution in a 20 0 ml Erlenmeyer flasks with gentle shaking on a shaking machine and a temperature of 30 ^° C. in the course of an approximately three-hour incubation.

Die Protoplasten von · Acremonium species (ATCC 18 739) werdan. in ähnlicher Weise gewonnen, nur werden hier 4 mg/ml des Trichoderma harzianum-Enzymkomplexes und 1,5 mg/rJ. Sulfatase eingesetzt.The protoplasts of Acremonium species (ATCC 18 739) will be. obtained in a similar way, only 4 mg / ml are obtained here of the Trichoderma harzianum enzyme complex and 1.5 mg / rJ. Sulfatase used.

Die Protoplasten wurden dann mit Hilfe einer Filtration (Glaswattefilter) von den restlichen Myzelstückon getrennL und zweimal durch eine 5 minütige Zentr ifugation in isotonischer Lösung gewaschen. Der Protoplastentiter soll bei ca. 10 Protoplasten/ml liegen. Kurz vor der Protoplastenfusion werden 4 ml der Protoplastensuspension des Stammes A.species (ATCC 18 739) in einer Petrischale unter ständigem Rühren 6 Minuten mit UV-Licht einer Wellenlänge von 254 nm bestrahlt.The protoplasts were then separated from the remaining pieces of mycelium with the aid of filtration (glass wadding filter) and washed twice by centrifugation for 5 minutes in isotonic solution. The protoplast titer should be around 10 protoplasts / ml. Shortly before of the protoplast fusion, 4 ml of the protoplast suspension of the A.species strain (ATCC 18 739) are placed in a Petri dish irradiated with UV light with a wavelength of 254 nm for 6 minutes with constant stirring.

2 ml von jeder der beiden Protoplastensusponsionen wurden zusammengeführt, durchgemischt und 5 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wurde in 0,2 ml einer 0,5 molaren Calciumchloridlösung suspendiert, auf 2 ml Polyäthylenglykollösunij (bestehend aus 30 Gew.-% Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 6000 und 100 mM Calciumchlorid, pH 7,5) aufgetragen und 10 Minuten bei 30⁰C inkubiert. Nach Zugabe von 5 ml einer wässrigen isotonischen Lösung von pH 6,7 wird durch 5 minütige Zentrifugation das2 ml of each of the two protoplast suspensions were pooled, mixed and centrifuged for 5 minutes. The sediment was suspended in 0.2 ml of a 0.5 molar calcium chloride solution, applied to 2 ml Polyäthylenglykollösunij (consisting of 30 wt .-% polyethylene glycol with a molecular weight of 6000 and 100 mM calcium chloride, pH 7.5) and 10 minutes at 30 Incubated ^{0 C.} After adding 5 ml of an aqueous isotonic solution of pH 6.7, the

_ ςν' __ ςν '_

Polyäthylenglykol abgetrennt. Die fusionierten Protoplasten werden in einer isotonischen, neutralen Lösung suspendiert und zur Stimulierung der Kernfusionsfrequenz 10 Sekunden mit UV-L Lebt einer Wellenlänge von 254 nm in einer Petrischale bestrahlt. Die Verschmelzungsprodukte wurden auf einem kompletten und auf einem minimalen Selektionsmedium kultiviert.Separated polyethylene glycol. The fused protoplasts are suspended in an isotonic solution and neutral to stimulate the nuclear fusion frequency for 10 seconds using UV-L Lives a wavelength of 54 nm 2 in a petri dish irradiated. The fusion products were cultured on complete and minimal selection medium.

Das Minimalmedium hatte folgende Zusammensetzung!:The minimal medium had the following composition:

GlukoseGlucose 4040 gG gG gG NaNO₃ NaNO ₃ 33 gG g (0,6 M)g (0.6 M) KH₃PO₄ ■ 7H₂OKH ₃ PO ₄ ■ 7H ₂ O 00 ,5, 5 FeSO₄ " 7H₂OFeSO ₄ "7H ₂ O 00 ,01, 01 mlml NaClNaCl 3535 ,0, 0 Agar (Serva )Agar (serva) 2020th gG dest. H₂Oleast. H ₂ O ad 1000ad 1000

Dieses Medium wurde 20 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Der pH-Wert stellte sich auf 7,1 - 7,2 ein.This medium was ^{sterilized at 121 °} C. for 20 minutes. The pH adjusted to 7.1 - 7.2.

Das Komplettmedium hatte folgende Zusammensetzung:The complete medium had the following composition:

Sacharose 3,0 gSucrose 3.0 g

Dextrin (weiß) 15,0 gDextrin (white) 15.0 g

NaCl 35,0 g (0,6 M)NaCl 35.0 g (0.6 M)

K₂HPO₄ 0,5 gK ₂ HPO ₄ 0.5 g

MgSO₄ ■ 7H₂O 0,5 gMgSO ₄ · 7H ₂ O 0.5 g

FeSO₄ · 7H₂O 0,01 gFeSO ₄ · 7H ₂ O 0.01 g

Trypticase-Soy-Broth (Difco) 5,0 gTrypticase Soy Broth (Difco) 5.0 g

Fleischextract (Difco) 1,0 gMeat extract (Difco) 1.0 g

0 HefeextrakL (Difco) 2,0 g0 yeast extract (Difco) 2.0 g

Agar (Serva) 20 gAgar (Serva) 20 g

Dest H₂O ad 1000 mlDest H ₂ O to 1000 ml

Dieses Medium wurde 20 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Der pH-Wert stelle sich hier auf 7,0 - 7,2 ein.This medium was ^{sterilized at 121 °} C. for 20 minutes. The pH value adjusts itself here to 7.0 - 7.2.

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40-40-

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Nach .; Passagen auf dem Minimalniedium und 2 Passagen auf dem Komplett medium wurden eine Reihe von Kulturen erhalten, von denen einige charakterisiert wurden.To .; Passages on the minimal low and 2 passages A number of cultures were obtained on the complete medium, some of which were characterized.

Unter den Fusionsprodukten wurden die Stämme IS-1 und IS-2 als neue Rekombinanten gefunden. Die nachfolgende Tabelle zeigt die charakteristischen Eigenschaft en dieser neuen Stämme im Vergleich zu ihren Mutterstammen:The strains IS-1 and IS-2 found as new recombinants. The following table shows the characteristic property en of these new strains compared to their parent strains:

Stammtribe Sporn-
lation *Spur-
lation * ChrChr Wachs
tum **wax
tum ** NysNys GriHandle hishis metmet argbad Linie aus
A-chrytogenum
15 (ATCC 14 553)Line off
A-chrytogenum
15 (ATCC 14 553) 10³ 10 ³ ++ 6,26.2 senssens senssens ++ A.speci es
(AI¹CC ~8 739)A.speci it
(AI ¹ CC ~ 8 739) 10⁸ 10 ⁸ ++++++ 14,514.5 resres resres ++ ++ -- 20 IS-120 IS-1 10² 10 ² ++ 14,214.2 resres resres ++ ++ ++ IS-2IS-2 io'io ' —- 14,614.6 resres senssens ++ ++ ++

* Sporenbildung, d.h. durchschnitt Liehe Zahl der Sporen/ ml nach der 10 ml Abschwemmung ν m 10 cm 14 Tagea Lten Myzelium auf dem Kompl< ttme lium <jewac isen* Spore formation, i.e. average number of spores / ml after the 10 ml wash-off ν m 10 cm 14 days a Put the mycelium on the complete metalium

** Wachstum in Submerskultur, q Tro^kerigewichz/1 nach 0 4 Tagen !Cultivation, Komplettmedi im, Rotations-** Growth in submerged culture, q Tro ^ kerigewichz / 1 after 0 4 days! Cultivation, complete media, rotation

schüttelmaschine 250 Upm, 25°C.shaker 250 rpm, 25 ° C.

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Example 2

Genetisch markierte Stämme der Art Emericellopsis glabra (CBS 11 940) mit den Merkmalen phe und try und Emericellopsis salmosynnemata (CBS 18 256) mit den Merkmalen met und nia wurden analog der im Beispiel 1 beschriebenen Methode? rekombiniert. DLe Abkürzungen phe , try , met und nia bedeuten hierbei Auxotrophien für Phenylalanin, Tryptophan, Methionin und Nikotins-.äureamid.Genetically marked strains of the species Emericellopsis glabra (CBS 11 940) with the traits phe and try and Emericellopsis salmosynnemata (CBS 18 256) with the Features met and nia were determined analogously to the method described in Example 1? recombined. DLe abbreviations phe, try, met and nia mean auxotrophies for phenylalanine, tryptophan, methionine and nicotinic acid amide.

Für die Protoplastenherstellung wurde die Enzymkombination von 6 mg/ml Trichodcrma harzxanum Enzymkcmplex und 2 mg/ml Sulfatase verwendet.The enzyme combination of 6 mg / ml Trichodcrma harzxanum Enzymkcmplex and 2 mg / ml Sulfatase used.

In der nachfolgenden Tabelle sind die gefundenen Rekombinanten durch die beobachteten Auxotrophien und ihre Morphologie· gekonnzeichnet.The table below shows the recombinants found by the auxotrophies and observed their morphology · skilfully drawn.

RekombinantenRecombinants try , niatry, nia Zahl dernumber of Morphologiemorphology niania IsolateIsolates phe",phe ", niania . 1. 1 Emericello; >sis glabraEmericello; > sis glabra 20 phe~„20 phe ~ " 22 Il IlIl Il try",try ", 11 Il IlIl Il phephe phephe 44th Il IlIl Il try"try " 55 " : -almosynneiTE": -almosynneiTE met ,mead, 11 Il IlIl Il 25 met"25 met " 66th Il IlIl Il niania 1010 Il IlIl Il

Hiermit konnte gezeigt werden, daß durch Protoplastenverschmelzung eine Kreuzung zwischen verschiedenen Ernerieellopsis-Arten möglich ist.With this it could be shown that by protoplast fusion a cross between different Ernerieellopsis species is possible.

Example 3

Zum Nfichweis der Kreuzungsmöglichkeit zwischen Pilzstämmen unterschiedlicher Gattungen wurde eine genetisch markierte Linie von Acremonium chrysogenum (ATCC 14 553) nit den genet^!sehen Merkmalen met , pyr und BL und KiiktJ (-el lop:; i :; <|labi.i {CUr> 11 ^r)40) mil den qenc 1 lu-hen Merkmalen phe , try , bon " rekoiiib i η i et L . Hierbei bedeuten met , pyr , phe , und try Auxotrophien r'ürA genetically marked line of Acremonium chrysogenum (ATCC 14 553) was genetically modified with the ^! see features met, pyr and BL and KiiktJ (-el lop :; i:; <| labi.i {CUr> 11 ^r ) 40) with the qenc 1 lu-hen features phe, try, bon "rekoiiib i η i et Here met, pyr, phe, and try mean auxotrophies r'ür

BADBATH

Methio iin, Pyridoxin , Phenylalanin und Tryptophan. BL⁺ be leutet die Fähigkeit zur Bildung von ß-Lactam-Antibiotika und ben^res bedeutet eine Resistenz gegen Benomy1.Methio iine, pyridoxine, phenylalanine and tryptophan. BL ⁺ indicates the ability to produce ß-lactam antibiotics and ben ^res means resistance to Benomy1.

Für die Protoplastenisolierung wurde die Enzymkombination aus 6 mg/ml Trichoderma harzianum Enzym und 3 mg/ml Su If at.use verwendet, im übrigen aber wie in den beiden vorhergehenden Beispielen vorgegangen.For protoplast isolation, the enzyme combination of 6 mg / ml Trichoderma harzianum enzyme and 3 mg / ml Su If at.use is used, but otherwise as in both previous examples.

Die Charakteristika der intergenerisehen Rekombinanten zeigt die folgende Tabelle:The characteristics of the intergenerational recombinants shows the following table:

Rekomb inantenRecomb inants — re s
phe , ben- re s
phe, ben Zahl dernumber of Morphologiemorphology , - , res
try , ben, -, res
try, ben IsolateIsolates met ,mead, try"try " 44th EmericeLlopsis glab:EmericeLlopsis glab: met ,mead, ben^res ben ^res 22 ti IIti II met ,mead, ben^res ben ^res 11 11 1111 11 met",met ", , res
ben, res
ben 22 Il IlIl Il phe ,phe, try"try " 66th Il IlIl Il try",try ", 44th Il IlIl Il phe",phe ", 66th Il IlIl Il

Diese Ergebnisse zeigen, daß Kreuzungen zwischen Piizstammen unterschiedlicher Gattungen v.ie Acremor. ium und Emericellopsis durch Protoplastenverr.chmolzung möglich sind. Eine Übertragung der ß-Lactam-Iiildung wurde bisher nicht nachgewiesen. Dennoch ist bemerkenswert, daß dieses Kreuzungsexperiment überhaupt glückte.These results show that crosses are between Piiz different genera v.ie Acremor. ium and Emericellopsis possible through protoplast fusion are. A transfer of the β-lactam formation has been carried out so far not established. Nevertheless it is remarkable that this crossing experiment was successful at all.

Example 4

Zur intergenerisehen Kreuzung wurde eine Linie von Acremonium chrysogenum (ATCC 14 553) und dem genetischen Merkmal met und eine von PeniciIlium chrysogenum (ATCC 9480) abgeleitete Linie mit den genetischen Merk-A line from Acremonium chrysogenum (ATCC 14 553) and the genetic Trait met and a line derived from PeniciIlium chrysogenum (ATCC 9480) with the genetic traits

rs s its s
malen ben und cb eingesetzt. Hierbei bedeuten met eine Auxotrcphie für Methionin und ben einers s its s
paint ben and cb used. Here, met denotes an auxotracy for methionine and ben denotes one

res Resistenz geger Benomyl und cb eine Resistenz gegen Carbendazim . Mit Hilfe der in den -'orhergeher.den Beispielen beschrieb'·ηεη Protoplastenfusion wurc-ι hier eine T^rototTophe I-'ekoml'lnan! e gewonnen, die die cjonot i :.chcn Merk-res resistance to benomyl and cb resistance to carbendazim. With the help of -'orhergeher.den in the examples' described · ηεη protoplast fusion Wurc -ι here a T ^ rototTophe I-'ekoml'lnan! e won the cjonot i: .chcn mark-

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male ben " und cb ' trug, in ihrer Morpholoy i.i· aber zwischen Acremonium chrysogenum und Penicilliuiu chrysogenum lag.re * ■ * re * »
male ben "and cb ', in their morpholoy ii · but lay between Acremonium chrysogenum and Penicilliuiu chrysogenum.

BAD OR/GJNALBAD OR / GJNAL

Claims

f α β * β β

HOE 81 / F 112

EXPECTATIONS

ο Process for the production of new antibiotics suitable fungal strains through protoplast and nuclear fusion, characterized in that one protoplasts of fungal strains of different species or of different genera in an isotonic solution containing 10 to 40% by weight of polyethylene glycol mixes at a pH between 6 and 8.5 and the resulting hybrid strains in a manner known per se selected out.

2. The method according to claim 1, characterized in that the protoplasts to increase the protoplast fusion rate and irradiated with a sublethal dose of UV light to increase the rate of nuclear fusion.

3 = method according to claims 1 and 2, characterized in that the protoplast fusion is carried out in the presence of calcium ions.
20th

4. The method according to claim T to 3, characterized in that that protoplasts of different fungal species are fused.

5. The method according to claim 1 to 3, characterized in that that protoplasts of different fungal generations are fused.

6 = method according to claim 4 or 5, characterized in that that genetically marked fungal strains are fused. ·

7. The method according to claims 1 to 6, characterized in that that you ß-lactam antibiotics-forming mushroom strains with each other merged »