DE2445616A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CEPHALOSPORIN C - Google Patents
PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CEPHALOSPORIN CInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Cephalosporin-C (nachstehend kurz als "CPO" bezeichnet) durch Fermentationsverfahren, insbesondere Verfahren zur Herstellung von CPO unter Verwendung eines CPC-bildenden polyplpiden Pilzes der Gattung Cephalosporium.The invention relates to the production of Cephalosporin-C (hereinafter referred to as "CPO" for short) by Fermentation processes, in particular processes for the production of CPO using a CPC-forming one polypid fungus of the genus Cephalosporium.
Methoden, die die Erzielung erhöhter Ausbeuten an CPC, das durch Fermentationsprozesse gebildet wird, ermöglichen, wurden untersucht, jedoch sind nur wenig Methoden bekannt, bei denen Mikrobenstämme selektiv gezüchtet werden. Alles was bis heute bekannt ist, sind die Methoden, bei denen man einen Stamm zu Hilfe nimmt, dessen Stoffwechsel und Biosynthese von Organoschwefelverbindungen blockiert worden sind (japanische Offenlegungsschrift 1828/1971), und Methoden, bei denen'die Fähigkeit von Mikroorganismen zur Bildung von CPC etwas gesteigert worden ist (USA-Patentschrift 3 082 155 und japanische Offenlegungsschrift 26 986/1973). Bezüglich des Leistungsvermögens von Mikroorganismen zur Bildung von CPC ist festzustellen, daß die Ausbeuten der Fermentation im Falle der japanischen Offenlegungsschrift 1828/1971 bestenfalls 760 ag/ml, im Falle der USA-Patent-Methods that enable the achievement of increased yields of CPC, that is formed by fermentation processes have been investigated, but only a few methods are available known in which strains of microbes are selectively grown. All that is known to this day are the methods where a strain is used, its metabolism and biosynthesis of organosulfur compounds have been blocked (Japanese Patent Application Laid-Open No. 1828/1971), and methods in which 'the ability has been increased somewhat by microorganisms for the formation of CPC (US Pat. No. 3,082,155 and Japanese Patent Application Laid-Open No. 26986/1973). Concerning the capacity of microorganisms to form from CPC it can be stated that the fermentation yields in the case of the Japanese patent application 1828/1971 at best 760 ag / ml, in the case of the USA patent
5 098U/10565 098U / 1056
schrift 5 082 155 etwa 50OyUgZmI beträgt und selbst bei dem befriedigendsten aller Fälle, über die bisher berichtet wurde, nämlich in der japanischen Offenlegungsschrift 26 986/1973» das erreichbare Leistungsvermögen nicht höher ist als 5000 ug/ml.5 082 155 is about 50OyUgZmI and even at the most satisfactory of all cases reported so far, namely in the Japanese Patent Application Laid-Open 26 986/1973 »the achievable capacity is not higher than 5000 ug / ml.
In dem Bemühen, durch eine auf eine genetische Verbesserung von Mikroorganismen gerichtete umfassende Forschungsarbeit einen V/eg zur Herstellung von CPC in erhöhter Ausbeute zu finden, wurde von der Anmelderin gefunden, daß Pilze mit ausgezeichnetem Leistungsvermögen für die Bildung von CPG unter polyploiden Pilzen, die durch eine die Chromosomensätze vervielfältigende Behandlung von CPC-bildenden Mikroorganismen der Gattung Cephalosporium erzeugt worden sind, häufiger zu finden sind als unter anderen Mutanten, die durch eine andere übliche rautagene Behandlung erzeugt worden sind,, und daß einige der polyploiden Pilze die Fähigkeit haben, CPC extracellular in beispiellos hohen Konzentrationen anzuhäufen.In an effort to carry out extensive research aimed at the genetic improvement of microorganisms to find a V / eg for the production of CPC in increased yield has been found by the applicant, that fungi with excellent capacity for the formation of CPG among polyploid fungi that by a treatment of CPC-forming microorganisms of the genus, which multiplies the sets of chromosomes Cephalosporium are found more frequently than among other mutants caused by a other common rautagenic treatments have been produced, and that some of the polyploid fungi have the ability to produce CPC extracellularly in unprecedentedly high concentrations to accumulate.
Zwar wurden bereits Versuche gemacht, die Fermentationsausbeuten an gewünschten Produkten durch polyploide Mikrobenstämme zu verbessern, jedoch waren die Methoden, über die berichtet wurde, in keinem Fall großtechnisch erfolgreich entweder wegen des Mißerfolges, befriedigende Ergebnisse zu erzielen, oder wegen der Schwierigkeit, die diese Stämme hinsichtlich der genetischen Fixierung von Charakteren bieten. Außerdem wurde über keinen einzigen Versuch im Zusammenhang mit der CPC-FermentationAttempts have already been made to reduce the fermentation yields of desired products by polyploid To improve microbial strains, however, the methods reported on have by no means been large-scale successful either because of failure to achieve satisfactory results or because of difficulty in that these tribes offer in terms of genetic fixation of characters. Besides, not a single one was found Attempt in connection with the CPC fermentation
berichtet. ireported. i
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C, wobei man polyploide Mikroorganismen, die aus Stammikroorganismen der Gattung Cephalosporium, die CPC zu erzeugen vermögen, erhalten worden sind, in einem Kulturmedium kultiviert und sie das CPC extrazellulär anhäufen läßt.The invention relates to a process for the production of cephalosporin C, using polyploid microorganisms, obtained from parent microorganisms of the genus Cephalosporium capable of producing CPC have been cultured in a culture medium and allowed to accumulate the CPC extracellularly.
5098U/10&65098U / 10 & 6
Ala Ursprungsstämme von Mikroorganismen, die für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, eignen sich beliebige CPC-bildende Stämme der Gattung Chephalosporium, z.B. Cephalosporium acremonium und Cephalosporium polyaleurum. Als typische Stämme der Spezies sind u.a. Cephalosporium polyaleurum Y-505 (I1ERM-P Nr, 1160), Cephalosporium acremonium ATCC-11550,- Cephalosporium acremonium ATCC-H553 und die von diesen Stämmen erzeugten verschiedenen Mutanten zu nennen.All strains of origin of microorganisms which are used for the purposes of the invention are any CPC-forming strains of the genus Chephalosporium, for example Cephalosporium acremonium and Cephalosporium polyaleurum. Typical strains of the species include Cephalosporium polyaleurum Y-505 (I 1 ERM-P No. 1160), Cephalosporium acremonium ATCC-11550, Cephalosporium acremonium ATCC-H553 and the various mutants produced by these strains.
Die Zahlen hinter den Abkürzungen "I1ERM-P" und "ATCC" sind die Hinterlegungsnummern der Mikroorganismen beim Research Institute of Fermentation of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, und bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.The numbers after the abbreviations "I 1 ERM-P" and "ATCC" are the deposit numbers of the microorganisms at the Research Institute of Fermentation of the Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, and at the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland , UNITED STATES.
Die nachstehend beschriebenen beiden Methoden sind als hauptsächliche Methoden zur Erzeugung der gewünschten polyploiden Mikroorganismen aus Ursprungsmikroorganismen zu nennen. Bei einem dieser Verfahren werden die Chromosomensätze der Zellen des Mikroorganismus mit einem chemischen Agens vervielfältigt. Als Beispiele geeigneter chemischer Agentien sind Kampfer, Acenaphthen und Colchicin zu nennen. Die Behandlungsbedingungen ändern sich mit dem jeweiligen Pilz, der Art des chemischem Agens und anderen Paktoren, jedoch ist im allgemeinen das folgende Verfahren erfolgreich: Beispielsweise werden die Zellen des Mikroorganismus im Falle von Kampfer oder Acenaphthen einige Stunden bis zu einigen zehn Stunden der Einwirkung von Dämpfen der chemischen Verbindung unterworfen, worauf sie aus den Dämpfen genommen und weiter kultiviert werden. Bei· einer anderen Methode werden die Zellen von Beginn an auf einer Agarplatte, die die chemische Verbindung enthält, kultiviert. Die von den gebildeten Kolonien abgenommenen Zellen werden beispielsweise unter einemThe two methods described below are the primary methods of generating the desired ones to name polyploid microorganisms from original microorganisms. In one of these processes, the Chromosome sets of the cells of the microorganism are multiplied with a chemical agent. As examples suitable chemical agents are camphor, acenaphthene and colchicine. The treatment conditions change with the fungus, the type of chemical agent and other factors, but im In general, the following procedure is successful: For example, the cells of the microorganism in the Case of camphor or acenaphthene from a few hours to tens of hours of exposure to vapors chemical compound, whereupon they are removed from the vapors and further cultivated. At· Another method is to start by placing the cells on an agar plate that contains the chemical compound cultivated. The cells removed from the colonies formed are, for example, under a
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Mikroskop untersucht. Die aus Riesenzellen "bestehenden Kolonien werden ausgewählt.Examines microscope. Those made up of giant cells " Colonies are selected.
Die gewünschten polyploiden Pilze können nach jeder der vorstehend beschriebenen Methoden gewonnen werden. Beispielsweise kann ein polyploider Pilz nach der Methode, die in Journal of General and Applied Microbiology 2 (1956) 345 beschrieben wird, gewonnen-werden.The desired polyploid fungi can be obtained by any of the methods described above. For example, a polyploid fungus can be produced according to the method described in the Journal of General and Applied Microbiology 2 (1956) 345 is described.
Diese Methoden können nicht nur-wiederholt, sondern auch in Kombination mit anderen Methoden der Züchtung und der Auswahl gewisser spezieller Stämme von Mikroorganismen angewandt werden. In diesen Fällen werden zuweilen verbesserte Ergebnisse erhalten.These methods can not only be repeated, but rather also in combination with other methods of breeding and the selection of certain special strains of microorganisms can be applied. In these cases, improved results are sometimes obtained.
Die in der beschriebenen Weise gewonnenen polyploiden Stämme können, falls gewünscht, leicht nach einer üblichen Reinisolierungsmethode, z.B. durch Mikromanipulation, isoliert werden. Beispielsweise wurde Cephalosporium acremonium ATCC-1455\3 als Ursprungsstamm mit Kampfer behandelt, worauf das Vermögen der erhaltenen polyploiden Stämme, CPC zu erzeugen, untersucht wurde. Durch die Untersuchung wurde eine Anzahl von Stämmen gefunden, die CPC im Medium in erhöhten Ausbeuten von beispielsweise mehr als 7000 ug/ml zu bilden vermögen, wobei insbesondere Cephalosporium acremonium 2M-16 (PERM-P Nr.2283, ATCC-20425, Ii1O 9999) CPC in beispiellos hoher Ausbeute anhäuft. Die taxonomischen Eigenschaften dieser Stämme erwiesen sich als im wesentlichen identisch mit den Eigenschaften von Cephalosporium sp. ATCC-14553 (japanische Patentveröffentlichung 4437/1965) mit Ausnahme der in Tabelle 1 genannten Unterschiede. Die IFO-Nummer gibt die Hinterlegungsnummern der Mikroorganismen beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, an.The polyploid strains obtained in the manner described can, if desired, easily be isolated by a customary pure isolation method, for example by micromanipulation. For example, Cephalosporium acremonium ATCC-1455 \ 3 was treated with camphor as the parent strain, whereupon the ability of the obtained polyploid strains to produce CPC was examined. The investigation found a number of strains which are able to form CPC in the medium in increased yields of, for example, more than 7000 μg / ml, in particular Cephalosporium acremonium 2M-16 (PERM-P No. 2283, ATCC-20425, II 1 O 9999) CPC accumulates in unprecedented high yield. The taxonomic properties of these strains were found to be essentially identical to the properties of Cephalosporium sp. ATCC-14553 (Japanese Patent Publication 4437/1965) except for the differences noted in Table 1. The IFO number indicates the deposit number of the microorganisms at the Institute for Fermentation, Osaka, Japan.
50 98U/105650 98U / 1056
S t a m mTribe
Größe der Arthrospore Größerer Kleinerer Durch- Durchmesser
messer Zahl von Kernen
pro Arthrospore Size of the arthrospore larger smaller diameter diameter number of nuclei
per arthrospore
(A)(A)
DUA-Gehalt
pro Arthrospore DUA content
per arthrospore
(B)(B)
DNA-Menge pro KernAmount of DNA per nucleus
(B/A)(B / A)
OephalosporiumOephalosporium
acremoniumacremonium
AICC-14553AICC-14553
7,27.2
3,6 1,03.6 1.0
0,30x100.30x10
0,30x100.30x10
-7-7
CephalosporiumCephalosporium
acremoniumacremonium
2M-162M-16
11,211.2
4,74.7 3,2 ..3.2 ..
Ί.,'98χ10"ΤΊ., '98χ10 "Τ
0,62x10'0.62x10 '
-7-7
CJiCJi CDCD
2U56162U5616
Alle in der vorstehenden Tabelle genannten Werte sind die Ergebnisse von Analysen der Arthrosporen, die nach Kultivierung für 2 Wochen bei 280C auf einem Agarmedium erhalten wurden, das 0,25$ Hefeextrakt, 0,5$ Malzextrakt, 0,1$ Kaseinhydrolysat (Casaminosäure), 2,0$ Saccharose, 1,5$ Glycerin und 2,0$ Agar enthielt» Die Abmessungen der Arthrosporen und die Zahl der Kerne sind der Mittelwert der Ergebnisse für ungefähr .100 Arthrosporen. Die durchschnittlichen Abmessungen der Konidien sind 3,5a1 χ 7,1 /U im Falle von ATCC-14553 und 4,3 jü χ 8,6 ia im Falle von 2M-16.All values given in the table above are the results of analyzes of the arthrospores obtained after culturing for 2 weeks at 28 0 C on an agar medium containing 0.25 $ yeast extract, malt extract 0.5 $ 0.1 $ casein hydrolyzate ( Casamino acid), $ 2.0 sucrose, $ 1.5 glycerin, and $ 2.0 agar. The dimensions of the arthrospores and the number of nuclei are the mean of the results for approximately .100 arthrospores. The average dimensions of the conidia are 3.5a 1 χ 7.1 / U in the case of ATCC-14553 and 4.3 jü χ 8.6 ia in the case of 2M-16.
Die zweite genetische Methode ist im wesentlichen die in Journal of General and Applied Microbiology 2 (1956) 401 beschriebene Methode. Hierbei werden die beiden zu kreuzenden Stämme vorher unterschiedlich markiert, z.B. mit unterschiedlichem Aminosäure- oder Vitaminbedarf. Sie werden gekreuzt und auf einem Minimalmedium (z.B, einem Medium aus 3,0$ Saccharose, 0,3$ NH.NO,, 0,1$ K9HPO., 0,05$ MgSO,.7 H9O, einer Spur FeSO,.7 H9O und 1,5$ Agar) in üblicher Weise kultiviert» Die Konidien der gewachsenen Kolonien werden gesammelt und auf ein Minimalmedium, z.B. das vorstehend genannte Medium, plattiert, und die gebildeten Kolonien werden untersucht. Der größte Teil des Wachstums besteht aus polyploiden Stämmen. : The second genetic method is essentially the method described in Journal of General and Applied Microbiology 2 (1956) 401. The two strains to be crossed are marked differently beforehand, for example with different amino acid or vitamin requirements. They are crossed and placed on a minimal medium (e.g., a medium made from 3.0 $ sucrose, 0.3 $ NH.NO, 0.1 $ K 9 HPO., 0.05 $ MgSO, .7 H 9 O, a Trace FeSO, .7 H 9 O and 1.5 $ agar) cultivated in the usual manner. The conidia of the colonies that have grown are collected and plated on a minimal medium, for example the medium mentioned above, and the colonies formed are examined. Most of the growth consists of polyploid stems. :
Palis erforderlich, können diese Methoden nicht nur wiederholt, sondern auch in Kombination mit anderen Methoden der selektiven Züchtung durchgeführt werden, wodurch verbesserte Ergebnisse erhalten werden können. Der erzeugte polyploide Stamm läßt sich, iaiis gewünscht, leicht nach einer bekannten Reinisolierungsmethode, z.B. durch Mikromanipulation, isolieren.Palis required, these methods can not only be repeated, but also in combination with others Selective breeding methods can be carried out, whereby improved results are obtained can. The polyploid strain produced can be, iaiis desired, easily by a known pure isolation method, e.g. by micromanipulation, isolate.
Unter Verwendung von Cephalosporium acremonium IM-5, einem Methionin-Leucin benötigenden Mutanten,Using Cephalosporium acremonium IM-5, a mutant requiring methionine-leucine,
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und Cephalosporium acremonium AP-78, einem Arginin-Phenylalanin benötigenden Mutanten, die "beide aus Cephalosporium acremonium ATCC-14553 als Ursprungsstamm gewonnen wurden, wurde eine Anzahl polyploider Stämme nach den vorstehend beschriebenen Methoden erhalten.and Cephalosporium acremonium AP-78, an arginine phenylalanine requiring mutants "both from Cephalosporium acremonium ATCC-14553 as the original strain were obtained, a number of polyploid strains were obtained by the methods described above.
Die Untersuchung des Vermögens dieser polyploiden Stämme, CPC anzuhäufen, führte zur Auffindung zahlreicher überlegener CPC-bildender Stämme, die.CPC extrazellulär in einer Konzentration von beispielsweise mehr als 7000 jag /ml anzuhäufen vermögen, wobei insbesondere mit Cephalosporium acremonium LA-1 01 (FERM-P Nr.2284, ATCC-20426, ] ΙΙΌ-30001) eine noch nie dagewesene hohe Ausbeute an ' CPC erhalten wird.The investigation of the ability of these polyploid strains to accumulate CPC led to the discovery of numerous superior CPC-producing strains which are able to accumulate CPC extracellularly in a concentration of, for example, more than 7000 jag / ml, in particular with Cephalosporium acremonium LA-1 01 (FERM -P No. 2284, ATCC-20426, ] ΙΙΌ-30001) an unprecedented high yield of 'CPC is obtained.
Die taxonomischen Eigenschaften dieser Stämme erwiesen sich als im wesentlichen identisch mit den Eigenschaften von Cephalosporium sp. ATCC-14553 mit Ausnahme der in Tabelle 2 genannten Unterschiede.The taxonomic properties of these tribes were proven proved to be essentially identical to the properties of Cephalosporium sp. ATCC-14553 with the exception of those in Table 2 mentioned differences.
5 0 98U/10565 0 98U / 1056
cn ο co cocn ο co co
ο cn σ>ο cn σ>
Durchmes
ser, μ Smaller one
Diameter
ser, μ
Kerne pro
Konidium
(A)number of
Cores per
Conidium
(A)
pro Konidium
(B) jag DNA content
per conidium
(B) hunt
pro Kern
(B/A) jxg DNA content
per core
(B / A) jxg
acremoniumCephalosporium
acremonium
Durchmesr-
3 er ,ja Bigger
Diameter
3 he , yes
acremoniumCephalosporium
acremonium
acremoniumCephalosporium
acremonium
acremoniumCephalosporium
acremonium
Alle vorstehend genannten Werte sind das Ergebnis der Analyse der Konidien, die von einer Schrägkultur nach der in der Fußnote zu Tabelle 1 beschriebenen Methode gewonnen wurden. Die Abmessungen der Konidien und die Zahl der Kerne sind die Durchschnittswerte für etwaAll of the above values are the result of the analysis of the conidia obtained from a slant culture using the method described in the footnote to Table 1. The dimensions of the conidia and the Number of cores are the averages for about
100 Sporen.100 spores.
Zur Kultivierung dieser polyploiden Stämme können die bekannten Methoden zur Kultivierung anderer CPC-bildender Stämme der Gattung Cephalosporium oder der Gattung Emericellopsis vorteilhaft angewandt werden. jTo cultivate these polyploid strains, the known methods for cultivating other CPC-producing Strains of the genus Cephalosporium or the genus Emericellopsis are advantageously used. j
Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, Endmelasse, n-Paraffine, Essigsäure, Methanol und ithanol. Als organische Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Harnstoff, Fleischextrakt, Pepton, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatkuchen, Erdnußkuchen, Trockenhefe und Maisquellwasser, während als Beispiele geeigneter anorganischer Stickstoffquellen Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat und Kaliumnitrat zu nennen sind. Falls erforderlich, können Metallsalze, z.B. die SO,-, Cl-, NO,-, CO.*-, ΡΟ,-Salze und andere Salze beispielsweise von Na, K, Ga, Mg, Mn, Zn, Fe und Cu zugesetzt werden.Examples of suitable carbon sources are glucose, Sucrose, starch, soluble starch, terminal molasses, n-paraffins, Acetic acid, methanol and ithanol. Examples of suitable organic nitrogen sources are urea, Meat extract, peptone, soybean meal, cottonseed cake, peanut cake, dried yeast and corn steep liquor, while as examples of suitable inorganic nitrogen sources ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, Ammonium phosphate and potassium nitrate should be mentioned. If necessary, metal salts such as the SO, -, Cl-, NO, -, CO. * -, ΡΟ, salts and other salts, for example of Na, K, Ga, Mg, Mn, Zn, Fe and Cu added will.
Ferner können nach Bedarf Aminosäuren (z.B. Methionin, Cystein und Serin), Thiosulfate, Fettsäureester, Öle, z.B. Schmalzöl und Olivenöl, und andere Mittel, die die Erzeugung von CPC fördern, zugesetzt werden, wodurch das Leistungsvermögen zur Bildung von CPC weiter gesteigert werden kann. .Furthermore, amino acids (e.g. methionine, Cysteine and serine), thiosulfates, fatty acid esters, oils, e.g. lard oil and olive oil, and other agents that reduce the Promote the production of CPC, which further increases the capacity for the production of CPC can be. .
Hinsichtlich der Kultivierungsbedingungen ist die Submerskultur mit Belüftung' im allgemeinen vorteilhaft. Die Temperatur liegt zweckmäßig im Bereich von 18° bis 35°C.As for the cultivation conditions, it is the submerged culture with ventilation 'generally advantageous. The temperature is expediently in the range from 18 ° to 35 ° C.
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Gute Ergebnisse werden erhalten, wenn der pH-Wert im ' Bereich von etwa 2 bis 10, vorzugsweise zwischen 4 und 9 gehalten wird. Eine Kultivierungszeit von 3 bis 15 Tagen ' ist ausreichend. Der größte Teil des gebildeten CPC findet sich im filtrierten Kulturmedium, so daß es zur Gewinnung des Antibiotikums vorteilhaft ist, die ZellenGood results are obtained when the pH in 'the range of about 2 to 10, is preferably maintained 4 to 9 A cultivation time of 3 to 15 days is sufficient. Most of the CPC formed is found in the filtered culture medium, so that it is advantageous to use the cells for obtaining the antibiotic
durch Zentrifugieren oder Filtration vom Kulturmedium j abzutrennen und dann das CPC aus dem Überstand oder Filtrat zu reinigen. Zur Isolierung des CPC können die Methoden, die für die fraktionierte Gewinnung von CPC allgemein üblich sind, erfolgreich angewandt werden. Beispielsweise kann das gewünschte Ergebnis durch Verwendung von Ionenaustauschharzen, Aktivkohle,nichtionischen Copolymer- | harzen, durch Gelfiltration usw. in geeigneter Kombina- "; tion erhalten werden. Iby centrifugation or filtration from the culture medium j and then to purify the CPC from the supernatant or filtrate. To isolate the CPC, the methods which are commonly used for the fractional recovery of CPC can be used successfully. For example can achieve the desired result by using ion exchange resins, Activated carbon, nonionic copolymer | resins, by gel filtration, etc. in suitable combinations "; tion can be obtained. I.
ι Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiterThe invention is further illustrated by the following examples
erläutert.explained.
In einen 2 1-Sakaguchikolben werden 500 ml eines Impfmediums gegeben, das 3,0$ Saccharose, 1,5$ Fleischextrakt, 0,5$ Maisquellwasser und 0,15$ CaCO* enthält und nach der Sterilisation mit Cephalosporium acremonium 2M-16 beimpft wird. Der Kolben wird auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 280C bebrütet. Inzwischen werden in einen 50 1-Fermentationstank aus nichtrostendem Stahl 30 1 eines Mediums gegeben, das 6$ Saccharose, 5$ Glucose, 3$ Erdnußkuchen, 3$ Sojabohnenmehl, 1,0$ BL-Methionin und 0,15$ CaCO5 enthält. Das Medium wird in üblicher Weise sterilisiert und gekühlt. Es wird dann aseptisch mit der vorstehend genannten Impfkultur beimpft und bei 280C unter Belüften und Rühren (30 1 luft/Min., 25O UpM) bebrütet.500 ml of an inoculation medium containing 3.0 $ sucrose, 1.5 $ meat extract, 0.5 $ corn steep liquor and 0.15 $ CaCO * are placed in a 2 l Sakaguchi flask and, after sterilization, inoculated with Cephalosporium acremonium 2M-16 will. The flask is incubated at 28 ° C. for 3 days on a reciprocating shaker. Meanwhile, 30 liters of a medium containing 6 $ sucrose, 5 $ glucose, 3 $ peanut cake, 3 $ soybean meal, 1.0 $ BL- methionine and 0.15 $ CaCO 5 are placed in a 50 liter stainless steel fermentation tank. The medium is sterilized and cooled in the usual way. It is then aseptically inoculated with the above seed culture and cultured at 28 0 C under aeration and agitation (30 1 air / min., 25O rpm) incubated.
Nach einer Kultivierungszeit von 190 Stunden wird das Kulturmedium abgezogen und durch Filtration von denAfter a cultivation time of 190 hours, the Culture medium withdrawn and filtered by the
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Feststoffen befreit., Das erhaltene Filtrat (25 l) wird auf OPC analysiert. Ein Leistungsvermögen von 8200 m/ml wird gefunden. Die fraktionierte Isolierung des CPC wird wie folgt durchgeführt: Das Filtrat (25 1) wird von oben nach unten durch eine Aktivkohlesäule (20 l) geleitet, : wodurch das CPC an der Kohle adsorbiert wird. Die Kohle wird zuerst mit Wasser gut gewaschen und dann mit 5$igem wässrigem Butanol, das 0,01 n-Na0H enthält, eluiert, wobei 31 1 CPC-Fraktionen erhalten werden. Diese Fraktionen werden zusammengegossen, eingeengt und mit NaOH auf pH 7,0 neutralisiert. Abschließend wird dem Konzentrat Äthylen bis zu einer Konzentration von 50 Vol.-$ zugesetzt. Auf diese Weise werden 143 g rohe Kristalle von CPC-Natrium-Freed solids., The filtrate obtained (25 l) is analyzed for OPC. A capacity of 8200 m / ml is found. The fractionated isolation of the CPC is carried out as follows: The filtrate (25 1) is passed from top to bottom through an activated charcoal column (20 l), whereby the CPC is adsorbed on the charcoal. The charcoal is first washed well with water and then eluted with 5% aqueous butanol containing 0.01 N NaOH, 31 1 CPC fractions being obtained. These fractions are poured together, concentrated and neutralized to pH 7.0 with NaOH. Finally, ethylene is added to the concentrate up to a concentration of 50 vol .- $. In this way, 143 g of raw crystals of CPC sodium
dihydrat erhalten. jobtained dihydrate. j
Das Leistungsvermögen wird nach einer enzymatischen Bestimmungsmethode unter Verwendung der Cephalosporinase von Aerobacter cloaceae (Biochemical Journal 116 (1970) 385) gemessen.The performance is determined according to an enzymatic method using the cephalosporinase from Aerobacter cloaceae (Biochemical Journal 116 (1970) 385) measured.
Die in Beispiel 1 beschriebene Kultivierung wird in der gleichen Weise durchgeführt, wobei jedoch der Stamm Cephalosporium acremonium LA-101 verwendet wird. Die ! Ausbeute an CPC im filtrierten Kulturmedium beträgt ; 7900 /ug/ml. ιThe cultivation described in Example 1 is carried out in the same way, except that the strain Cephalosporium acremonium LA-101 is used. The ! Yield of CPC in the filtered culture medium is; 7900 / µg / ml. ι
5098U/10565098U / 1056
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