DE2931792A1

DE2931792A1 - Antifibrotische substanz p-1894b, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2931792A1
Application number: DE19792931792
Authority: DE
Inventors: Tsuneo Kanamaru; Kazuhiko Ohta; Hisayoshi Okazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1978-08-07
Filing date: 1979-08-04
Publication date: 1980-02-21
Also published as: GB2028132A; FR2433026B1; JPS6111206B2; GB2028132B; JPS5522650A; US4260599A; DE2954566C2; FR2433026A1; DE2931792C2

Description

chelatbildner (z.B. α,α'-Dipyridyl), SH-Enzyminhibitoren (z.B. p-Chlorquecksilberbenzoat), gewisse Schwermetalle (z.B. Cu⁺⁺ und Zn⁺⁺) usw. bekannt. Diese Substanzen verursachen jedoch ernste Nebenwirkungen bei Warmblü-15 tern und können nicht als Arzneimittel verwendet werden, da sie stets die Biosynthese sowohl von Kollagen als auch von nichtkollagenen Proteinen nichtspezifisch hemmen. Es war offensichtlich, daß, wenn eine Substanz gefunden würde, die die Biosynthese von nichtkollagenem 20 Protein nicht hemmen, sondern die Kollagenbiosynthese allein spezifisch hemmen würde, diese Substanz erfolgreich für die Prophylaxe und Therapie von Krankheiten einschließlich verschiedener Formen der Organfibrose, die von einer übermäßig starken Vermehrung von Kollagen 25 begleitet ist, z.B. Arteriosklerose, Leberzirrhose, Keloid, Skleroderma, rheumatische Arthritis, Lungenfibrose usw., verwendet werden könnte.

Von der Anmelderin wurden zahlreiche Metaboliten von Mikroorganismen auf ihre Hemmwirkung auf die Proto- ι 30 kollagenprolinhydroxylase untersucht. Hierbei wurde die antifibrotische Substanz P-1894B gefunden, die die '

Kollagenbiosynthese spezifisch hemmt. (Diese Substanz ί

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ORIGINAL INSPECTED

wird nachstehend zuweilen kurz als P-1894B bezeichnet.) Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zu Grunde.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die neue antifibrotische Substanz P-1894B sowie die Herstellung dieser Substanz nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden, die Substanz P-1894B bildenden Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis die Substanz P-1894B im Kulturmedium angehäuft worden ist, und die Substanz P-1894B daraus isoliert.

Die Erfindung umfaßt ferner ein Arzneimittel, das die Gewebefibrose bei Warmblütern hemmt und die antifibrotische Substanz P-1894B enthält.

Die Erfindung kann mit Hilfe jedes gewünschten Mikroorganismusstammes verwirklicht werden, vorausgesetzt, daß der Stamm zur Gattung Streptomyces gehört und die ' antifibrotische Substanz P-1894B zu bilden vermag. Im Rahmen dieser Beschreibung werden ein solcher Stamm oder Stämme von Mikroorganismen zuweilen als P-1894B-Bildner bezeichnet. Als vorteilhafteste und repräsentativste P-1894B-Bildner sind Streptomyces sp. 1894 und Strepto- '.

myces sp. 1953 zu nennen, die beide von Bodenproben isoliert worden sind. Diese beiden Stämme wurden später als Streptomyces albogriseolus subsp. Nr.1894bzw. ί

Streptomyces albogriseolus Nr.1953 gekennzeichnet. Von diesen Stämmen wurde Streptomyces albogriseolus subsp. i Nr.1894 beim Institute for Fermentation unter der Zugangsnummer IFO 13881, bei der Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute, unter der Zugangsnummer FERM-P Nr*4575 und bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer ATCC 31422 hinterlegt. Streptomyces albogriseolus

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ORiGINALlNSPECTED

Nr. 1953 wurde ebenfalls bei den gleichen Instituten unter den Zugangsnummern IFO 13882, FERM-P 4576 bzw. ATCC 31423 hinterlegt.

Die Merkmale der beiden vorstehend genannten Stämme von Mikroorganismen, die nach ähnlichen Methoden untersucht wurden, wie sie in International Journal of Systematic Bacteriology 16, 3 (1966) 313-340 untersucht wurden, sind nachstehend genannt. Falls nicht anders angegeben, handelt es sich um die Kulturmerkmale, die bei der Kultivierung jedes Stammes bei 28°C für 14 Tage beobachtet wurden.

1) Streptomyces albogriseolus subsp.Nr.1894 I) Morphologische Eigenschaften

Die sporentragenden Hyphen sind vom vegetativen Mycel einfach verzweigt. Sporen treten in Ketten von mehr als 10 auf. Die Form der sporentragenden Lufthyphen ist spiralförmig. Sie weisen offene Schleifen, Flexibilis und gelegentlich Haken auf. Windungen (Whorls) wurden nicht beobachtet. Die Sporen sind ellipsoid bis zylindrisch, 0,4 bis 0,6 χ 0,7 bis 1,2^m. Die Oberfläche der Sporen ist warzig (Saccharose-Nitratagar, Nährboden aus Stärke-anorganisches Salz (ISP-4)), zuweilen kurz ' "stant" stachelig (spiny) <Tyrosin-agar (ISP-7), Hefe- ! Malzagar (ISP 2)) und/öder glatt (Glycerin-Asparagin-Agar ("ISP-S).). |

J II) Kulturmerkmale

Der Wachstumgrad, die Farben des Luftmycels, der Rück- ,

j seite, die Farben von löslichen Pigmenten, falls gebil- ^:

j det, und andere Kulturmerkmale auf verschiedenen Medien ' i- 30 sind in Tabelle 1 genannt. Der Standard-Farbcode, der bei!

jeder Angabe der Farbe in Klammern genannt ist, wurde '

aus dem Color Harmony Manual of Container Corporation of America entnommen.

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T a b e lie

	ο', ■	Kulturmerkmale von Streptomyces albagriseolus subsp. Nr. 139 4 auf	' verschiedenen Nährmedien	Wachstum	Luftmycel	Rückseite des Substratmycels	Lösliche Pigmente	1Ό
	,ο ■■ ■ ο σ 00		mäßig, farblos bis hell Elfen bein (2ca)	mäßig, pulverig, grau (near grays, 2cb, ivory tint, teilweise 2dc natural string)	farblos bis hellgelblichgrau	keine	931792
	Q782	Medium ■' ,,	mäßig;, grau (near grays," 3cb,, sand) bis hellweizen ■ (2ea)	schlecht bis mäßig, weiß bis grau (2cb)	grau bis colonial yellow (2ga) , Bambus (2gc)	keine
		Saccharose-Nitrat- Agar ,	mäßig, hell weizen (2ea)	reichlich, pulvrig, weiß, Elfenbein bis grau (near grays, 2cb, teilweise 2dc)	hell lohfarben (light tan)(3gc) bis hellbernstein (3ic)	blaßbraun
O JJ Q Z		Glucose-Asparagin- Agar I	mäßig, erhaben (raised), hell weizen (2ea)	mäßig, pulvrig, weiß bis grau (near grays 2cb bis 2dc)	hellweizen bis senffarben (mustard) (2ea, 2gc, 2Ie)	keine
> I rn		Glycerin-Asparagin- Agär (ISP-Medium 5)	mäßig, grau (near grays, 3cb)	mäßig, pulvrig, grau..' (near grays, 2dc^:, teilweise 15e)	,grau bis dunkelgrau mit blaßgelblich- braun	keine
2TED	Anorganische!Salze- Stärke -Agar , (ISP-Medium 4)	mäßig, farblos bis hellelfen- bein (2ca)	schlecht, weiß	farblos bis elfen beinfarben (ivory)	keine
	Ty ras in-Agar ,'. (ISP-Medium 7)
	Nähragar

Tabelle 1 (Forts.)

Kulturmerkmale von Streptomyces albagriseolus subsp. Nr. 1894 auf

verschiedenen Nährmedien

Medium

Hefe-Malzagar
(ISP-Medium 2)

	O
	CO
	O
O	O
33
Q	α»
	O
	-«4
Z	CB
CO	KJ

Hafermehlagar
(ISP-Medium 3)

Wachstum Luftmycel

Rückseite des Substratmycels

Lösliche

Pigmente

reichlich, faltig oder
"holded", farblos bis hellweizenfarbig

mäßig, farblos bis helweizenfarbig (2ea) mäßig, pulverig,

elfenbeiifarben (ivory)
(2ca bis 2ea) bis grau
(near grays, 2cb)

schlecht, pulverig,
weiß

bernsteinfarben (3pc) bis goldbraun (3pg)

farblos bis
hellweizenfarben

blaßgelblichbraun

CD IN*

III) Physiologische Merkmale

a) Temperaturbereich für das Wachstum:

Wachstum auf Maltose-Hefeextrakt-Agar (1% Maltose, ." 0,4% Hefeextrakt und 2% Agar, pH 7,0) wurde während einer Zeit von 2 Wochen beobachtet. Wie Tabelle 2

zeigt, war der optimale Temperaturbereich für das

Wachstum dieses" Stammes 28 bis 40⁰C.

Wachstumsgrad temp.,⁰C grad temp.,⁰C

	Tabel	le 2 -
Wachstum— temp.,⁰C	Wachstums grad	Wachstums tempo,⁰C
15	-+■"-;	32
20	++	37
24	++	40
28	+++	45
30	+++	55

15 In der Tabelle bedeuten: - = kein Wachstum,

+ = Wachstum, ++ = gutes Wachstum, +++ = reichliches Wachstum.

b) Verflüssigung von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine, ^ 28°C, 3 Wochen): positiv, jedoch sehr schwach.

c7 Hydrolyse von Stärke CNährboden aus Stärke und anor- : ■ ganischem Salz, 28°C): positiv.

d) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch (Magermilch, 37°C): Koagulierung positiv, Peptoni-

sierung positiv, jedoch schwach, -- !

e) Reduktion von Nitraten (Peptonwasser mit 1% Kalium- | nitrat, 28°C, 3 Wochen); negativ.

f) Bildung von melanoiden Pigmenten: auf Tyrosinagar, ! Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP 6) und Tyrosin- \ Hefebrühe (ISP 1) keine Bildung von melanoiden Pig- I men ten. .'■''_ ,·

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15

20 25

30

IV) Assimilierung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gotlieb-Agar (ISP 9), 28°C): Das Kohlenhydrat-Assimilationsspektrum dieses Stammes ist in Tabelle 3 angegeben.

	Tabel	Ie 3	Assimilierungs- grad
Kohlenstoff quelle	Assimi- lierungs- qrad	Kohlenstoff quelle	+
L-Arabinose	++	i-Inosit
E-XyIöse		L-Rhamnose	+
D-Glucose		Eaffinose	+
D-Fructose	₊	D-Mannit '

Kontrolle Saccharose ⁺⁺ (nicht zugesetzt) -

In dieser Tabelle bedeuten: - = nicht assimiliert,

+_ = Assimilierung zweifelhaft;

+ = assimiliert; ++ = gut assimiliert.

2) Streptomyces albogriseolus Nr.1953

I) Morphologische Merkmale

Die sporentragenden Hyphen waren vom vegetativen Mycel einfach verzweigt. Sporen traten in Ketten von mehr als 10 auf. Die Form der sporentragenden Lufthyphen war spiralig, offene Schleifen, zuweilen Flexibilis und Haken. Windungen (Whorls) wurden nicht beobachtet. Die ^: Sporen waren ellipsoid bis zylindrisch, 0,5 bis 0,8 χ , 1,0 bis 1,7 um. Die Oberfläche der Sporen war warzig : oder dornig (Saecharose-Nitrat-Agar, Stärke-anorganisches Salz (ISP-4), Tyrosin-Agar (ISP 7)) und gelegentlich glatt (Glycerin-Asparagin-Agar (ISP 5)),

II) Kulturmerkmale

Die KulturmerTcmale dieses Stammes sind in Tabelle 4 genannt. Die gleichen Farbcodes, die vorstehend genannt wurden, werden verwendet.

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' ^! Tabelle 4 , , , Kulturmerkmale von Streptomyces alborgriseolus Nr* 1953 auf verschiedenen Mährmedien

	O
	O
O	O
	OO
Q
■ζ	O
γ-	«0
οο
TJ
ΓΠ
O
-i
ΓΠ
O

Nr.
1

. Nährmedium

Wachstum

Luftmycel Rückseite

Lösliche Pigmente

Saccharose-Nitrat- Agar

Glucose-

Asparagin-

Agar

Glycerin-Asparagin-
Agar (ISP 5)

Agar aus
Stärke und
anorg. Salz
(ISP 4)

Tyrosin-Ägar
(ISP 7)

Nähragar

mäßig_f farbloseIfenbe infarben (2 ca)

mäßig, pulverig, weiß-grau (near grays, 2cb, lfe)

mäßig, hellgelb- gering, weiß lichbraun (2ca-2ea)

mäßig, hellbraun mit gräulichem Stich (3gc, Lt Tan-3ie)

mäßig, leicht erhaben (raised), farblos, elfenbeinfarben (2ca)

mäßig, elfenbeinfarben (2 ca) -he 11-gelblichbraun (2ea)

mäßig, pulverig, weiß-grau (2ca, near grays, 2cb, ldc)

mäßig, pulverig, weiß-grau (near grays, 2cb, Elfenbeinstich (ivory tint)-2fe, Covert Gray)

mäßig, pulverig, grau (near grays, 2cb, 2dq, 2fe), mi t we i ßen Fle cken (patches)

mäßig, elfenbein- sehr spärlich, farben-hellgelb- weiß lichbraun (2ea) färblos-grau mit gelbem

Stich keine

hellgelblichbraun keine (2ca-2eä)

bernsteinfarben (3ec, blaßbraun

Bisque-31g,

Adobe braun)

hellgelblichbraun (2ea)- keine grau (2cb, 2fe)

hellgelblichbraun mit blaßbraun grauem Stich (2ie),

Lt Mustard tan, 2gc,

Bamboo, 2 ge,

Covert Tan >

farblos-elfenbeinfarben keine

CD Cx)

Tabelle

(Forts.)

KuItürmerkmale von Streptomyces alborgriseolus Nr. 195 3 auf verschiedenen Nährmedien

Nr.

Nährmedium

Wachstum

Luftmycel Rückseite

Lösliche Pigmente

' Hefe-Malz-Agar mäßig, faltig mit sehr spärlich, (ISP 2) Spalten (crevices), weiß elfenbeinfarbenhellgelblichbraun hellgelblichbraun blaßgelblichbraun

	O
	O
O	O
s2	OO
Q
Z	O
r~ ,	OO
	IO
W
TJ
m
O
H
m
D

Hafermehl-Agar (ISP 3)

mäßig, dünnes Wachstum, farbloshellgelblichbraun

sehr spärlich, pulverig, weiß

farblos - blaßgelbliqh-

hellgelblichbraun braun

III) Physiologische Merkmale "_

a) Temperaturbereich für das Wachstum:

Das Wachstum des Stammes wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, beobachtet. Wie Tabelle zeigt, ist der optimale Temperaturbereich für das Wachstum 28 bis 40⁰C.

	Tabelle	5	Wachstums tempo,⁰ C	Wachstums- qrad
Wachstums— temp.,⁰C	Wachs turns- qrad	32	+++
15	+	- 57 .	+++
20	++	40	+++
24-	++	45	++
28	+++	55	- _
30	+++

15 In der Tabelle bedeuten: - = kein Wachstum,

+ = Wachstum, ++ = gutes Wachstum, +++ = reichliches Wachstum. '

b) Verflüssigung von Gelatine (Glucose-Pepton-Gelatine, 28°C): positiv.

c) Hydrolyse von Stärke (Nährboden aus Stärke und anorganischem Salz, 28°C): positiv.

d) Koagulierung und Peptonisierung von Magermilch (Magermilch, 37°C): positiv, jedoch schwache Koagu-

25 lierung, Peptonisierung positiv.

e) Reduktion von Nitraten (Peptonwasser mit 1% Kaliumnitrat, 28°C, 3 Wochen): negativ.

f) Bildung von melanoiden Pigmenten: Tyrosin-Agar: blaßbraunes Pigment;

30 Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: negativ Trypton-Hefebrühe: negativ

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IV) Assimilierung von Kohlenstoffquellen (Pridham-Gotlieb-Agar):

» Das Kohlenhydrat-Assimilierungsspektrum dieses Stammes ist in Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Kohlenstoff- Assimi- Kohlenstoff- Assimilie- -quelle lierungs- quelle rungsgrad qrad

L-Arabinose + i-Inosit ++ ^;

E-Xylose + L-Khamnose ++

D-Glucose ++ Eaffinose +

D-Fructose + D-Mannit + - ++ .

Saccharose ₊ Kontrolle

(nicht zugesetzt)

In dieser Tabelle bedeuten: - = nicht assimiliert + = assimiliert

■M- = gut assimiliert

Natürlich können auch beliebige andere Stämme der Gattung Streptomyces, die P-1894B zu bilden vermögen, einschließlich ihrer künstlichen Mutanten für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.

Der P-1894B-Bildner kann unter Verwendung eines flüssigen oder festen Mediums kultiviert werden, jedoch ist ' es normalerweise zweckmäßig, die Kultivierung in einem flüssigen Medium als Schüttelkultur oder aerob unter 25 Rühren durchzuführen. ^!

Beliebige Nährmedien können verwendet werden, vorausge- ■ setzt lediglich, daß sie sich für das Wachstum von j Streptomyces gut eignen und die extrazelluläre Bildung von P-1894B ermöglichen. Beispielsweise kann das Medium 30 als Kohlenstoffquellen Glucose, Lactose, Glycerin, Stärke, Saccharose, Dextrin, Melasse und organische Säuren (z.B. Essigsäure oder Weinsäure) enthalten.

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Beispiele von Stickstoffquellen, die im Medium vorhanden sein können, sind Pepton, Casaminosäure (Difco), N-Z-Amin A (Sheffield) und andere Proteinhydrolysate, Hefeextrakt, Malzextrakt, Sojabohnenkuchen, Maisquellwasser, Aminosäuren (z.B. Asparaginsäure und Glutaminsäure) und verschiedene Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid).

Als anorganische Salze können verschiedene Phosphate (z.B. Mononatriumphosphat und Dikaliumphosphat), Metallsalze, z.B. Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-

sulfat und Schwermetallsalze (z.B. Mangansulfat und ; Zinksulfat) dem Medium zugesetzt werden.. Zur Förderung des Wachstums können ferner Vitamine (z.B. Vitamin B^, und Calciumparfothenat), mit Nucleinsäure verwandte ; 15 Verbindungen (z.B. Adenin und Uracil) usw. zugesetzt werden.

In Abhängigkeit vom Kultivierungsverfahren und von den Kultivierungsbedingungen kann es in gewissen Fällen vorteilhaft sein, ein Antischaummittel, z.B. ein SiIi- ! 20 conöl, Polypropylenglykolderivate (z.B. "Actocol'J herge-, ^; stellt'von der Anmelderin), Sojabohnenöl usw. zuzu-J setzen, die sämtlich zu gesteigerter Bildung von j P-1894B führen. ,

Die Kultivierungstemperatur und -zeit, der pH-Wert des Mediums und andere Kultivierungsbedingungen hängen vom jeweiligen Stamm, von der Zusammensetzung des Mediums ! und anderen Faktoren ab. Die Kultivierungsbedingungen werden zweckmäßig so gewählt, daß die Ausbeute an P-1894B maximal ist. Beispielsweise ist es in-vielen Fällen vorteilhaft, den Stamm bei etwa 20 bis 40°C unter aeroben Bedingungen 1 bis 10 Tage zu bebrüten, wobei der pH-Wert des Mediums bei etwa 4 bis 9 gehalten wird.

Zur Isolierung der antifibrotischen Substanz P-1894B <

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aus dem hierbei erhaltenen Kulturmedium können verschiedene Methoden in geeigneter Kombination angewendet werden. Zu diesen Methoden gehören die Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungs-5 mittel unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen, wobei als Lösungsmittel beispielsweise Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform, Butanol, Eenzol, Toluol, Diäthyläther, Methylenchlorid oder Methylisobutylketon in Frage kommen, die Adsorptionschromatographie mit 10 Aktivkohle, Kieselgel, Aluminiumoxyd o.dgl., die Gelfiltration an einer Säule des Harzes "Sephadex" und die Ionenaustauschchromatographie an einem Ionenaustausch- , harz. Mit Hilfe einer geeigneten Kombination dieser Methoden ist es möglich, die gewünschte antifibrotische 15 Substanz P-1894B in Form von Kristallen oder eines

kristallinen Pulvers aus dem Kulturmedium zu isolieren.

Die in dieser Weise erhaltene antifibrotische Substanz P-1894B hat die folgenden Eigenschaften:

1) Physikalische und chemische Eigenschaften

a) Schmelzpunkt 165-172°C

b) Elementaranalyse: 62,62 _+ 1,0% C, 6,28 _+ 0,5% H, _!

30,06 +_ 1,0% 0.

P-1894B besteht aus C, H und 0. N ist nicht nachgewiesen worden (bestimmt mit dem Perkin-Elmer-Gerät ; 25 Modell 240).

c) Molekulargewicht etwa 1000 (durch Dampfdruckosmometrie mit Äthylacetat als Lösungsmittel) '

d) Spezifische Drehung: /öyj⁵ = +155° +15° (c = 0,419, Methanol)

e) Farbreaktionen:

I) Naphthoresorcin-Schwefelsäure:

positive Reaktion (grünlich-schwarz)

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II) Alkoholisches Magnesiumacetat: positive Reaktion (bläulich-violett)

III) Ninhydrih: negative Reaktion IV) Barton' Reagens: negative Reaktion

f) Löslichkeit: Leicht löslich oder löslich. in Chloroform, Dioxan, Äthylacetat, Dimethylsulfoxid, Aceton, Methyläthylketon, Pyridin, Methanol, Äthanol, Benzol, Toluol, Diäthyläther und 0,In-NaOH, schwerlöslich oder unlöslich in Petrolather, η-Hexan und Cyclohexan.

g) Absorptionen im UV-Bereich und sichtbaren Bereich

des Spektrums: Fig.l zeigt die Absorptionen der : antifibrotischen Substanz P-1894B im UV-Bereich und sichtbaren Bereich des Spektrums.

Im Diagramm stellt die ausgezogene Kurve das in 90%igem wässrigem Methanol aufgenommene Spektrum, die gestrichelte Kurve das in 0,ln-HCl-90% wässrigem Methanol aufgenommene Spektrum und die strichpunktierte Linie das in 0,ln-NaOH-90% wässrigem Methanol aufgenommene Spektrum dar. Die Wellenlängen (niti) und die E, -Werte, die Absorptionsmaxima unmittelbar nach der Auflösung in verschiedenen Lösungsmitteln ergeben, sind nachstehend genannt.

Lösungsmittel Wellenlänge (E^ _Gm>

90%iges wässriges Methanol 218_+2 (432_+4O) , 318+2 (59V6) ,

440+2 (71+7) ;

0,ln-HCl-90%iges wäss- 218+2 (427^40), 318+_2 (62+_6) , riges Methanol 435^2 (7Ο_+7) . ;

0,ln-Na0H-90%iges wäßriges 228+^2 (297^30), 282+^2 j Methanol (144+^14), 53O_+2 (77^8) ]

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h) Infrarot-Absorptionsspektrum: Fig.2 zeigt die Absorptionen von P-1894B im Infrarotbereich des Spektrums (KBr)-, Die folgenden Hauptwellenzahlen ergeben Absorptionsmaxima:

3430, 2980, 295O, 1740, I7O5, 1645, 1570, 1440, 1380, 1290, 1120, 1100, 1080, 1040, 1010, 970 cra"¹

i) Allgemeine Eigenschaften und Aussehen: ^;

Schwach sauer; Kristalle orangegelb bis orangerot

j) pKa: 10,15 (durch Titrimetrie, in 66,7%igem wässrigem 10 DMF)

k) NMR: Das in Deuterio-Chloroform bei 90 MHz aufgenommene NMR-S-pektrum ist in Fig.3 dargestellt.

1) Dünnschichtchromatographie, Rf-V.'erte: Die Rf-Werte auf Kieselgelplatte (Merck, Produkt Nr.5715) sind nachstehend genannt.

Lösungsmittel Rf

Wasser

Chloroform

Chloroform-Aceton (10:1)
Chloroform-Äthylacetat (2:3)

Chloroform-Äthylacetat (1:1)

Mit Wasser gesättiges Butylacetat Aceton-n-Hexan (1:1)

Benzol-Methanol (10:1)
n-Butanol-Essigsäure-HpO (3:1:1)

Äthylacetat

Chloroform-Methanol (10:1)

Aceton

Ein Vergleich von P-1894B mit den vorstehend genannten ^:

30 physikalischen und chemischen Eigenschaften mit den !

bekannten beschriebenen Substanzen ergibt, daß P-1894B

dem Aquayamycin, Ayamycin A₂, TA-435A und Julymycin B-II

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/NSPECTBD

0	,01
0.	,21
O₁	,50
0,	,32
o,	.40
0,	70
0,	56
0,	80
0,	83
0,	96
0,	97
0,

ähnlich ist. P-1894B unterscheidet sich jedoch von Aquayamycin im Schmelzpunkt, Molekulargewicht und Verhalten in der Dünnschichtchromatographie (Rf) (J.Antibiotics 21, Nr.2 (1968) 91-97). E_s unterscheidet sich von Ayamycin A„ im Schmelzpunkt und in der spezifischen Drehung (J. Antibiotics, Ser.A, 13 Nr. 5 (1960) 321-326), von TA-435A im Verhalten bei der Dünnschichtchromatographie (Rf) (J.Antibiotics 21, Nr.2 (1968) 91-97) und von Julymycin B-II im Molekulargewicht, in der spezifischen Drehung, im UV-Spektrum und Verhalten bei der Dünnschichtchromatographie (Rf) (J.Antibiotics, ; Ser.A, 17, Nr.4 X1964) 156-160 und J.Antibiotics 21, Nr.2 (1968) 91-97). Es muß daher angenommen werden, daß die antifibrotische Substanz P-1894B eine neue Substanz

15 ist. , -

2) Biologische Eigenschaften

I) Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase:

Die Bestimmung der Hemmwirkung wurde nach der Methode von R.E. Rhoads und Mitarbeitern (Methods in Enzymology , XVIIB (1979) 306) unter Verwendung eines teilweise gereinigten Enzympräparats, das aus Hühnerembryos nach ^: der Methode von K.T.Kivirriko und Mitarbeitern und J.Halme und Mitarbeitern (J.Biol.Chem.242 (1967) 4007 und Biochim. Biophys."Acta 198 (1967) 460) erhalten worden war, und von (Pro-Pro-Gly),- .4H₂O als Substrat (hergestellt von Tanpakushitsu Kenkyu Shörei Kai (Protein Research Foundation) Osaka) durchgeführt. Die -Bestimmung ergab, daß die Konzentration von P-1894B, die ι für eine 50%ige Hemmung von 100 ug (als Protein) des teilweise gereinigten Enzyms erforderlich war, etwa 7 ug/ ml betrug. j

II) Herrmwirkung auf die Biosynthese von Kollagen; |

i * ί _ j

Grundlegend nach der von R.A. Salvador und Mitarbeitern beschriebenen Methode (Arch.Biochem. Biophys. 174 (1976)

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382) wurden 0,3 mg/kg Sprague-Dawley-Ratten (weiblich, 3 Wochen alt) intraperitoneal einmal täglich für eine Dauer von 6 Tagen verabreicht. Die Mengen von Kollagen und nicht-kollagenen Proteinen in den Uteri wurden mit den Zahlen für Kontrolltiere verglichen. Wie die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, hemmte P-1894B die Biosynthese von Kollagen spezifisch und stark.

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ORIGINAL INSPECTED

' . ■ ' ' . ■ ■ ' ' .' ' ■ ■ ■ ' ■ , ■' ' ■ Tabelle 7 ' ' , ■' _: . _;

Gruppe Körperge- Gesamtprotein Kollagen im Nicht-kollagenes Hemmung in %

wicht der des Uterus, Uterus, mg Protein³^ im Kollagen nicht-kolla-Ratten, g mg Uterus, mg genes Protein

A)Kontrolle , ^! . , . ,

(1) 86 +_ 4 13,9 _+ 1,6 3,12 +.0,48 10,78 +_ 1,14

iß) Kontrolle ,

; (2) ■ . ■ ■. ■ . ' ■ ;■■ ι ■ \ , ■ ■ . '

17ß-Östra- 82 +_ 4 26,6 + 7,3 4,39 + 0,16 24,21 + 7,21 '°' ' diol ' ' , ■ ' . ""* ■■ , ■ . ■ ■ .■ · ■ ■

■ ■ °^: ■' , ■,' '■ ■''■,■■■'■■ ' ■ ■

¹ oo C) 17ß-Östra- ,' , , , , , , ■ , '

^>v; ■ diol . . ■ ' ■■''..■ μ

O (5 ug) + 72 +_ 5 30,4 + 5,0 3,41 +_ 0,22 26,99 + 4,67 78 " -21 ¹^

^ P-f894B _{( 1)C}) l

_ö S; (0,3 mg/kg) ^! (P<0,01)

2 ■ ■ ■ ■'■■■■'

2 ■ . i , ' ■■■.■'■' ' '■ ■' ■ , ' ' '

■r- ■ a) Nicht-kollagenes Protein = Gesamtprotein - Kollagen

% b) Hemmung in % = χ 100

H c) Stark verschieden vom Wert der Kontrolle (2).

rn ■ ■ . ■ ■ . ■ ■ ' ■ ' ' ' . ■

σ ■, ^! ' '■■■■, ■ ■ . ro

Der Versuch wurde mit Gruppen von je 4 Ratten durchgeführt., <ß

■ . ■ , ■■ ■ ■ ■ ' ' . ' ■■ ■ ' ■■ ' ' ' , ' co ■■.

III) Wirkung von P-1894B auf die Biosynthese von

Kollagen bei mit Tetrachlorkohlenstoff ausgelöster Leberzirrhose

Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 110 g wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Die Gruppe I (Kontrolle) erhielt Kochsalzlösung (1 ml/Ratte), während die Gruppen II, III und IV ein Gemisch von 10% CCl₄ und Olivenöl (1 ml/Ratte) zweimal wöchentlich in insgesamt 8 Dosen intraperitoneal erhielten. Die Gruppen III und IV erhielten 4 Wochen P-1894B oral mit dem Futter. Die durchschnittliche Dosis von P-1894B betrug bei der Gruppe III 3,25 und bei der Gruppe IV 6,16 mg/kg pro Tag. Die Ratten wurden einen Tag nach der letzten Injektion getötet. Die Leber wurde für die Bestimmungen

15 unmittelbar entnommen.

Bestimmung der Protokollagenprolinhydroxylase-Aktivität:

Ein 10%iges Homogenat der Leber wurde in 20 mMol Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 0,2 Mol NaCl, 0,1 Mol Glycin, 5 χ 10"⁵ Mol 1,4-Dithiothreitol und 0,1% Polyäthylen-

glykol-p-Isooctylphenyläther ("Triton X-100») enthielt, unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators hergestellt. Das Homogenat wurde 20 Minuten bei 15000 g zentrifugiert. Am klaren Überstand wurde die Prolin- ; hydroxylaseaktivität nach der Methode von Hutton und Mitarbeitern (Anal.Biochem. 16 (1966) 384-394) bestimmt. Der Proteingehalt des Homogenats wurde nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern (J.Biol.Chem. 193 (1951) 265-275) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als 1 Standard ermittelt.

! Bestimmung des Hydroxyprolingehalts:

Der Hydroxyprolingehalt der Leber wurde in einem 6n-HCl-Hydrolysat (HO⁰C, 22 Stunden) nach der Methode von Blumenkrantz und Mitarbeitern (Anal.Biochem.63 (1975) 331-340) bestimmt.

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ORIGINAL INSPECTED

Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, daß nach der Behandlung mit P-1894B (6,16 mg/kg pro Tag, p.o.) die spezifische Aktivität der Protokollagenprolinhydroxylase und der Hydroxyprolingehalt in der Leber im Vergleich zu der Leber von mit CCl₄ fibrotisch gemachten Ratten, die kein P-1894B erhalten hatten, stark reduziert waren.

Tabelle 8

Einfluß von P-1894B auf die Protokollagenprolinhydroxylase-Aktivität und den Hydroxyprolinqehalt der Leber

Gruppe

Körpergewicht,g zu Be— Bei Verginn suchsende

Protokollagenprolin
hydroxylase
(Zerfall/
Minute pro
mg Protein)

Hydroxyprolin

(ug/100 mg Protein)

Kochsalzlösung
(Kontrolle) ■113+5 . 210+13

CCl₄ 111+5 193.+8

CCl₄ +

P-1894B

3,25 mg/kg/

Tag 112+9 199±19

6,16 mg/kg/

Tag 111+5 198+_9

263 +70
504 + 87

79,4 _+ 8,5 145,8 ±18,3

457 _+ 68 132,4 +29,6

357+. 15· 122,6 ±14,0»

•stark unterschiedlich gegenüber der CCl₄~Gruppe, P 0,05, η = 5.

IV) Akute Toxizität: peritoneal)

rs/ 100 mg/kg (Maus, intra-

30 Wie bereits erwähnt, ist P-1894B eine neue Substanz mit Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase und selektiver Hemmwirkung auf die Biosynthese von Kollagen und daher wertvoll beispielsweise als biochemisches Reagenz oder Inhibitor der Gewebefibrose bei Warmblütern

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• 2A _

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Als Inhibitor der Fibröse von tierischem Gewebe kann P-1894B für die Prophylaxe und Therapie der Organfibrose bei Tieren, insbesondere bei Säugetieren (Laboratoriumstiere wie Kaninchen, Ratte und Maus, Haustiere wie Hund und Katze und Menschen) verwendet werden. Die Organfibrose ist ein Sammelbegriff, der die verschiedenen Krankheiten bezeichnet, die durch übermäßig starke Vermehrung von Kollagen entstehen, und umfaßt Krankheiten wie Lungenfibrose, Leberzirrhose, Nephtosklerose, Arteriosklerose, Skleroderma, Myelofibrose, chronische

Arthritis usw. (Hotchi: Naika (Internal Medicine) 41 (1978) 724).

Für die Verwendung zur Prophylaxe oder Therapie von Organfibrosen kann P-1894B oral oder in anderer Weise entweder als solches oder in Kombination mit geeigneten pharmakologisch unbedenklichen Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln in Arzneiformen wie Pulver, Granulat, Tabletten, Kapseln und Injektionslösungen verabreicht werden. Die Dosis hängt von der zu bekämpfenden Krankheit, vom Zustand, vom Empfänger, vom Darreichungsweg und anderen Faktoren ab. Für die Prophylaxe oder Therapie der Leberzirrhose, Arteriosklerose oder chronischen Arthritis bei Erwachsenen wird die Substanz beispielsweise zweckmäßig oral in einer Tagesdosis von etwa 2 bis 50 mg in einer Einzelgabe oder unterteilt in bis zu drei Gaben verabreicht.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen zur Zeit bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

Beispiel 1

Streptomyces albogriseolus subsp.Nir.1894 (ATCG 31422, ' IFO 13881) wurde zum Beimpfen von zwei 2-Liter Sakaguchikolben verwendet, die je 500 ml eines flüssigen Nährmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung enthielten: 2,0% Glucose, 1,0% Glycerin, 0,5% rohes Soja-

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ORiGlNALlNSPEGTED

bohnenmehl, 0,5% Maisquellwasser, 0,3% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat. Pie beimpften Kolben wurden auf einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 28°C bebrütet, wobei etwa 11 Kultur erhalten wurde. Diese Kultur wurde in einen 50 1-Fermenter überführt, der 30 1 des Nährmediums der gleichen Zusammensetzung enthielt, worauf 3 Tage bei 28°C unter Belüftung und Rühren bebrütet wurde. Die ^: erhaltene Kultur in einer Menge von 15 1 wurde weiter in einen, 200 1-Fermenter überführt, der 100 1 eines

flüssigen Nährmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung enthielt: 5% Dextrin, 3% rohes Sojabohnenmehl, 0,7% Polypepton, 0,05% Eisen<II)-sulfat, ·Ό,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Mangansulfat, 0,05% Dikaliumphosphat und O,5% Calciumcarbonat. Das Medium wurde unter Belüftung und Rühren 2 Tage bei 28^PC bebrütet. Zu etwa 80 1 des erhaltenen Kulturmediums wurden 2 kg "Topco-Perlite Nr.34" (Toko Perlite Kogyo K.K.) gegeben. Das Gemisch wurde mit einer Filterpresse, die mit 6 kg des . 20 Filterhilfsmittels "HyfIo Super-Cel" (Johnes-Manville) beschichtet war, filtriert, wobei etwa 70 1 Filtrat erhalten wurden. Das Filtrat wurde mit Schwefelsäure auf j pH 3,0 eingestellt und zweimal mit 25 1 Äthylacetat ' extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und zweimal ' 25 mit 15 1 Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde ί unter vermindertem Druck eingeengt, wobei etwa 150 ml ' Konzentrat erhalten wurden. Das Konzentrat wurde mit ■ etwa 50 ml Chloroform verdünnt und durch eine Kieselj säuresäule (Merck) (4 χ 32 cm) geleitet. Die Elution wurde mit 2 1 Chloroform vorgenommen. Die P-1894B-Frak— tionen wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck eingeengt. Anschließend wurden 500 ml η-Hexan zu etwa 50 ml Konzentrat gegeben, wobei die aktive Substanz als Öl ausgefällt wurde. Die ölige Fraktion wurde in einer geringen Menge Äthylacetat gelöst und durch eine

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ORIGlNALiNSPECTED

mit η-Hexan behandelte Säule (4 χ 40 cm) einer Kieselsäure geleitet. Die mit 2 1 n-Hexan-Chloroform (1:1) • austretende Fraktion wurde verworfen. Die P-1894B-Fraktion wurde mit Chloroform-Äthylacetat (1:1) eluiert und 5 unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das

trockene Konzentrat wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und durch eine Säule (3,5 χ 31 cm) einer mit Chloroform vorbehandelten Kieselsäure geleitet. Die mit 1,2 1 Chloroform austretende Fraktion wurde verworfen. Die mit Chloroform-Äthylacetat (1:1) eluierten P-1894B-Fraktionen wurden zusammengegossen (etwa 600 ml) und , unter vermindertem Druck eingeengt. Zu 50 ml Konzentrat wurden 300 ml η-Hexan gegeben, wobei 1,15" g P-1894B als rohes Pulver ausgefällt wurden. Dieses rohe Pulver wurde in Chloroform-Toluol (1:1) gelöst. Die^Eösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und gekühlt. Hierbei wurden etwa 920 mg gelb-orangefarbene rohe Kristalle erhalten. Die rohen Kristalle wurden aus Diäthylätherlösung umkristallisiert, wobei etwa 66Ο mg P-1894B als orange-gelbe Kristalle gewonnen wurden.

Beispiel 2 _

Streptomyces albogriseolüs subsp.Nr. 1894 (ATCC 31423, IFO 13882) wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise kultiviert. Etwa 80 1 des erhaltenen Kulturmediums

wurden in einer Sharples-Zentrifuge (Sharpies Corporation, USA) zentrifugiert, um die Zellen und andere Feststoffe zu entfernen. Etwa 70 1 (pH 8,3) des erhaltenen Überstandes wurden zweimal mit je 25 1 Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegossen und zweimal ^ mit 10 1 wässriger Salzsäure (pH 3,0) und zweimal mit , ■ 15 1 Wasser extrahiert. Der gewaschene Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Zu 80 ml Konzentrat [ wurden 500 nrl η-Hexan gegeben, wobei die aktive Substanz ! als Öl ausgefällt wurde. Die Fällung wurde isoliert, in , :_ einer geringen Menge Chloroform gelöst und durch eine ',

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■ ν . _ 27 —

Säule (3,5 χ 31 cm) einer mit Chloroform vorbehandelten ; Kieselsäure geleitet. Die mit 1 1 Chloroform austretende ; Fraktion wurde verworfen und die Säule mit Chloroform-Äthylacetat (l:i) weiter eluiert. Die P-1894B-Fraktionen wurden zusammengegossen (500 ml), unter vermindertem ; Druck eingeengt und in der vorstehend beschriebenen Weise

erneut chromatographiert. Die aktiven Fraktionen wurden ; zusammengegeben, wobei 300 mg trockenes Pulver erhalten j wurden. Das Pulver wurde auf die in Beispiel 1 beschrie-10 bene Weise umkristallisiert, wobei 80 mg P-1894B in j Form von orange—gelben Kristallen erhalten wurden.

"■- Beispiel 3 ^

Streptomyces albogriseolus Nr.1953 wurde zur Beimpfung ! von zwei 2 1-Sakaguchikolben verwendet, die 300 ml eines : 15 flüssigen Nährmediums (pH 7,0) der folgenden Zusammensetzung enthielten: '2% Glucose, 1% Glycerin, 0,5% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Maisquellwasser, 0,3% Polypepton, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Calciumcarbonat. Jeder beimpfte Kolben wurde auf einer hin- und hergehenden j 20 Schüttelvorrichtung 3 Tage bei 28°C bebrütet, wobei 1 1 : Kulturmedium erhalten wurde. Diese Kultur wurde in einen 50 1-Fermenter überführt, der 30 1 eines flüssigen Mediums (pH 7,2) der folgenden Zusammensetzung enthielt: 5% Dextrin, 3% rohes Sojabohnenmehl, 0,5% Polypepton, j 0,001% EisendD-sulfat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Mangansulfat, 0,05% Dikaliumphosphat und 0,5% Calciumcarbonat. Die Kultivierung wurde 3 Tage bei 28°C unter ■ Belüftung und Rühren durchgeführt. Etwa 26 1 des erhal- ; tenen Kulturmediums wurden mit einer Filterpresse fil- J triert. Das Filtrat wurde mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt und zweimal mit je 10 1 Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und mit 10 1 Wasser gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt, und 50 ml des Konzentrats wurden durch eine Säule (3 χ 43 cm) von 130 g Kieselsäure geleitet.

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- - 28 - ..■""■.

Die Elution wurde mit Äthylacetat durchgeführt. Das aktive Eluat in einer Menge von 750 ml wurde unter vermindertem Druck eingeengt. 30 ml Konzentrat wurden durch eine Säule (3 χ 36 cm) von 110 g Kieselsäure geleitet. Die mit 400 ml Chloroform austretende, die Verunreinigungen enthaltende Fraktion wurde verworfen. Die aktive Verbindung wurde dann mit Chloroform-Äthylacetat (4:.l) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen und zur Trockene eingedampft. Das Konzentrat wurde in

■10 einer geringen Menge Chloroform gelöst und in der gleichen Weise wie bei der zweiten Chromatographie erneut chromatographiert. Die hierbei erhaltenen aktiven Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und mit η-Hexan verdünnt, wobei etwa 210 mg eines rohen Pulvers ausgefällt wurden. Das Pulver wurde aus Toluol umkristallisiert.

! Hierbei wurden 100 mg P-1894B in Form von orangeroten

j Kristallen erhalten.

Beispiel 4 .. '■

Einige typische Formulierungen von P-1894B für die Pro- ! 20 phylaxe und Behandlung der Organfibrose sind nachstehend j genannt.

A. Tabletten ^!

j - j

5 mg P-1894B, 47 mg Lactose, 40 mg Maisstärke, 12 mg Hydroxypropylcellulose-L und 1 mg Magnesiumstearat werden! gemischt. Das Gemisch wird nach dem üblichen pharmazeutischen Verfahren (Naßgranulierung) tablettiert.

B.Kapseln '

1) P-1894B

2) Lactose

30 3) Maisstärke

4) Magnesiumstearat

Gesamtmenge (pro Kapsel) 200 mg

5	mg
130	mg
60	mg
5	mg

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■ ■ - .2S « ■ .

Die genannten Mengen der Bestandteile (I),"(2),. (3) und die Hälfte der genannten Menge des Bestandteils (4) werden gemischt und granuliert. Dann wird der Rest des Bestandteils (4) dem Granulat zugesetzt und das Gesamtpräparat in eine Gelatinekapsel Nr.2 (Japanese Pharmacopeia, 9...AUflage)' gefüllt.

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^. 30-

L e e rs.el.t e

Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD EiSHOLD FUES VONKREISLER KELLER SELTING WERNER 2931792 PATENTANWÄLTE Dr,-Ing. von Kreislert 1973 Dr.-tng. K. Schönwald, Köln Dr.-lng.-K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Diplr-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln Dr. H-K. Werner, Köln DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF D-5000 KÖLN 1 AvK/Ax 3.8.79 Takeda Chemical Industries, Ltd., 27, DOshomachi 2-chome, Hiqashi-ku, Osaka (Japan) P a ten ta η s prüch e

1) Antifibrotische Substanz P-1894B mit folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

a) Schmelzpunkt 165 bis 172°C;

b) Elementaranalyse: 62,62 +_ 1,0% C, 6,28 _+ 0,5% H,

30,06 +_ 1,0% O;

c) Molekulargewicht etwa 1000 (bestimmt durch Dampfdruckosmoraetrie mit Äthylacetat als Lösungsmittel);

d) Spezifische Drehung: /öJq⁵- +155 ^ 15° (c = 0,419, Methanol);

e) Farbreaktionen: positive Reaktion mit Naphthoresorcin-Schwefelsäure und alkoholischem Magnesiumacetat, negative Reaktion mit Ninhydrin und negative Barton -Reaktion;

f) Löslichkeit: leicht löslich oder löslich in Chloroform, Dioxan, Äthylacetat, Dimethylsulfoxid, Aceton, Methyläthylketon, Pyridin, Methanol, Äthanol, Benzol, Toluol. Diäthyläther und O,ln-

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Telefon: (0221) 131041 · Telex: 8882307 dopo d · Telparnmm: Dompatent Köln

NaOH; schwerlöslich oder unlöslich in Wasser, 0,In-HCl, Petroläther, η-Hexan und Cyclohexan;

g) Absorptionen im UV-Bereich und sichtbaren Bereich des Spektrums: Wellenlängen (nm) mit Absorptionsmaxima unmittelbar nach Auflösung in den folgenden Lösungsmitteln:

Lösungsmittel Wellenlängen

90%iges wässriges Methanol: 218^2, 318+2, 440+2

0,ln-HCl-90%iges wässriges

Methanol: 218^2, 318+2, 435^2

0,ln-Na0H-90%iges wässriges

Methanol: 228^2,- 282_+2, 530^2

h) Absorptionen im Infrarotbereich des Spektrums: Hauptwellenzahlen, die, bestimmt nach der Kaliumbromidmethode, Absorptionsmaxima ergeben: ~__ 3430, 2980, 2950, 1740, 1705, 1645, 1570, 1440, 1380, 1290, 1120, 1100, 1080, 1040, lÖlO, 970 cm"¹

i) allgemeine Eigenschaften und Aussehen: schwach sauer, Kristalle orangegelb bis orangerot.

2) Verfahren zur Herstellung der antifibrotischen Substanz P-1894B, dadurch gekennzeichnet, daß man einen P-1894B bildenden Mikroorganismus, der zur Gattung Streptomyces gehört, in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis P-1894B im Kulturmedium angehäuft worden ist, und das P-1894B aus dem Kulturmedium isoliert.

3) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces alhogriseolus subsp. ist.

4) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces albogriseolus subsp.

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5) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus albogriseölus subsp. Nr.1894 (ATCC 31422, IFO 13881), seine Varianten oder Mutanten verwendet.

6) Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,, daß man als Mikroorganismus Streptomyces albogriseölus Nr.1953 (ATCC 31423, IFO 13882), seine Varianten oder Mutanten verwendet. -

7) Eine im wesentlichen reine Kultur des zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus mit den Merkmalen, die mit denen von ATCC-31422 oder AT.CC-31423 identifizierbar sind, wobei die Kultur in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und verwertbare Stickstoffquellen enthält, eine gewinnbare Menge der antifibrotischen Substanz P-1894B zu bilden vermag.

8) Arzneimittelzubereitung für die Prophylaxe oder Therapie der auf übermäßig s-tarke Vermehrung von Kollagen bei Säugetieren zurückzuführenden Fibröse, enthaltend eine wirksame Menge der antifibrotischen Substanz P-1894B.

9) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fiorose Leberzirrhose ist.

10) Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 8 und 9 in Form von Pulvern, Granulat, Tabletten, Kapseln und Injektionslösungen.

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