DE2954566C2 - - Google Patents

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DE2954566C2
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Hisayoshi Kyoto Jp Okazaki
Tsuneo Takatsuki Osaka Jp Kanamaru
Kazuhiko Ikeda Osaka Jp Ohta
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    • C12P1/00Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
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Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung der antifibrotischen Substanz mit der Bezeichnung P-1894B für die Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase und die Kollagen­ biosynthese.
Die Protokollagenprolinhydroxylase ist ein Enzym, das den Prolinrest des durch Ribosom in Warmblüterzellen synthetisierten Protokollagens spezifisch hydroxyliert und einer der wichtigen geschwindigkeitsbegrenzenden Faktoren bei der Biosynthese von Kollagen ist. Als Inhibitoren dieser enzymatischen Aktivität sind Eisen­ chelatbildner (z. B. α, α′-Dipyridyl), SH-Enzyminhibitoren (z. B. p-Chlorquecksilberbenzoat, gewisse Schwermetalle (z. B. Cu++ und Zn++) usw. bekannt. Diese Substanzen verursachen jedoch ernste Nebenwirkungen bei Warmblü­ tern und können nicht als Arzneimittel verwendet werden, da sie stets die Biosynthese sowohl von Kollagen als auch von nichtkollagenen Proteinen nichtspezifisch hemmen. Es war offensichtlich, daß, wenn eine Substanz gefunden würde, die die Biosynthese von nichtkollagenem Protein nicht hemmen, sondern die Kollagenbiosynthese allein spezifisch hemmen würde, diese Substanz erfolg­ reich für die Prophylaxe und Therapie von Krankheiten einschließlich verschiedener Formen der Organfibrose, die von einer übermäßig starken Vermehrung von Kollagen begleitet ist, z. B. Arteriosklerose, Leberzirrhose, Keloid, Skleroderma, rheumatische Arthritis, Lungen­ fibrose usw., verwendet werden könnte.
Von der Anmelderin wurden zahlreiche Metaboliten von Mikroorganismen auf ihre Hemmwirkung auf die Proto­ kollagenprolinhydroxylase untersucht. Hierbei wurde die antifibrotische Substanz P-1894B gefunden, die die Kollagenbiosynthese spezifisch hemmt. (Diese Substanz wird nachstehend zuweilen kurz als P-1894B bezeichnet.) Der Erfindung liegen die vorstehenden Feststellungen zu Grunde.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Substanz P-1894B = OS-4742A₁ der Strukturformel
bei der Prophylaxe oder Therapie der auf übermäßig starke Vermehrung von Kollagen bei Säugetieren zu­ rückzuführenden Fibrose, besonders der Leberzirrhose.
Die obige Strukturformel (1) wurde nach dem Prioritäts­ datum der vorliegenden Erfindung durch Röntgenstruktur­ analyse ermittelt (vgl. Journal of The Chemical Society, Chemical Communications S. 154-155, 4, 1981).
Die Substanz P-1894B kann, wofür jedoch in vorliegendem Patent kein Schutz beantragt wird, durch Züchten von Streptomyces albogriseolus subsp. JFO 13881 oder Streptomyces albogriseolus JFO 13882 in einem Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine verwertbare Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen und Isolieren aus dem Kulturmedium, erhalten werden.
Biologische Eigenschaften I) Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase
Die Bestimmung der Hemmwirkung wurde nach der Methode von R. E. Rhoads und Mitarbeitern (Methods in Enzymology XVIIB (1979) 306) unter Verwendung eines teilweise gereinigten Enzympräparats, das aus Hühnerembryos nach der Methode von K. I. Kivirriko und Mitarbeitern und J. Halme und Mitarbeitern (J. Biol. Chem. 242 (1967) 4007 und Biochim. Biophys. Acta 198 (1967) 460) erhalten worden war, und von (Pro-Pro-Gly)₅ · 4 H₂O als Substrat (hergestellt von Tanpakushitsu Kenky Shrei Kai (Protein Research Foundation) Osaka) durchgeführt. Die Bestimmung ergab, daß die Konzentration von P-1894B, die für eine 50%ige Hemmung von 100 µg (als Protein) des teilweise gereinigten Enzyms erforderlich war, etwa 7 µg/ ml betrug.
II) Hemmwirkung auf die Biosynthese von Kollagen
Grundlegend nach der von R. A. Salvador und Mitarbeitern beschriebenen Methode (Arch. Biochem. Biophys. 174 (1976) 382) wurden 0,3 mg/kg Sprague-Dawley-Ratten (weiblich, 3 Wochen alt) intraperitoneal einmal täglich für eine Dauer von 6 Tagen verabreicht. Die Mengen von Kollagen und nicht-kollagenen Proteinen in den Uteri wurden mit den Zahlen für Kontrolltiere verglichen. Wie die Ergeb­ nisse in Tabelle 7 zeigen, hemmte P-1894B die Biosyn­ these von Kollagen spezifisch und stark.
Tabelle 7
III) Wirkung von P-1894B auf die Biosynthese von Kollagen bei mit Tetrachlorkohlenstoff ausgelöster Leberzirrhose
Weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 110 g wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Die Gruppe I (Kontrolle) erhielt Kochsalzlösung (1 ml/Ratte), während die Gruppen II, III und IV ein Gemisch von 10% CCl₄ und Olivenöl (1 ml/Ratte) zweimal wöchentlich in insgesamt 8 Dosen intraperitoneal erhielten. Die Gruppen III und IV erhielten 4 Wochen P-1894B oral mit dem Futter. Die durchschnittliche Dosis von P-1894B betrug bei der Gruppe III 3,25 und bei der Gruppe IV 6,16 mg/kg pro Tag. Die Ratten wurden einen Tag nach der letzten Injektion getötet. Die Leber wurde für die Bestimmungen unmittelbar entnommen.
Bestimmung der Protokollagenprolinhydroxylase-Aktivität
Ein 10%iges Homogenat der Leber wurde in 20 mMol Tris- HCl-Puffer, pH 7,5, der 0,2 Mol NaCl, 0,1 Mol Glycin, 5 × 10-5 Mol 1,4-Dithiothreitol und 0,1% Polyäthylen­ glykol-p-Isooctylphenyläther ("Triton X-100") enthielt, unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators herge­ stellt. Das Homogenat wurde 20 Minuten bei 15000 g zentrifugiert. Am klaren Überstand wurde die Prolin­ hydroxylaseaktivität nach der Methode von Hutton und Mitarbeitern (Anal. Biochem. 16 (1966) 384-394) bestimmt. Der Proteingehalt des Homogenats wurde nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern (J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard ermittelt.
Bestimmung des Hydroxyprolingehalts
Der Hydroxyprolingehalt der Leber wurde in einem 6n-HCl- Hydrolysat (110°C, 22 Stunden) nach der Methode von Blumenkrantz und Mitarbeitern (Anal. Biochem. 63 (1975) 331-340) bestimmt.
Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, daß nach der Behand­ lung mit P-1894B (6,16 mg/kg pro Tag, p. o.) die spezi­ fische Aktivität der Protokollagenprolinhydroxylase und der Hydroxyprolingehalt in der Leber im Vergleich zu der Leber von mit CCl₄ fibrotisch gemachten Ratten, die kein P-1894B erhalten hatten, stark reduziert waren.
Tabelle 8
Einfluß von P-1894B auf die Protokollagenprolinhydroxylase-Aktivität und den Hydroxyprolingehalt der Leber
IV) Akute Toxizität: LD₅₀, 50 ∼ 100 mg/kg (Maus, intra­ peritoneal)
Wie bereits erwähnt, ist P-1894B eine neue Substanz mit Hemmwirkung auf die Protokollagenprolinhydroxylase und selektiver Hemmwirkung auf die Biosynthese von Kollagen und daher wertvoll beispielsweise als biochemisches Reagenz oder Inhibitor der Gewebefibrose bei Warmblütern.
Als Inhibitor der Fibrose von tierischem Gewebe kann P-1894B für die Prophylaxe und Therapie der Organfibrose bei Tieren, insbesondere bei Säugetieren (Laboratoriums­ tiere wie Kaninchen, Ratte und Maus, Haustiere wie Hund und Katze) und Menschen verwendet werden. Die Organ­ fibrose ist ein Sammelbegriff, der die verschiedenen Krankheiten bezeichnet, die durch übermäßig starke Ver­ mehrung von Kollagen entstehen, und umfaßt Krankheiten wie Lungenfibrose, Leberzirrhose, Nephtosklerose, Arte­ riosklerose, Skleroderma, Myelofibrose, chronische Arthritis usw. (Hotchi: Naika (Internal Medicine) 41 (1978) 724).
Für die Verwendung zur Prophylaxe oder Therapie von Organfibrosen kann P-1894B oral oder in anderer Weise entweder als solches oder in Kombination mit geeigneten pharmakologisch unbedenklichen Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln in Arzneiformen wie Pulver, Granulat, Tabletten, Kapseln und Injektionslösungen verabreicht werden. Die Dosis hängt von der zu bekämpfen­ den Krankheit, vom Zustand, vom Empfänger, vom Darrei­ chungsweg und anderen Faktoren ab. Für die Prophylaxe oder Therapie der Leberzirrhose, Arteriosklerose oder chronischen Arthritis bei Erwachsenen wird die Substanz beispielsweise zweckmäßig oral in einer Tagesdosis von etwa 2 bis 50 mg in einer Einzelgabe oder unterteilt in bis zu drei Gaben verabreicht.
Beispiel
Einige typische Formulierungen von P-1894B für die Pro­ phylaxe und Behandlung der Organfibrose sind nachstehend genannt.
A. Tabletten
5 mg P-1894B, 47 mg Lactose, 40 mg Maisstärke, 12 mg Hydroxypropylcellulose-L und 1 mg Magnesiumstearat werden gemischt. Das Gemisch wird nach dem üblichen pharmazeu­ tischen Verfahren (Naßgranulierung) tablettiert.
B. Kapseln
1) P-1894B|5 mg
2) Lactose 130 mg
3) Maisstärke 60 mg
4) Magnesiumstearat 5 mg
Gesamtmenge (pro Kapsel) 200 mg
Die genannten Mengen der Bestandteile (1), (2), (3) und die Hälfte der genannten Menge des Bestandteils (4) werden gemischt und granuliert. Dann wird der Rest des Bestandteils (4) dem Granulat zugesetzt und das Gesamt­ präparat in eine Gelatinekapsel Nr. 2 (Japanese Pharma­ copeia, 9. Auflage) gefüllt.

Claims (1)

  1. Verwendung der Substanz P-1894B = OS-4742A₁ der Strukturformel bei der Prophylaxe oder Therapie der auf übermäßig starke Vermehrung von Kollagen bei Säugetieren zu­ rückzuführenden Fibrose, besonders der Leberzirrhose.
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