CH646059A5 - Compositions antibiotiques contenant un macrolide et un aminoheteroside. - Google Patents

Description

Cette invention concerne certaines nouvelles combinaisons d'antibiotiques de types macrolide et aminohétêroside, qui se sont révélées être particulièrement efficaces dans le traitement de la colibracil-lose chez les porcs et qui sont également intéressantes comme agents de promotion de la croissance et pour l'amélioration de l'utilisation des aliments chez cette espèce. Elles ont également un intérêt dans la lutte contre le développement des mycoplasmes dans les cultures de tissus de mammifère.

Les antibiotiques de types macrolide et aminohétêroside constituant les compositions sont bien connus. La tylosine, décrite dans le brevet des E.U.A. N° 3178341, «Merck Index», 9e édition, N° 9486, est vendue dans le commerce comme antibiotique vétérinaire; la spiramycine est décrite dans le brevet des E.U.A. N° 2943023, «Merck Index», 9e édition, N° 8525; la leucomycine est décrite dans le «Merck Index», 9e édition, N° 5307; la magnamycine est décrite dans le brevet des E.U.A. N° 2960438 et dans le «Merck Index», 9e édition, N° 1812, et l'oléandomycine est décrite dans les brevets des E.U.A. Nos 2757123 et 2842481 et dans le «Merck Index», 9e édition, N° 6671.

Les antibiotiques de type aminohétéroside, la tobramycine et l'apramycine, sont également appelés respectivement facteurs 2 et 6 de la nébramycine. La tobramycine, l'apramycine et le facteur 5 de la nébramycine sont les éléments du complexe antibiotique de nébramycine produit par Streptomyces tennibrarius et sont décrits dans le brevet des E.U.A. N° 3691279. La tobramycine est utilisée clinique-ment en médecine humaine. La néomycine est décrite dans le brevet des E.U.A. N° 2799620, tandis que la gentamycine est décrite dans le brevet des E.U.A. N° 3091572 et dans le «Merck Index», 9e édition, N° 4223.

Selon la présente invention, il est fourni une composition antibiotique comprenant un antibiotique de type macrolide choisi dans le groupe comprenant la tylosine, la leucomycine, la magnamycine, la spiromycine et l'oléandomycine ou un de leurs sels physiologiquement acceptables, et un antibiotique de type aminohétêroside choisi dans le groupe comprenant la tobramycine, l'apramycine, le facteur 5 de la nébramycine, la gentamycine et la néomycine ou un de leurs sels physiologiquement acceptables.

Les compositions antibiotiques de cette invention sont utilisables pour lutter contre les mycoplasmas et, en particulier, contre ceux qui sont résistants aux antibiotiques constituant la composition. Le sy-nergisme des compositions a été démontré dans les cultures de tissus de mammifère où les mycoplasmas sont fréquents et constituent souvent des contaminants non détectés. La contamination par des mycoplasmas de préparations de cultures de tissus de diverses lignées cellulaires, par exemple dans la propagation des virus animaux, peut ruiner la préparation de culture et, dans certains cas, après maintien de la culture pendant plusieurs semaines. L'activité synergique des compositions de cette invention est démontrée pour le mieux vis-à-vis de mycoplasmas résistants dans les cultures de tissus de mammifère. L'expression mycoplasma résistant, telle qu'utilisée ici, désigne les mycoplasmas qui sont résistants tant aux antibiotiques de type macrolide qu'aux antibiotiques de type aminohétéroside constituant les compositions de cette invention à des concentrations inhibitrices minimales supérieures à celles généralement observées avec les antibiotiques vis-à-vis de divers micro-organismes. Un certain nombre de mycoplasmas sont résistants aux antibiotiques constituant les compositions de cette invention. Parmi les contaminants mycoplasmas résistants dans les préparations de cultures de tissus de mammifère, on trouve principalement les souches de M. hyorhinis. On trouve également, comme contaminants fréquents, des souches résistantes de M. gallisepticum. Les compositions synergiques de cette invention inhibent la croissance des micro-organismes mycoplasmas résistants à de faibles concentrations quand les antibiotiques seuls sont inefficaces à concentrations élevées. Le tableau 1 indique les concentrations inhibitrices minimales (CIM) en microgrammes par millilitre pour les différents antibiotiques de type macrolide et de type aminohétéroside et pour leurs combinaisons. Les CIM sont obtenues avec des cultures de tissus de mammifère contaminées par les mycoplasmas indiqués dans des expériences effectuées comme suit.

On inocule des suspensions de cellules de rein de singe, LLC-MK2, dans le milieu 199 (Morgan et al., «Proc. Soc. Exp. Bio. Med.», 73,1, 1950), avec des cultures des mycoplasmas indiqués pour obtenir une concentration d'inoculum de 1,5 x 107 organismes par millilitre de suspension de cellules. On fait incuber à 37° C pendant 3 à 5 d des cultures témoins et des cultures contenant les mycoplasmas dans chaque essai. Après incubation, on change le milieu de toutes les cultures pour 1% de sérum de cheval dans le milieu 199 contenant 1,68 g de bicarbonate de sodium par litre. Puis on traite les cultures de tissus inoculées par le mycoplasma (à l'exception des cultures témoins contenant des mycoplasmas) par les antibiotiques indiqués seuls ou par la combinaison d'antibiotiques indiquée dans le tableau 1. Quand on teste des combinaisons d'antibiotiques, on utilise des quantités égales des antibiotiques.

On prépare des solutions des antibiotiques dans le milieu 199 contenant 1,68 g de bicarbonate de sodium par litre de milieu. On filtre les solutions pour les stériliser sur un filtre Millipore ayant une porosité de 0,2 |j. et on les conserve à 4°C avant de les utiliser. On prépare des doubles dilutions des solutions antibiotiques et on ajoute chaque solution antibiotique à des cultures séparées pour déterminer la concentration inhibitrice minimale. On change le milieu de chaque culture deux fois par semaine, une solution fraîche d'antibiotiques à la même concentration étant ajoutée à chaque changement de milieu. Au bout de deux semaines, on change les milieux sans antibiotique pendant deux semaines supplémentaires. On prélève des échantillons des cultures avant chaque changement de milieu dans les deux dernière semaines et on les cultive pour déterminer la présence des mycoplasmas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

646 059

Tableau 1 :

CIM des antibiotiques vis-à-vis des mycoplasmas dans des cultures de tissu LLC-MK2

Antibiotique1

Mycoplasma

CIM

(Hg/ml)

Tylosine

M. hyorhinis HH2

>250

Tobramycine

M. hyorhinis HH2

62,5

Combinaison

M. hyorhinis HH2

<15,6

Tylosine

M. hyorhinis

100

Tobramycine

M. hyorhinis

100

Combinaison

M. hyorhinis

3

Tylosine

M. hyorhinis HEK3

>200

Tobramycine

M. hyorhinis HEK3

>500

Combinaison

M. hyorhinis HEK3

3,1

Tartrate de tylosine

M. hyorhinis HH

200

Sulfate de tobramycine

M. hyorhinis HH

200

Combinaison

M. hyorhinis HH

1,5

Tartrate de tylosine

M. gallisepticum 36 F4

>800

Tobramycine

M. gallisepticum 36 F4

100

Combinaison

M. gallisepticum 36 F4

25

Tylosine

M. gallisepticum

800

41313s

Tobramycine

M. gallisepticum

200

413135

Combinaison

M. gallisepticum

12,5

Tylosine

L3F12F7 de porc6

200

Tobramycine

L3F12F7 de porc6

50

Combinaison

L3F12F7 de porc6

<1,5

Tylosine

M. hyorhinis HH

200

Apramycine

M. hyorhinis HH

600

Combinaison

M. hyorhinis HH

12

Tylosine

M. hyorhinis

400

Gentamycine

M. hyorhinis

100

Combinaison

M. hyorhinis

0,78

Tylosine

M. hyorhinis HH

>800

Facteur 5 de la

nébramycine

M. hyorhinis HH

200

Combinaison

M. hyorhinis HH

25

Tylosine

M. hyorhinis

200

Néomycine

M. hyorhinis

100

Combinaison

M. hyorhinis

6,3

Spiramycine

M. hyorhinis HH

>800

Tobramycine

M. hyorhinis HH

200

Combinaison

M. hyorhinis HH

1,5

Magnamycine

M. hyorhinis HH

>800

Tobramycine

M. hyorhinis HH

200

Combinaison

M. hyorhinis HH

1,5

Leucomycine

M. hyorhinis HH

>400

Tobramycine

M. hyorhinis HH

200

Combinaison

M. hyorhinis HH

0,78

Oléandomycine

M. hyorhinis HH

400

Tobramycine

M. hyorhinis HH

200

Combinaison

M. hyorhinis HH

100

1 Les combinaisons des antibiotiques indiqués contiennent des quantités égales de chaque antibiotique.

2 M. hyorhinis HH est un isolât de tissu de cœur humain.

3 M. hyorhinis HEK est un isolât de tissu de rein d'embryon humain.

4 M. gallisepticum 36F est une souche de mycoplasma de poulet.

5 M. gallisepticum 41313 est une souche d'un mycoplasma de poulet.

6 L3F12F7 de porc est un mycoplasma isolé d'un porc et, d'après ses caractéristiques, apparaît être Mycoplasma arginini.

Comme il est indiqué dans le tableau 1, les mycoplasmas utilisés dans cet essai sont détruits seulement à des concentrations élevées des antibiotiques seuls. Cependant, quand on utilise l'une des compositions macrolide/aminohétéroside de cette invention, les mycoplasmas sont détruits à des concentrations nettement réduites. Dans chaque combinaison, les antibiotiques sont présents en parties égales.

Les compositions de cette invention sont non toxiques vis-à-vis du tissu des mammifères et peuvent être utilisées pour maintenir des lignées de cellules exemptes de contamination par des mycoplasmas. Les compositions peuvent également être utilisées avec d'autres antibiotiques couramment utilisés dans des cultures de tissus pour empêcher la contamination bactérienne, mais qui ne permettent pas de lutter contre les mycoplasmas. Par exemple, les compositions synergiques peuvent être utilisées avec une pénicilline comme la pénicilline G ou avec la streptomycine, deux antibiotiques couramment utilisés dans des cultures de tissus.

Une composition préférée de cette invention est la composition tylosine/tobramycine. Cette composition présente, de façon suivie, de faibles concentrations inhibitrices minimales vis-à-vis des mycoplasmas que la tylosine ou la tobramycine seules ne détruisent qu'à des concentrations inhibitrices minimales élevées. Le tableau 2 suivant contient les résultats obtenus avec de nombreuses combinaisons de tylosine et de tobramycine qui inhibent la croissance de M. hyorhinis dans des préparations de cultures de tissus utilisant des cellules de rein de signe LLC-MK2. Les essais sont effectués de la manière suivante.

On inocule des cultures de tissus de cellules LLC-MK2 avec une culture de M. hyorhinis 5 d avant l'addition des combinaisons de tylosine/tobramycine contenant des proportions diverses des antibiotiques et à diverses concentrations. On effectue des changements de milieu à des intervalles de 3 à 5 d avec addition des antibiotiques à chaque changement. On prélève des échantillons des milieux de culture à chaque changement de milieu et on détermine la présence des mycoplasmas. Les résultats du tableau 2 illustrent diverses proportions des antibiotiques dans des compositions qui inhibent la croissance de M. hyorhinis.

Tableau 2:

Inhibition de M. hyorhinis dans des cultures de tissus de LLC-MK2 par des compositions tylosine/tobramycine

Tobramycine (|i/ml) +

Tylosine

(Hg/ml)

12

1

6

1

3

1

2 "

2

1

6

0,5

12

Toutes les combinaisons de tylosine et de tobramycine indiquées dans le tableau 2 inhibent la croissance de mycoplasmas pour de cinq à huit échantillonnages couvrant une période de trois semaines et demie. Quand on les utilise seules, la tylosine et la tobramycine présentent des CIM nettement supérieures, comme indiqué dans le tableau 1.

Les résultats du tableau 2 montrent les faibles concentrations auxquelles les compositions antibiotiques de cette invention sont efficaces sur le plan synergique. Des compositions contenant de une partie de tobramycine ou plus à trois parties de tylosine ou plus en poids sont des compositions synergiques préférées.

Une autre composition préférée de cette invention comprend la tylosine en combinaison avec l'apramycine. Comme il est indiqué dans le tableau 1, une solution contenant 12 (ig/ml de tylosine et 12 |ig/ml d'apramycine inhibe les mycoplasmas, tandis que la CIM

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

646059

4

pour l'apramycine seule est de 600 ng/ml et celle de la tylosine seule est de 200 fig/ml.

Une autre composition préférée comprend la tylosine en combinaison avec la gentamycine.

Au contraire du synergisme démontré par les compositions antibiotiques de type macrolide-antibiotique de type aminohétéroside de cette invention, un certain nombre de combinaisons d'antibiotiques de type macrolide et de type aminohétéroside présentent peu sinon pas d'activité améliorée dans la lutte contre les mycoplasmas dans des cultures de tissus.

Les antibiotiques de type macrolide et de type aminohétéroside formant les compositions synergiques peuvent être sous forme de base libre ou sous la forme d'un sel d'addition d'acide approprié. Ces antibiotiques forment des sels avec les acides minéraux et les acides carboxyliques. Des exemples de ces sels sont le chlorhydrate de tylosine, le tartrate de tylosine, le phosphate de tylosine, l'adipate de spiramycine, le chlorhydrate de spiramycine, le chlorhydrate d'oléandomycine, le bromhydrate de leucomycine, le tartrate de magnamycine, le sulfate de tobramycine, le chlorhydrate d'apramy-cine, le sulfate de néomycine, le chlorhydrate de néomycine, le chlorhydrate de gentamycine et le sulfate de gentamycine.

Les compositions antibiotiques de cette invention peuvent être préparées en mélangeant les antibiotiques sous forme de poudres sèches de la base libre ou d'un de ses sels, ou bien on peut mélanger des solutions des antibiotiques ayant la concentration appropriée pour obtenir une solution des deux antibiotiques ayant la concentration désirée. Les différents antibiotiques sont solubles de façon appréciable dans les milieux aqueux et l'on utilise, de préférence, des solutions des compositions dans le milieu de culture du tissu aqueux pour lutter contre la contamination des cultures de tissus de mammifères par les mycoplasmas.

Les compositions antibiotiques synergiques de cette invention peuvent être utilisées pour inhiber la croissance des mycoplasmas dans une grande variété de tissus mammifères et pour empêcher ainsi leur contamination et leur perte. Par exemple, une composition de l'invention peut être utilisée dans les cultures de tissus de mammifère utilisées dans la préparation des activateurs de plasminogène, selon le procédé décrit dans le brevet des E.U.A. N° 3904480.

Les compositions antibiotiques de cette invention comprennent les composés, de préférence dans un rapport pondéral de l'antibiotique de type macrolide à l'antibiotique de type aminohétéroside de

15:1 à 1:15. Un rapport pondéral préféré du macrolide à l'amino-hétéroside est de 3:1 à 1:3.

Une composition antibiotique préférée de cette invention, la tylosine en combinaison avec l'apramycine, est également utilisable 5 pour améliorer la croissance chez des porcs sevrés. La combinaison tylosine/aramycine présente une utilisation de l'alimentation supérieure et des gains de poids supérieurs chez les porcs sevrés que ne le fait l'un ou l'autre antibiotique quand il est administré seul. L'efficacité de la combinaison tylosine/apramycine pour améliorer l'utilisa-îo tion des aliments et pour améliorer le gain de poids chez des porcs sevrés a été déterminée par des essais sur animaux effectués comme suit.

Les essais sont effectués en enclos avec 6 porcs par enclos pendant 28 d. Les porcs sont des deux sexes et ont un poids corporel îs initial moyen de 12,89 kg et un âge moyen de 6 semaines. Les animaux reçoivent de l'eau avant et après la nourriture. Les animaux sont nourris deux fois par jour avec un aliment ayant la composition suivante.

Ingrédient

%

Blé

21

Orge

23,5

Maïs

20

Farine de poisson

2,5

Levure

1

Son de blé

10

Luzerne

2,5

Farine de soja

14

Enveloppes d'avoine

1,8

Phosphate de calcium

1

Carbonate de calcium

1,1

Chlorure de sodium

0,1

Prémélange SV12

1

Prémélange S04

0,5

On compare dans les essais la combinaison tylosine/apramycine avec la tylosine seule et avec l'apramycine seule. Les antibiotiques et leur combinaison sont administrés dans l'alimentation de l'animal à une dose de 100 ppm et, dans le cas de la combinaison, à une dose de 100 ppm pour chaque antibiotique.

40 Les résultats combinés de deux essais similaires sont indiqués dans le tableau 3.

Tableau 3:

Gain de poids et utilisation de l'alimentation comparatifs chez des porcs traités par de la tylosine, de l'apramycine et la combinaison apramycinejtylosine

Traitement

Témoin négatif

Tylosine

Apramycine

Tylosine/ apramycine

Concentration dans l'alimentation (ppm)

100

100

100-100

Nombre d'animaux n

70

71

72

72

Nombre de duplications n

12

12

12

12

Poids initial

X

13,11

13,03

12,55

12,85

(kg) par animal

±s

0,81

1,04

0,58

0,71

V

6

8

5

6

(Rei)

(110)

(99)

(96)

(98)

Poids final

X

25,00

25,58

25,62

26,71

(kg) par animal

±s

1,48

1,65

1,14

1,49

V

6

6

4

6

(Rei)

(100)

(102)

(102)

(107)

Gain quotidien

X

425

449

467

495

(g) par animal

±s

40

62

38

44

V

9

14

8

9

(Rei)

(100)

(106)

(110)

(116)

Prise d'aliment quotidienne

X

0,92

0,92

0,92

0,94

(kg) par animal

±s

0,06

0,06

0,04

0,05

V

7

6

4

5

(Rei)

(100)

(100)

(100)

(102)

5

Tableau 3: (suite)

646059

Dans le tableau 3, les symboles statistiques ont les significations suivantes: x = moyenne; ±s = écart type; v = coefficient de variances, et (Rei) = traitements de comparaison vis-à-vis des témoins négatifs en pourcentage.

Traitement

Témoin négatif

Tylosine

Apramycine

Tylosine/ apramycine

Efficacité de l'alimentation

(kg d'aliment/kg de gain) x

2,14

2,07

1,96

1,90

+ s

0,10

0,17

0,09

0,09

v

4

8

4

5

(Rei)

(100)

(97)

(92)

(89)

Comme indiqué dans le tableau 3, les porcs traités par la combinaison tyosine/apramycine présentent des gains de poids supérieurs et une meilleure efficacité de l'alimentation sur l'essai de 28 d que ne le font les porcs traités par la tylosine seule ou par l'apramycine 20 seule.

Dans un second essai, on démontre l'efficacité de la combinaison tylosine/apramycine dans des études sur des porcs venant d'être sevrés. Les résultats montrent que les porcs traités par la combinaison antibiotique présentent une diminution significativement plus 25 grande de l'incidence des diarrhées dues à E. coli que les porcs traités par l'apramycine seule ou par la tylosine seule. En outre, les porcs traités par les compositions antibiotiques présentent des gains de poids quotidien moyen supérieurs et une efficacité de l'alimentation améliorée supérieure que les porcs traités par l'un ou l'autre antibio- 30 tique seul.

Le tableau 4 présente les résultats obtenus sur une étude de 21 d avec des porcs venant d'être sevrés. La tylosine et l'apramycine sont chacune administrées dans l'alimentation à une dose de 110 ppm. La combinaison antibiotique est de même administrée dans l'alimenta- 35 tion contenant les deux antibiotiques au niveau de 110 ppm. Les résultats sont donnés sous la forme d'un pourcentage d'augmentation par rapport à un groupe témoin non traité, tel que calculé à partir de l'évaluation statistique des données obtenues dans l'étude.

40

Tableau 4:

Augmentation par rapport aux témoins ("%)

Traitement

Gain de poids quotidien moyen

Efficacité de l'alimentation améliorée

Diminution des diarrhées

Apramycine

19,0

10,3

42,8

Tylosine

29,7

11,4

26,4

T ylosine/apramycine

40,6

16,1

48,7

Comme indiqué dans le tableau 4, la tylosine utilisée seule permet d'améliorer l'efficacité de l'alimentation, le gain de poids et 55 permet de réduire l'incidence des diarrhées. L'apramycine, quand elle est utilisée seule, présente de même son efficacité connue dans chaque catégorie. De façon surprenante, l'utilisation des deux antibiotiques en combinaison présente une plus grande amélioration dans chaque catégorie que ne le fait l'utilisation de l'apramycine 60 seule. Comme indiqué précédemment, on ne savait pas que la tylosine était efficace dans le traitement de la colibacillose chez les porcs après sevrage et, en conséquence, la plus grande efficacité de la combinaison tylosine/apramycine par rapport à celle présentée par l'apramycine était inattendue. 65

L'utilisation thérapeutique consiste à administrer à des porcs juste sevrés une quantité efficace sur le plan thérapeutique de tylosine et d'apramycine. La quantité totale des deux antibiotiques ainsi que les quantités relatives de chaque antibiotique que l'on peut administrer peuvent varier. La concentration effective des antibiotiques dans l'aliment de l'animal peut dépendre de facteurs comme l'importance de la maladie, l'âge et le poids des animaux. La concentration des deux antibiotiques pris ensemble dans l'aliment peut être comprise entre 50 et 100 ppm, le rapport pondéral de la tylosine à l'apramycine étant de 5:1 à 1:5. Une concentration généralement utilisable des deux antibiotiques dans l'alimentation est comprise entre 100 et 300 ppm. Une concentration préférée est d'environ 200 ppm, avec un rapport pondéral des antibiotiques de 1:1.

La tylosine et l'apramycine sont des substances basiques qui forment des sels avec les acides minéraux, les acides carboxyliques et les acides sulfoniques, comme les chlorhydrate, sulfate, phosphate, tartrate, citrate, laurylsulfate, hexanoate, benzènesulfonate, etc. La forme sel des antibiotiques ainsi que la forme base libre peuvent être utilisées selon l'invention. Les sels préférés de tylosine sont le tartrate et le phosphate. Les sels préférés d'apramycine sont le sulfate et le chlorhydrate.

La tylosine et l'apramycine peuvent être préparées ensemble dans un prémélange ou dans des prémélanges séparés, pour être mélangées avec l'alimentation finale. Ou bien les deux antibiotiques peuvent être mélangés directement dans l'aliment final.

Les antibiotiques sous forme de base sont solubles de façon appréciable dans l'eau comme le sont les sels des antibiotiques. Les antibiotiques et, de préférence, leurs formes sel peuvent être ajoutés à l'eau de boisson de l'animal pour former des solutions à des concentrations efficaces sur le plan thérapeutique. Comme en ce qui concerne la concentration dans l'aliment pour animal, la concentration de l'antibiotique dans l'eau de boisson peut varier. Des concentrations des deux antibiotiques comprises entre 10 et 500 |ig/ml, avec un rapport pondéral des antibiotiques à 5:1 à 1:5, sont généralement suffisantes pour permettre une lutte et un traitement chez les animaux. Une concentration préférée des antibiotiques dans l'eau de boisson est comprise entre 50 et 300 Hg/ml.

Bien que les compositions antibiotiques de tylosine et d'apramycine soient administrées de la façon la plus commode dans l'aliment ou l'eau de boisson des animaux, les compositions sont également efficaces quand elles sont injectées aux porcs. Pour l'administration par injection, les deux antibiotiques peuvent être préparés avec un diluant approprié acceptable sur le plan pharmaceutique, comme l'eau, le sérum physiologique ou le dextrose physiologique. L'administration de compositions tylosine/apramycine par injection peut être utilisée pour traiter des porcs juste sevrés qui sont trop affaiblis par la maladie pour manger ou consommer une quantité suffisante de l'aliment contenant le médicament. Dans de tels cas, les compositions antibiotiques peuvent être administrées aux porcs par injection quotidienne. Les antibiotiques peuvent également être préparés sous forme posologique appropriée par voie orale, par exemple sous forme de comprimés, de capsules ou de suspensions, et administrés aux porcs qui ne peuvent pas manger une quantité suffisante de l'aliment contenant le médicament.

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6

L'efficacité de la combinaison tylosine/apramycine dans le traitement et la lutte contre la colibacillose est indiquée par les résultats obtenus dans un essai de 21 d sur des porcs juste sevrés. Les porcs sont répartis en fonction de leur poids entre des groupes de traitement et des groupes témoins de 8 porcs. Chaque traitement est attribué de façon aléatoire à trois groupes. Les animaux sont nourris avec un aliment normal à volonté, les groupes de traitement recevant l'aliment contenant 110 ppm de chaque antibiotique. On utilise les gains de poids, l'efficacité de l'alimentation et l'apparition de diarrhée pour mesurer la réaction au traitement. Les résultats 5 obtenus après 21 d sont donnés dans le tableau 5.

Tableau 5:

Traitement de 21 d de porcs juste sevrés par la combinaison tylosine/apramycine

Traitement1

Gain quotidien moyen (kg)

Alimentation quotidienne moyenne (kg)

Efficacité de l'alimentation

Indice de diarrhée2

Témoin

0,23

0,42

1,81

2,84

Apramycine

0,29

0,47

1,64

1,64

Tylosine

0,31

0,51

1,62

2,10

Tylosine/apramycine

0,34

0,51

1,53

1,46

1 Phosphate de tylosine et sulfate d'apramycine à 110 ppm dans l'aliment. Combinaison tylosine/apramycine à 110 ppm de chaque antibiotique dans l'aliment.

2 L'indice de diarrhée est obtenu selon le système suivant en effectuant une notation deux fois par jour pendant les 13 premiers jours et une fois le quatorzième jour.

1. Excréments bien formés, seulement.

2. Excréments bien formés, < 50% non formés.

3. Excréments non formés, > 50% non formés.

4. Excréments non formés seulement.

5. Excréments liquides seulement.

Le dessin annexé représente graphiquement la notation moyenne des diarrhées (selon l'échelle ci-dessus) en fonction du temps exprimé en jours, obtenue dans l'étude précédente. Les notations moyennes obtenues avec le groupe témoin et les groupes traités sont indiquées. 35 Comme indiqué par le graphique des notations moyennes pour le groupe traité par la combinaison tylosine/apramycine, l'incidence de la diarrhée est nettement inférieure à l'incidence pour le groupe traité par l'apramycine seule. Le graphique montre également que la tylosine utilisée seule a la même efficacité en ce qui concerne la ré- - 4Q duction de l'incidence de la diarrhée.

On traite les porcs juste sevrés par la combinaison antibiotique du moment du sevrage jusqu'à trois ou quatre semaines après le sevrage. Dans le cas d'une incidence importante de la maladie, on peut maintenir le traitement plus longtemps si nécessaire. 45

Les données du tableau 4 indiquent les différences de l'incidence des diarrhées entre les groupes traités et le groupe témoin, exprimées en pourcentage de l'incidence sur le groupe témoin.

Les compositions tylosine/apramycine de cette invention présentent une activité synergique vis-à-vis de souches de Pasteurella hemo- 50 lytica. Cet organisme peut provoquer des pneumonies chez le bétail, pneumonies qui, dans le cas d'une infection importante, peuvent amener la mort. On démontre le synergisme de la combinaison tylosine/apramycine, in vitro vis-à-vis de la souche 41D de P. hemolytica. La tylosine seule a une concentration inhibitrice minimale de 55

50 ng/ml et l'apramycine seule a une CIM de 25 Hg/ml. L'activité synergique de la combinaison des deux antibiotiques est déterminée par la méthode de titrage de l'«échiquier». Dans cette méthode, on teste deux antibiotiques dans des dilutions en série et dans toutes les combinaisons de ces dilutions pour trouver les concentrations de 60 chaque antibiotiques, tant seul qu'en combinaison, qui inhibent la croissance du micro-organisme d'essai. La nature de l'interaction entre les deux antibiotiques peut être déterminée de façon algébrique ou géométrique. Dans la méthode algébrique, la concentration de chaque antibiotique dans la combinaison qui inhibe la croissance est 65 exprimée comme une fraction de la concentration qui produit le même effet quand l'antibiotique est utilisé seul. Quand la somme de ces fractions est 1, la combinaison est additive; quand la somme est inférieure à 1, la combinaison est synergique, et quand la somme est supérieure à 1, la combinaison est antagoniste.

On donne ci-dessous les calculs utilisant les données obtenues dans l'essai in vitro de la tylosine, de l'apramycine et de la combinaison des deux antibiotiques vis-à-vis de P. hemolytica.

Tylosine seule: CIM = 50 (xg/ml Apramycine seule: CIM = 25 ng/ml Tylosine/apramycine 25/50 + 0,8/25 = < 1 12,5/50 + 6,25/25 = < 1 6,25/50 + 12,5/25 = < 1 Les compositions antibiotiques suivantes sont les compositions préférées:

Tylosine/tobramycine

Tylosine/apramycine

Tylosine/gentamycine

Leucomycine/tobramycine

Spiromycine/tobramycine

Magnamycine/tobramycine

On préféré particulièrement les compositions tylosine/tobramycine, tylosine/apramycine et tylosine/gentamycine.

Les compositions antibiotiques de cette invention sont intéressantes, comme décrit ci-dessus, en médecine vétérinaire dans le traitement de diverses maladies affectant les animaux. Les compositions sont également intéressantes pour lutter contre la contamination par les mycoplasmas dans la propagation des virus par la méthode de culture sur tissu.

Les exemples suivants illustrent mieux la présente invention.

Exemple 1:

On inocule des suspensions cellulaires de LLC-MK2 (lignée de cellules de rein de singe) dans le milieu 199 contenant 1 % de sérum de cheval dans des flacons de culture de tissu de 4 ml de volume,

avec une culture de 3 d de M. hyorhinis (5 x 108 organismes par millilitre dans du bouillon d'Eaton). On utilise environ 2 à 3% de la culture de mycoplasma par volume de la suspension de cellules. Après inoculation, on fait incuber les suspensions cellulaires à une

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température de 37° C pendant de 3 à 5 d. On prépare également des cultures témoins de la même façon. Après incubation, on remplace le milieu des cultures témoins et des cultures positives au mycoplasma par du milieu 199 frais contenant 1,68 g de bicarbonate de sodium et 1 % de sérum de cheval. Puis on traite les cultures par des 5 solutions de tylosine, de tobramycine et par la combinaison de tylosine et de tobramycine dans le milieu 199 contenant 1,68 g de bicarbonate de sodium par litre. On prépare des solutions de chaque antibiotique distinct et de la combinaison à une concentration de 1000 |xg/ml. La solution de la combinaison a une concentration de io chaque antibiotique de 1000 |ig. Par double dilution en série, on prépare des solutions à diverses concentrations jusqu'à 0,39 (ig/ml. On ajoute chacune des solutions d'antibiotique à un flacon séparé contenant la culture de tissu.

On remplace le milieu de la culture de tissu dans chaque flacon îs deux fois par semaine et, à chaque changement de milieu pendant deux semaines, on ajoute une solution fraîche de l'antibiotique à la même concentration. Après deux semaines, on fait des remplacements par du milieu frais pendant deux semaines supplémentaires sans addition d'antibiotique. On prélève des échantillons de chaque 20 culture avant chaque changement de milieu et on les cultive pour déterminer la présence de mycoplasmas. La concentration inhibitrice minimale des différents antibiotiques et de la combinaison tylosine/ tobramycine est la plus faible concentration de l'antibiotique dans une culture de tissu donnée qui ne permet pas la culture de myco- 25 plasmas après échantillonnage. La concentration inhibitrice minimale pour la tylosine seule est de 100 ng/ml et, pour la tobramycine seule, elle est de 100 fig/ml, tandis que, pour la combinaison des deux, la CIM est de 3 |xg/ml.

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Exemple 2:

Quand on évalue la tylosine, l'apramycine et les combinaisons tylosine/apramycine dans des cultures de tissus contaminés par M. hyorhinis HH selon le procédé et les modes opératoires tels que décrits dans l'exemple 1, la tylosine seule a une CIM de 200 Hg/ml, l'apramycine seule a une CIM de 600 |xg/ml, tandis que la combinaison tylosine/apramycine a une CIM de 12 ng/ml.

Exemple 3: 40

En utilisant M. hyorhinis dans le mode opératoire de l'exemple 1 et en utilisant de la gentamycine à la place de la tobramycine et une combinaison tylosine/gentamycine à la place de la combinaison tylosine/tobramycine, on trouve que la tylosine seule a une CIM de 400 |ig/ml, tandis que la combinaison de tylosine/gentamycine a une 45 CIM de 0,78 |ig/ml.

Exemple 4:

On utilise la combinaison leucomycine/tobramycine à la place de la combinaison tylosine/tobramycine utilisée dans l'exemple 1. La leucomycine seule a une CIM de 400 (ig/ml, la tobramycine une CIM de 200 Hg/ml et la combinaison a une CIM de 0,78 Hg/ml.

Essai:

On répartit de façon aléatoire, en fonction de leur poids, 96 porcs venant d'être sevrés, pesant en moyenne 6,0 kg, en douze groupes de 8 porcs par groupe. On utilise quatre traitements dans l'étude, comme suit:

1. témoins non traités par le médicament;

2. apramycine dans l'alimentation à 110 ppm;

3. phosphate de tylosine dans l'alimentation à 110 ppm, et

4. sulfate d'apramycine et phosphate de tylosine, tous deux dans l'alimentation à 110 ppm.

Chaque traitement est reproduit sur trois groupes.

Les porcs sont nourris pendant 21 d à volonté avec un aliment contenant de la farine de soja et du maïs à 20% de protéine, avec un peu d'orge perlé pour faciliter le transit intestinal. Des vitamines et des minéraux sont ajoutés comme nécessaire pour équilibrer l'aliment. La seule différence dans les aliments donnés à tous les porcs est l'inclusion de l'antibiotique ou de la combinaison antibiotique appropriée dans chacun des aliments contenant le médicament. Tous les aliments sont pesés tels qu'ils sont donnés aux porcs, la nourriture restant à la fin de la période de pesage est pesée et rejetée. Les porcs sont pesés au début de l'étude et toutes les semaines par la suite.

La notation des diarrhées est effectuée par groupe. La notation est effectuée pour la même période deux fois par jour pendant les 13 premiers jours et une fois seulement le quatorzième jour. L'indice de notation est le même que celui indiqué dans la note 2 du tableau 5.

Un groupe supplémentaire de porcs est entretenu pour une étude bactériologique. Ces porcs sont sacrifiés dès que l'on observe qu'il se produit une diarrhée après la répartition des animaux en groupe et avant que l'on ne commence à donner une quelconque alimentation contenant du médicament.

On détermine, pour les animaux sacrifiés, le nombre de E. coli P-hémolytiques par millilitre du contenu du duodénum ou de l'iléum. Les résultats montrent la présence de E. coli à des taux de 107 et de 10a dans le duodénum de deux des animaux testés. On obtient des résultats négatifs en faisant une culture pour déterminer la présence de Salmonella.

Les résultats de l'étude exprimés en gain de poids, réduction de l'incidence de la diarrhée et efficacité améliorée de l'alimentation,

sont donnés dans les tableaux 4 et 5.

R

1 feuille dessin

Claims (8)

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1. Composition antibiotique comprenant un antibiotique de type macrolide choisi dans le groupe comprenant la tylosine, la leu-comycine, la magnamycine, la spiramycine et Folèandomycine ou un de leurs sels physiologiquement acceptables, et un antibiotique de type aminohétêroside choisi dans le groupe comprenant la tobramy-cine, l'apramycine, le facteur 5 de la nébramycine, la gentamycine et la néomycine ou un de leurs sels physiologiquement acceptables.

2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'antibiotique de type macrolide est la tylosine ou un de ses sels physiologiquement acceptables.

2

REVENDICATIONS

3. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'antibiotique de type aminohétêroside est la tobramy-cine ou un de ses sels physiologiquement acceptables.

4. Composition selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'antibiotique de type aminohétêroside est l'apramycine ou un de ses sels physiologiquement acceptables.

5. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend la tylosine ou un de ses sels physiologiquement acceptables, et la tobramycine ou un de ses sels physiologiquement acceptables.

6. Composition antibiotique selon la revendication 1, caractérisée en ce que le macrolide est la tylosine ou un de ses sels physiologiquement acceptables et l'aminohétêroside est l'apramycine ou un de ses sels physiologiquement acceptables.

7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend le phosphate de tylosine et le sulfate d'apra-mycine.

8. Utilisation de la composition antibiotique selon l'une des revendications 1 à 5, pour améliorer la croissance ou pour améliorer l'utilisation des aliments chez les porcs.