DE2560238C2

DE2560238C2 - Verfahren zur Herstellung von Desacyl-pepsidin

Info

Publication number: DE2560238C2
Application number: DE2560238A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Fujigaoka Aichi Hasegawa; Noriaki Inuyama Aichi Kuwana; Yukio Hajima Gifu Nozu
Original assignee: EISAI Co Ltd TOKIO / TOKYO JP
Current assignee: EISAI Co Ltd TOKIO / TOKYO JP
Priority date: 1974-12-05
Filing date: 1975-12-04
Publication date: 1984-07-19
Also published as: FR2293215B1; CH620244A5; SE7513671L; JPS5339514B2; DE2554636C2; FR2293215A1; CA1053167A; JPS5167791A; GB1530921A; SE423710B; DE2554636A1; NL7514241A

Description

DA-Pepsidin weist eine starke pepsinhemmende Wirkung ;iuF. l!s eignet sich deshalb als Wirkstoff zur Behandlung von Magengeschwüren.

Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Pepsidinc A, B und C sind in J. Antibiotics 26, 1973, S. 539—541 beschrieben. Es sind bisher mehr als 10 N-Acylpentapeptidc bekanni.

Pepsidin C oder S-Pl-Pcpsidin ist auch in US-PS 38 19 48b und in der japanischen Patcntveröffentliehung 39 446/73 beschrieben. Pepsidin A und Pepsidin B werden außerdem in US-PS 38 78 185 offenbart.

Es ist bekannt, daß die Pepsidinc A, B und C eine starke pcpsinhcmmende Wirkung aufweisen.

Die eingesetzten Pepsidinc lassen sich durch Züchtung verschiedener Actinomyceten herstellen. Die vorgenannten Pepsidine werden beispielsweise durch Züchtung des Stammes Streptomyces naniwaensis EF 44-201 hergestellt.

jedoch haben die durch Züchtung dieser Actinomyceten hergestellten Pepsidine den Nachteil, daß sie im allgemeinen nicht homogen sind, sondern aus einern Gemisch von mehreren, d.h. aus bis zu mehr als zehn N-Acylpenlapeptiden mit verschiedenen Acylresten und ähnlichen Eigenschaften bestehen. Um aber zu einem bestimmten N-Acylpentapeptid zu gelangen, sind schwierige Trennverfahren erforderlich, was die Ausbeute an dem gewünschten Produkt beträchtlich vermindert.

Die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Baktcrienstämme Bacillus pumilus IFO-12 092 und IFO-12 110, sind beim Institute of Fermentation, Osaka, Japan hinterlegt.

Zur Züchtung der erfindungsgemäi3 verwendeten Mikroorganismen können Nährmedien beliebiger Zusammensetzung und beliebige Züchtungsbedingungen angewendet werden, vorausgesetzt, daß die Mikroorganismen dabei ein Wachstum aufweisen und die gewünschten Aktivitäten zeigen. Die Medien können beispielsweise beliebige organische oder anorganische Stickstoffqucllcn enthalten, wie Peplon. Fleischextrakt. Maisquellwasser. Sojabohnenhydrolysat, Sojabohnenexlrakl, Hcfcexlrakl, anorganische Ammoniumsalze und dcrgl. Als Koh· lenstoffquellcn können beispielsweise Melassen, Dextrose. Stärke und llydiolyscprodukle davon verwendet weiden. Ferner können anorganische Sal/e im Nührmcdium enthalten sein. Die Züchtung wird im allgemeinen unter Schütteln oder Belüften bei Temperaluren von 20 bis 45''C I bis 7 Tage durchgeführt.

Es wurde festgestellt, daß die entaeyliercnde wirkung von Bacillus pumilus IFC) 12 092 und IFO 12 110 sowohl intrazellular als auch extra/cllulär auftritt. Dies bedeutet, dall crfindungsgemiili die Gärmaischc. das Gärfiltrat. die vollständigen Zellen. Trocken/eilen und/oder daraus gewonnene En/.ynipräparate verwendet werden kün nen.

S Z3 ου

|| Es ist nicht immer erforderlich, daß das Ausgangsmatcrial in gereinigter Form vorliegt.

Ψ· Beispielsweise können Gemische von N-Acylpentapeptide enthallenden Materialien verwendet werden, die

g bei verschiedenen Reinigungsstufen anfüllen, beispielsweise kanu das Gürfiltral des Mikroorganismus verwen-

ffi dct werden.

ei Ferner können auch Produkte verwendet werden, die durch Aussalzen aus diesem Filtrai erhalten werden. s ü Schließlich können auch Produkte verwendet werden, die durch Extraktion des Gärfiltrates mit einem organism sehen Lösungsmittel unter anschließendem Entfernen des Lösungsmittels erhalten werden. Ls Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Reaktionsbedingungen, wie K Konzentration, Temperatur, pH-Wert und dergi. nicht kritisch und können je nach der Art des eingesetzten M Mikroorganismenstammes und des als Ausgangsmaterial gewählten Pepsidins innerhalb eines breiten Bereichs JJ gewählt werden.

M Die Abtrennung und Reinigung von DA-Pepsidin aus dem Reaktionsgemisch kann in üblicher Weise erfolgen,

;': beispielsweise durch Lösungsmittelextraktion. Säulenchromatographie, fraktionierende Kristallisation oder

ffi Umkristallisieren.

S Zum Nachweis der Bildung des erfindungsgemäß erhaltenen DA-Pepsidins kann folgendes dünnschichtchro-

; ■„ matographisches Verfahren angewendet werden:

?;■ Die Probe wird auf eine Silica Gel G-Dür.nschiehlplaiie (Handelsprodukt) aufgesetzt. Als Laufmittel wird

*A entweder

■i\ (I) ein Gemisch aus n-ButanoI, Essigsäure und Wasser im Volunienverhäl'nis von 3 :1 : ! oder

C/ (11) ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure. Wasser und Essigsäurehutylester im Volumenverhältnis von £; 4:1:1:4 verwendet. DA-Pepsidin wird als Ninhydrin-positiver Fleck, der auch eine positive R_-.-jon-Smiih-

ii Reaktion ergibt, nachgewiesen.

Bei Verwendung des Laufmittcls(l) beträgt der KrWert 0.48.

f Eine andere Nachweismöglichkeit besteht im Caseinplatten-Verfahren. das wie folgt durchgeführt wird:

Nach Entwicklung und Trocknung wird die vorerwähnte Dünnschic htplatte auf eine flache Platte aus Casein enthaltendem Agar übertragen. Auf diese Platte wird ein mit einer Pepsinlösung imprägniertes Filterpapier gelegt. Anschließend wird über Nacht bei 30⁰C umgesetzt, um nicht zersetztes Casein nachzuweisen.

DA-Pepsidin hat die folgenden Eigenschaften:

I. Aussehen: Weiße Nadeln

II. Löslichkeit: Leichtlöslich in Essigsäure und Methanol; löslich in Äthanol, n-Butanol und Pyridin; und geringfügig löslich in Aceton und Diäthyläther.

III. Färbungsreaktion: Positive Ninhydrin-und Rydon-Smilh-Reaktion.

IV. UV-Absorptionsspektrum: In einer O.lprozentigen Methanollösung tritt nur die auf die Peptidbindung zurückzuführende Absorption am Ende ein. während im Bereich von 250 bis 370 nrn keine Absorptionsmaxima auftreten.

V. lR-Absorptionsspckirurr^vgl. Fig. 1.

VI. Aminosäurezusammensetzung: Nach 72stündiger Hydrolyse mit b η HCl bei 110⁰C wird die Probe mittels eines Ai.iinosäureanalysators analysiert. F.s ergibt sich ein Molverhältnis von Alanin zu Valin von 1 : 2.

VII. Molekulargewicht und Strukturformel: Eine Probe wird nsch dem Säurechloridverfahren acetyliert und anschließend mit Diazomethan einer Mcthylverestcrung unterzogen. Die erhaltene Verbindung wird massenspektrographisch analysiert. Es ergibt sich M ' = 657. Somit ist das Molekulargewicht der Probe identisch mit dem berechneten Wert von 601 für DA-Pepsidin. Das Maximum dieses Fragments ist such identisch mit dem für die Strukturformel I von DA-Pepsidin berechneten Wert. Außerdem ist d^s vorgenannte acetylierte Produkt dünr.schiehlchromatographisch identisch mit Pcpsidin C.

j VIII. Pepsinhemmende Wirkung: Die pepsinhemmende Wirkung von DA-Pepsidin wird nach dem Verfahren gemäß S. Murao und S. Satoi, Agr. Biol. Chcm. japan, Bd. 34 (8), (1970). S. 1265 bis 1267. bestimmt. Es läßt sich feststellen, daß 0,82 μg DA-Pepsidin eine 50prozentige Hemmung von 100 μg Pepsidin ergeben. Der entsprechende Wen für Pepsidin C liegt bei 0.86 ng.

Ein Beispiel erläutert die Erfindung.

55 Beispiel

In eine 0,5 Liter fassende Sakaguchi-Flasche werden 0.1 Liter eines flüssigen Nährmediums vom pH-Wert 7 gegeben. Das Nährmedium enthält I Prozent Fleischextrakt, I Prozent Pepton jnd 0,5 Prozent NaCI und wird 10 Minuten bei 120"C sterilisiert.

leweils 20 dieser Flaschen werden mit jeweils ! ml einer Gärbrühe vom Bacillus pumilus IFO-12 092 bzw. IFO-12 110 inokuliert. Das Inokulum ist vorher in einem ähnlichen Nährmedium durch 24stündige Züchtung bei 30⁰C hergestellt worden. Sodann wird unter Schütteln 72 Stunden bei 30"C gezüchtet.

Nach beendeter Züchtung werden die Zellen aus der Gärmaische durch Zentrifugieren entfernt. Der vereinigte Überstand wird iropfenweise unter Kühlen mit 4 Liter kaltem Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird in destilliertem Wasser zu 50 ml einer Suspension suspendiert.

I ml der Gärmaische w'.rd mit 1 ml einer wäßrigen Lösung, die durch Lösen von 10 mg Pepsidin C in Wasser

und Neutralisieren mit b η NaOH-Lösung hergestellt worden ist. vermischt. Die erhaltene Lösung wird 5 Stunden bei 37°C geschüttelt.

Die Reaktionslösung wird der Dünnschichtchromatographie an Kieselgcl unterworfen, wobei als Laufmittcl ein Gemisch aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Volumenverhaltnis von 3:1:1 verwendet wird. Das Produkt hat einen R;-Wert von 0,48 und erweist sich uls authentisches DA-Pepsidin.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Desacyl-pepsidin, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Bacillus pumilus IFO 12 092 oder IFO 12 110 -züchtet, die Gärmaische, Gärmaischenfiltrat, vollständige Zellen, Trockenzellen oder daraus gewonnene Enzympräparatc mit Pepsidin C, Pepsidin B oder Pepsidin A umsetzt und Desacyl-Pepsidin abtrennt und reinigt.

Die Erfindung betrifft das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von Desacyl-pepsidin (im nachfolgenden als DA-Pepsidin bezeichnet).

Unter DA-Pepsidin ist das Pentapeptid Valyl-valyM-aminoO-hydroxy-e-meihyl-heptanoyl-alanyM-amino-3-hydroxy-6-methyl-heptansäure der Formel 1 zu verstehen:

H₃C CH₃

Yh

H₃C CH₃

CH

H₃C CH₃
CH

CH₂ OH

! I I I

H₂N- CH — CO—NH- CH-CO—NH-CH-CH-Ch₂-CO-NH-

H₃C CH₃

CK

CH₂ OH

I I i

-CH-CO—NH-CH-CH-CH₂-COOH