DE2646734C3 - Verfahren zur Herstellung von L-Leupeptinen - Google Patents

Description

(L) (L) (L) NH₂

worin R₁ und R₂ jeweils

— CH.—CH—CH,

CH₃
-CHCH₁CH₃

CH₃
oder

—CH-CH,

CH₃

bedeuten und R₃—CH₃ oder —C₂H_S ist dadurch gc· kennzeichnet, daß man ein Nährquellen enthaltendes Medium mit einem Leupeßtine bildenden Streptomyces-Stamm inokuliert, den Stamm bei pH-Bedingungen von 5,0 bis 7,0 unter Bildung und Ak<umulierung von L-Leupeptinen in dem Medium aerob kultiviert und die L-Leupeptine aus der Kulturbrühe bei pH-Bedingungen von 7,0 oder weniger extrahiert und reinigt.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium je 0,5 bis 1,25% (Gew./Vol.) L-Leucin, L-Arginin (als Hydrochlorid) und Glycin enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium je 0,5 his 1,25% (Gew./Vol.) L-Leucin, L-Arginin (als Hydrochlorid) und Glycin und 0,05 bis 0,3% (Gew./Vol.) mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Hefeextrakt, Caseinhydrolysat und Ribonucleinsäuren enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Leupeptine bildender Stamm Streptomyces roseus Ma839-Al (FERM-P No. 3019, ATCC 31 245) verwendet wird,
is 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das L-Leupeptin Acctyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginial ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium je 0,5 bis 1,25% (GCW./V0I.) L-Leucin, L-Arginin (als Hydrochlorid) und Glycin enthält und nicht mehr als 0,3% (Gew./Vol) mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Aminosäuren und Verbindungen, die sie enthalten, mit Ausnahme der obigen drei erwähnten Aminosäuren, für die Bildung von Acetyl-L-Ieucyl-L-leucyl-L-argininal.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dab das Medium je 0,5 bis 1,25% (Gew./Vol.) L-Leucin, L-Arginin (als Hydrochlo-

jo rid) und Glycin und 0,05% bis 0,3% (Gew./Vol.) mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Hefeextrakt, Caseinhydrolysat und Ribonucleinsäuren enthält und daß es nicht mehr als 0,3% (Gew./Vol.) mindestens einer Verbindung aus der Gruppe Aminosäuren und Verbindungen, worin diese enthalten sind, mit Ausnahme von L-Leucin, L-Arginin und Glycin, enthält für die Bildung von Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal.

8. Verfahren zur Herstellupg von L-Leupeptinen nach einem oder mehrerer, der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der L-Leupeptine aus der Kulturbrühe unter Verwendung eines porösen, nichtionischen Adsorptionsharzes vornimmt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion und Reinigung bei einem pH-Wert von 5,0 bis 6,0 durchgeführt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als poröses, nichtionisches Adsorptionsharz ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, ein Acrylsäurcesterpolymer oder ein Phenolharz verwendet wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von L-Leupeptinen in hoher Ausbeute und ihre Extraktion ohne Racemisierung.
Leupeptine haben die allgemeine Formel

R₂ R, CHO NH

III //

R₃CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CH₂-CH₂-Ch₂NH-C

worin Rι und R₁ je

-CH₂-CH-CH.,

CH₃
—CH- CH,—CH₃

CH₃

—CH-CH,

CH₃

IO

15

bedeuten und R., —CH₃ oder —C₂H₅ bedeutet.

Diese Leupeptine sind nützliche Substanzen mit einer niedrigen Toxizität. Sie besitzen Protease inhibierende Aktivitäten, wie Antiplasmin- und Antitrypsin-Aktivitäten, und besitzen verschiedene antiinflammatorische und andere pharmakologische Wirkungen (vgl. JA-PS 5 95 !40 und US-PS 38 40 513).

Die Hauplkomponenten der Leupeptine, iSe man bis heute durch Fermentierung erhalten hat, sind Propionyl- und Acetyl-L-leucyl-L-Ieucyl-DL-argininal, die je eine Argininalgruppe der sterischen DL-Konfiguration enthalten (diese werden im folgenden als DL-Leupeptine oder DL-Form bezeichnet) (Kondo, S. et al., Chem. Pharm. Bull. [Tokyo], 17, !896 [1969]; US-PS 38 40 513). jo

Bisher hat man angenommen, daß nur DL-Leupeptine durch Fermentierung hergestellt werden können.

Es wurden bereits Leupeptine mit einer Argininalgruppe der L-Konfiguration (die im folgenden als L-Leupeptine oder L-Form bezeichnet werden) und andere Leupeptine mit Argininalgruppen der D-Konfiguration (die im folgenden als D-Leupeptine oder D-Form bezeichnet werden) chemisch synthetisiert. Bei einem biochemischen Versuch wurde bestätigt, daß das aktive, für die Inhibierungswirkung auf Enzyme verantwortliche Prinzip L-Leupeptine sind, während D-Leupeptine inaktiv sind, und daß DL-Leupeptine, die durch Fermentierung erhalten werden, nur die Hälfte der Aktivität von L-Leupeptinen zeigen, Shimizu, B. et al., J. Antibiotics, 25, 515(1972); H. Umezawa, Enzyme Inhibitors of Microbial Orgin, University of Tokyo Press (1972), S. 24 und 25.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von L-Leupeptinen durch Fermentierung zu schaffen.

Die Erfindung wird in den Patentansprüchen definiert.

In F i g. I ist der Ablauf der Racemisierung von L-Leupeptin dargestellt, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird. Die relative Aktivität und die spezifische Drehung sind gegeneinander aufgetragen und werden beide in Abhängigkeit von der Konservierungszeit in Tagen gemessen. In Fig. 2 bo sind die Infrarot-Absorptionsspektren von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten L-Leupeptin-hydrochlorid (ausgezogene Linie) und nach bekannten Feimentations- und Extraktionsverfahren hergestelltem DL-Leupeptinhydrochlorid (gestrichelte Linie) dargestellt.

Im folgenden wird die Erfindung näher erläutert.

(I) In der Lcupeptin."rrmentation sammeln sich im Medium, wenn der pH-Wert des Nährmediums im Bereich von 5,0 bis 7,0 gehalten wird, L-Leupeptine an. Wenn der pH-Wert des Reaktionsmediums sich zur alkalischen Seite verlagert, werden die DL-Leupeptine erhalten. Wird das Züchten weitergeführt, nachdem die Akkumulation der L-Leupeptine ihr Maximum erreicht hat, findet eine teilweise Racemjerung der akkumulierten L-Leupeptine statt, und man erhält L-Leupeptine, die mit der D-Form verunreinigt sind, selbst wenn der pH-Wert des Kulturmediums im Bereich von 5,0 bis 7,0 gehalten wird.

(2) Gereinigte L-Leupeptine erleiden eine allmähliche Racemisierung in schwach alkalischem Medium, ζ B. bei einem pH-Wert von 8,0, bei milden Temperaturbedingungen, z. B. bei 23°C, und wandeln sich vollständig nach mehreren Tagen in DL-Form um.

(3) Bei typischen bekannten Reinigungsverfahren werden die Leupeptine im Kulturfiltrat Adsorptionsund Desorptionsbehandlungen unter Verwendung einer Säule aus Aktivkohle oder eines Kationenaustauschharzes mit Carboxylgrupp -.-> oder in den H-, Na- oder Mischformen unterworfpn. Bei der Verwendung solcher Kationenaustauschharzen induziert die Η-Form keine Racemisierung der L-Leupeptine; sie ist jedoch nicht wirtschaftlich, da sie eine niedrige Adsorptionskapazität besitzt. Die Na-Form besitzt eine noch niedrigere Adsorptionskapazität, und außerdem verursacht sie eine vollständige Racemisierung. Obgleich eine Mischform der H- und Na-Formen in einem geeignetes Verhältnis (7-8:3-2, ausgedrückt durch das Volumen) besser ist als irgendein anderes bekanntes Adsorptionsmittel wegen der hohen Adsorptionskapazität und der hohen Ausbeuten bei der Adsorption und Desorption, ist sie Tür die Herstellung von L-Leupeptinen ungeeignet, da eine starke Racemisierung stattfindet, selbst wenn die Behandlungen in schwach oder mäßig sauren Medien durchgeführt werden.

(4) Das Verfahren, bei dem eine Adsorption der Leupeptine aus einem Kulturfiltrat mit Aktivkohle und die anschließende Desorption mit einem sauren, wäßrigen, organischen Lösungsmittel, z. B. 80%igem Methanol mit einem pH-Wert von 2,0, durchgeführt wird, ergibt DL-Leupeptine, wenn es mit Bier durchgeführt wird, das nach bekannten Verfahren ohne pH-Kontrolle fermentiert wurde. Die Anmelderin hat überraschenderweise gefunden, daß dieses Verfahren L-Leupeptine ergibt, wenn es mit Bier durchgeführt wurde, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt bzw. hergestellt wurde. Jedoch ist die Ausbeute so niedrig wie 30 bis 50%. Aktivkohle ist jedoch, ähnlich wie Silikagel oder Aluminiumoxid, als Adsorptionsmittel für die Verwendung bei der Säulenchromatographie bei der nachfolgenden Reinigungsstufe bevorzugt.

(5) Wird beim erfindungsgemäßen Verfuhren ein poröses, nichtionisches Adsorptionsharz verwendet, so kann sowohl bei der ersten Extraktions-Reinigangs-Stufe, bei der eine Adsorption von Leupeptinen aus einem Kuiiurfiltrat und die Desorption der adsorbierten Leupeptine erfolgt, als auch bei der letzteren Stufe der Reinigung von L-Leupeptinep verwendet werden, bei der vorgereinigte L-Leupeptine enthaltende Lösungen gereinigt werden. Bevorzugt wird es bei der ersten Stufe verwendet. Wird ein Leupeptine enthaltendes Kulturfiltrat nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt, so erhält man, verglichen mit irgendeinem anderen bekannten Ver-

fahren, wesentliche Vorteile. Die Adsorptionskapazität ist größer, verglichen mit irgendeinem bekannten Verfahren; es findet keine Racemisierung der L-Leupeptine statt, und man erhält eine hohe Ausbeute von etwa 90% bei der Adsorptions-Desorptionsstufe.

(6) Durch Zugabe von je 0,5 bis 1,25% L-Leucin, L-Arginin (als Hydrochlorid) und Glycin zu dem L-Leupepliti-Fermentationsmedium wird die Bildung der L-Leupeptine um das 4- bis öfachc erhöht, verglichen mit bekannten Verfahren.

(7) Die Ausbeute an L-Leupeptinen wird weiter um das 7- bis lOfachc erhöht, verglichen mit bekannten Verfahren, wenn man zu dem obigen Medium, das die Aminosäuren enthält, mindestens einen von verschiedenen organischen Naturstoffen zugibt, wie Ribonuclcinsäiire, Hefeextrakt und C'aseinhydrolysat.

(8) Wenn ein die obenerwähnten drei Aminosäuren enthaltendes Fermentationsmedium verwendet wird, wobei das Medium nicht mehr als 0.3% (Gew./Vol.) Aminosäuren einschließlich der Aminosäuren selbst und Substanzen, worin sie enthalten sind, wie Peptide. Proteine usw., ausgenommen die obigen drei Aminosäuren, enthält, so besteht das Leupeptinprodukt im wesentlichen nur aus Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-arginial und enthält keine anderen Leupeptine, die eine Propionylgruppc. einen Isoleucinrest oder einen Valinrcst enthalten.

Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Versuchsbeispirli.- erläutert.

Bei der vorliegenden Erfindung wird die Potenz der Leupeptine auf folgende Weise bestimmt.

0,5 ml einer Leupeptinlösung, hergestellt so. daß die Konzentration etwa 8 meg (Potenz) ml wird, werden zu 2,5 ml einer 1,25 · 10~⁴ M Lösung von p-Toluolsulfonyl-L-arginin-meihylester-hydrochlorid in tris-Puffer von pH 8.1 gegeben. Nach einer Vorink'ibation bei 32° C während 5 min gibt man zu dem Gemisch 0,1 ml einer wäßrigen Trypsinlösung (7.5 mcg/ml). Unmittelbar nach dem Inkubieren bei 32° C während 30 min wird die Absorption des Reaktionsgemisches bei 247 nm bestimmt, so daß man den Versuchswert erhält. Ein Blindwert wird auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, erhalten, mit der Ausnahme, daß kein Leupeptin zugegeben wird. Der Grad der Trypsin-Inhibierung wird berechnet, indem man den Unterschied zwischen dem Blindwert und dem Testwert durch den Blindwert dividiert. Bei diesem Versuchsverfahren ist die 50%ige Trypsin-Inhibierungskonzentration (ID₅₀) von Acetyl-L-Ieucyl-L-leucyl-L-argininal-hydrochlorid von höchster Reinheit etwa 0,98 mcg/ml. Diese Verbindung wird als Standardprobe verwendet, und die Potenz von Leupeptinen wird als Gewicht, wie als meg (Potenz) und mg (Potenz), angegeben.

DL-Leupeptine mit höchster Reinheit, die nach den bekannten Fermcntierungs- und Rcinigungsver- < fahren hergestellt werden, zeigen cine ID,,, von 1.87 mcg/ml.

Der L-Lcupeptin-Gehalt eines Gemisches aus L-Leupeptincn und D-Leupeptinen wird auf folgende Weise bestimmt.

ic» Die zu prüfenden Leupeptine werden in eine wäßrige Lösung eingebracht und mit Kaliumpermangant zu Lcupeplinsäuren oxydiert (der Argininanteil von Leupeptin wird unter Bildung von Arginin oxydiert). Die entstehenden Säuren werden zur Aktiv- > kohle-Säulenchromatographie und Chromatographie an saurem Aluminiumoxid gereinigt und isoliert. Die isolierten Säuren werden mit on-Chlorwasscrstoffsäurc 24 h bei II()"C hydrolysiert. Der gcsarn'e Arsiningehalt des Hydrolysat.¹« wird mit einem Amino-

-¹Ii säiire-Analysalor bestimmt. Andererseits wird der L-Arginingehalt des Hydrolysats durch einen Bioassay (Rioversuch) unter Verwendung von Milchsäurebaktericn bestimmt. Fis wird angenommen, daß der L-Arginingehalt (%)dcs gesamten Arginins gleich

r> ist dem L-Leupeptingehalt (L-Form Prozcntgehalt) in den gesamten Lcupeptinen. Der L-Form-Gchalt der St^ndardprohe beträgt 100% und der der DL-Leupeptinc erhalten nach bekannten Fcrmcrüaiionsverfahren. octrägt 52%.

Versuchsbeispiel I

100 ml eines Mediums, das 2% Glucose. 2% Stärke. 3% Polypepton, 0,5% NaCI und 0.3%

η KH₂PO₄ enthält und das in einen Kolben gegeben und sterilisiert wurde, wird mit einer Schrägkultur von Streptomyces roseus MA839-AI (FERM-P Nr. 3017: ATCC 31245) inokuliert. Das Medium wird dann 2 Tage bei 27 bis 28'C zur Herstellung

4Ii eines Inokulums durch Schütteln kultiviert (die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Produktgehalte werden als Gew./Vol.-Prozentgehalte angegeben). 201 des gleichen Mediums, wie oben erwähnt, werden in einen 30-l-KoIbenfermentor ge-

4i geben und mit 200 ml des obigen Inokulums inokuliert. Die Züchtung erfolgt bei 27 C unter Belüftung und Rühren. In regelmäßigen Intervallen wird ein Teil der Kulturbrühe entnommen und ohne Racemisierung erfindungsgemäß gereinigt: man erhält ein gereinigtes Leupeptin-hydrochlorid in Pulverform. Die Versuchsergebnisse der Aktivität und die L-Form-Prozenteehalte sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle 1

Änderung mit der Zeit bei der Leupeptin-Fermentation

Züchtungszeit (Std.)

pH-Wert

Potenz der Kulturbrühe (mcs/ml)

Potenz des Leupeptinpulvers (mcg/mg)

L-Form. % des Leupeptinpulvers

24	36	42	48	60	72
6.6	6.9	6.5	5,5	4.9	5,6
20	115	330	450	320	280
—	—	1000	1000	910	820
		100	100	92	84

Aus Tabelle J ist erkennbar, daß die Potenz von b5 Kultivierung abnimmt. Der L-Form-Gehalt des Leu-

dem Leupeptinpulver 1000 mcg/mg nach 42 h und peptinpulvers nimmt ebenfalls von 100% nach 42 h

48 h Kultivierung beträgt, wohingegen sie auf910 meg/ und 48 h Züchtung auf 92% nach 60 h und weiter

mg nach 60 h und weiter auf 620 mcg/mg nach 72 h auf 84% nach 72 h Züchtung ab. Man muß daher

Vorsichtsmaßnahmen treffen, um ein unnötig verlängertes Kultivieren zu verhindern, da. selbst wenn der pH-Wert im Bereich von 5.0 bis 7.0 kontrolliert wird, eine verlängerte Züchtung, nachdem die maximale Akkumulation von L-Lcupcptincn erreicht wird, -, eine partielle Racemisierung der bereits gebildeten L-Leupcptine ergibt.

Vcrsuchsbeispicl 2

Die nach 48 h Züchtung in Versuchsbeispiel I in erhaltenen L - Leupcptin-hydrochloride werden in O.I M Phosphat puffer bei einem pH-Wert von 8.0 unter Bildung einer l'Oigcn Lösung gelöst. Die entstehende Lösung wird bei 23 C stehengelassen, und die Änderungen mit der Zeit in der spezifischen ι ·, Drehung und in der relativen Aktivität ι mcg/mg) werden bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. I aufgeführt. Die nach 7 Tagen isolierten Leupeptine besitzen einen L-Form-Gehalt von 50% und eine relative Aktivität von 4W mcg/mg. was _>u ..n/eigl. daß eine vollständige Racemisierung aufgetreten ist. Au¹-· den obigen Ergebnissen ist erkennbar, daß L-Lcupcptinc selbst bei milden Bedingungen bei einem pH-Wert von 8.0 und einer Temperatur von 23 C racemisicrt werden. _>-,

Versuchsbeispiel 3

Unter Verwendung der Kulturbrühe. die man nach 48 h Züchtung, durchgeführt auf gleiche Weise wie in Vcrsuchsbeispicl I erhält, werden die folgenden m beiden Reinigungsverfahren miteinander verglichen.

Verfahren A

Die Kulturbrühe mit einem pH-Wert von 6.0 wird durch eine Säule eines Kationanaustauschharzes mit r, Carboxylgruppen (Na-Form : H-Form = 2:8. ausgedrückt durch das Volumen) zur Adsorption von L-Leupcptinen geleitet. Das Adsorbat wird mit 8()%igem Methanol, enthaltend I η-Chlor wasserski IT-säurc. eluiert. Alle Eluatfraktionen sind sauer. Die aktiven Fraktionen werden eingedampft; man erhält eine wäßrige Lösung. Aus der wäßrigen Lösung werden die Leupeptine mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanollösung wird bei vermindertem Druck zur Entfernung des n-Butanols eingedampft. Die ent- ·>-> stehende wäßrige Lösung wird durch eine Aktivkohle-Säule geleitet, und die adsorbierte Phase wird mit 20%igem wäßrigem Aceton, dessen pH-Wert auf 2.0 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt ist. entwickelt. Die aktiven, abströmenden Fraktionen wer- ><> den gesammelt und mit einem Polyaminharz. bestehend aus primären, sekundären und tertiären Aminen (OH-Form) neutralisiert. Dann wird konzentriert und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wird in Methanol gelöst und an einer mit saurem Aluminiumoxid gefüllten Säule mit Methanol adsorbiert und dann mit Methanol entwickelt. Die aktiven, abströmenden Fraktionen werden gesammelt und zur Trockene eingedampft: man erhält gereinigte L-Leupeptin-hydrochloride. Die Ausbeute aus dem to Kulturfiltrat beträgt 33%.

Verfahren B

Das gleiche Kulturfiltrat. wie bei Verfahren A. wird durch eine Säule aus einem nichtionischen Adsorptionsharz, enthaltend ein Copolymer von Styrol und Divinylbenzol. zur Adsorption von Leupeptin geleitet. Die adsorbierte Phase wird dann mit 50%igem Methanol mit einem pH-Wert von 2,0 eluiert. Die aktiven Eluatfraktionen werden gesammelt und durch Destillation von Methanol befreit. Es verbleibt eine wäßrige Lösung. Die Leupeplinc werden mit n-Butanol aus der wäßrigen Lösung extrahiert. Die n-Butanolcxtraklion wird auf gleiche Weise wie bei Verfahren A zur Herstellung von gereinigten Leupeptinhydrochloriden durchgeführt. Die Ausbeute an Kulturfiltrat beträgt 65%. Die bei den beiden Verfahren erhaltenen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle Il verglichen.

Tabelle Il

Vergleich zwischen den Verfahren A und B

Verfahren	Ausbeule,	Potenz des Pulvers,	L-Form-Ochall des Pulvers,
		mcg/mg	%
A	33	530	56
η	65	KXK)	100

Aus den obigen Ergebnissen ist erkennbar, daß bei der Extraktion und Reinigung von L-Lcupeptinen ein beachtlicher Teil des L-Leupeptins racemisicrt wird, selbst wenn die Lösung, die die Leupeptine enthält, sauer gehalten wird, wenn die Adsorption und Desorption unter Verwendung eines schwach sauren lonenaustauschharzes der Carbonsäurc-Art durchgerührt wird, das teilweise in seine Na-Form umgewandelt wurde.

Versuchsbcispicl 4

Vergleich der Leupeptin-Produktivität zwischen dem crfindungsgcmäßcn Medium und den bekannten Medium.

I. Mediumzustand

(a) Erfindungsgemäßes Medium: 3% Glycerin. 0.75% L-Lcucin!0,75% L-Argininhydrochlorid.O.75% Glycin. 0,5% NH₃NO.,. 0,5% NaCI. 0.3% K₂HPO₄:

(b) bekanntes Medium für die Herstellung (Kontrolle): 1% Glucose, 2% Stärke, 3% Pepton, 0.5% NaCI. 0.3% KH₂PO^ (vergl. JA-PS 5 95 140 und US-PS 38 40 513):

(c) bekanntes synthetisches Medium (Kontrolle): 1% Glucose, 1% Stärke, 0,26% L%Leucin. 0.4% Amininhydrochlorid, 0,3% Glycin. 0,2% NH₄NO,. 0.1% K,HPO₄. 0.05% MgSO₄-7H,O. 0.05% KCI. 0,001 % FeSO₄ ■ 7 H₂O (vgl. H. U m e ζ a w a. Enzyme Inhibitors of Microbial Orginc. University of Tokyo Press [1972], Seite 20).

2. Verwendeter Stamm

Der gleiche, wie er in Versuchsbeispiel 1 verwendet wird.

3. Kultivierungsbedingungcn

KX) ml des Mediums werden in einen 50fl-mI-Kolben gegeben und mit I ml Inokulum. das aus gleiche Weise wie in Versuchsbeispiel I beschrieben kultiviert wurde, inokuliert. Das inokulierte Medium wird bei 27 bis 28 C auf einer Schüttelmaschine, die mit einer Amplitude von 7 cm und 135 Hin- und Hergängen/min betrieben wird, kultiviert. Proben werden nach 48 und 72 h entnommen und auf die Leupeptin-Potenz geprüft.

909 615/429

4. Ergebnisse

Die crhallcnen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III a

Tabelle III

Medium

Züchtungszeit

48 SId. 72 SId. ,„

EiTindungsgcmäßcs 1650 mcg/ml 2500 mcg,^;ml Medium

Bekanntes Medium 520 mcg/ml 630 mcg/ml für die Herstellung

Bekanntes syn- 380 mcg/ml 440 mcg/ml

thctisches Medium

Aus Tabelle üi isi erkennbar, üüm nach einer Züchtung während 72 h die Leupeptinproduktivitiii des erfindungsgcmäßen Mediums das 4- bis 6fache erreicht, verglichen mit der des bekannten Mediums für die Herstellung und des bekannten synthetischen Mediums, die als Vergleiche verwendet wurden. Obgleich fast genau die gleichen Bestandteile vorhanden sind, ist die Ausbeute, die mit dem erfindungsgemäßen Medium erhalten werden, um das 6fachc höher als die. die mit bekannten synthetischen Medium erhalten wird, das in dem erlindungsgemäßen Medium die Konzentrationen an L-Leucin. L-Arginin und Glycin und das Verhältnis unter ihnen verbessert wurde.

Versuchsbeispiel 5

Geeigneter Bereich für die Mengen an L-Leucin. L-Arginin und Glycin.

(1) Mediumszustand: Unterschiedliche Mengen an L-Leucin. L-Argininhydrochlorid und Glycin, wie in Tabelle IV angegeben, werden zu dem Grundmedium 4ii zubegeben, das 3,0% Glucose. 0,5% NH₄NO,. 0.1% K₃HPO₄, 0.05% MgSO₄ -7 H₂O. 0.05% KCl. 0.2% Ribonucleinsäurc und 0.1 Mi Silikon-Entschäiimungsöl enthält.

(2) Verwendeter Stamm: Der gleiche, wie er in -n Versiichsbcispiel I verwendet wird.

(3) Kultivierungsbedingungen: Die gleichen, wie in Versuchsbeispiel 4.

(4) Ergebnisse: Die: Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV aufgeführt. ίο

Aus Tabelle IV ist erkennbar, daß. wenn L-Leucin. L-ArgininhydroeMorid und Glycin zu dem Medium in einer Menge von je 0.25% zugegeben werden, die Ausbeute an Lcupcptin in 72 h Kultivierung unwesentlich ist. wohingegen, wenn je 0.5 bis 1.25"ο der Aminosäuren zugegeben werden, die Ausbeute an Lcupcptin in der gleichen Ziichtungszeit so hoch ist wie 2560 bis 4370 meg/ml. Wenn die Menge der Aminosäuren auf je 1.50% erhöht wird, werden nur unwesentliche Mengen an Lcupcptin gebildet. Diese Ergebnisse bestätigen, daß eine hohe Ausbeute an Leupeptiii besonders dann erhalten wird, wenn je 0.5 bis 1.25% L-Leucin. L-Arginin IaK llulrochlondl und Glycin zu dem Medium zugegeben werden.

Versuchsbeispiel 6

Wirkung der Zugabe von natürlichen komplexen organischen Substanzen.

(Il Mediumzustand: Die in Tabelle V aufgeführten organischen Naturstoffe werden zu dem erliiulungsgcmiiUcn Medium, das in Versuchsbeispiel 4 \erwendet wurde, zugegeben.

(2) Verwendeter St.mim: Der gleiche wie in Verstichsbeispiel I.

(3) Züchtungsbedingungen: Die gleichen wie in Versuchsbeispiel 4.

(4) Ergebnisse: Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V aufgerührt.

Tabelle V

Tabelle IV	Mengen, %	Glycin	Ausbeute an meg, ml	Leupeptin.	v>
Zugegebene	L-Arginin- hydrochlorid	0.25	48Std.	72 Std.
L-Leucin	0.25	0.50	310	unwesent lich	bll
0.25	0.50	0.75	2080	3300
0.50	0.75	1.(Xl	3460	4370
0.75	1.00	1.25	2080	2860
1.00	1.25	1.50	400	2560
1.25	1.50		unwesent lich	unwesent lich
1.50

Zusatzstoff	Zu gegebene Menge. %	Ausbeute an Leupeplin. mcg mi Ziichtungszeit	72 h
		48h	2250
Hefeextrakt	0.1	1550	23(X)
Hefecxlrakt	0.2	1770	2540
Casaminosäuren	0.1	1970	2550
Casaminosäuren	0.2	I 7S0	3420
Ribonucleinsäuren	0.1	2040	3520
Ribonucleinsäuren	0.2	2050	I 750
Vergleich	0	1380

Aus Tabelle V ist erkennbar, daß. wenn 0.1 bis 0.2% Hefeextrakt. Casaminosäuren oder Ribonucleinsäuren zu dem ursprünglichen erfindungsgemäßen Medium zugegeben werden (das als Vergleich verwendet wird), die Ausbeute an Leupeptin weiter erhöht wird. Insbesondere wenn Ribonucleinsäuren zuaeaeben werden, nimmt die Ausbeute auf das Doppelte zu. bezogen auf die Ausbeute, die mit dem ursprünglichen Medium erreicht wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man irgendwelche Mikroorganismen, die L-Leupeptine bilden, verwenden. Beispiele solcher Mikroorganismen sind Strcptomyccs roseus (zwei Stämme, ihre Labornummern vom Institute of Microbial Chemistry sind MA839-A I bzw. MB262-M I: MA839-A I wurde im Fermentation Research Institute. Agency of Industrial Science and Technology. Japan [Kogyo Gijutsuin Biseibutsu Kogyo Gijutsu Kenkvusho] und American ^Type Culture Collection. Maryland. USA. unter den Nummern FERM-PNo.301 7bz\v.ATCC31 245hinterlegt). Streptomyces roseochromogenes (drei Stämme.

ΜΛ 943-Μ I. MΒ456-ΛΕ I, MB260-Λ 2), Streptomyces chartreuMS lein Sliimm. MB58-MGI). Streptomyces albireticuli (sin Stamm. ΜΒ26-ΛΙ). Strepiomyces iiioliitciis lein Stamm. MB32I-A1). Streptomyces lavendulae (I Stamm. ΜΒΙ72-Λ2) und Strcplonyccs noboritocnsis (ein Stamm, ΜΒ46-ΛΟ). Die Eigenschaften dieser Species sind in »The Aclioiiomycctes«, Band II. von S. A.Waksman. The Wiliiams& VVilkins Company. 1961. beschrieben.

Als KohlcnstofTqucllc können in dem erfindungsgemäßen. Leupeptine liefernden Medium Essigsäure. Glycerin. Glucose. Saccharose. Maltose. Dextrin. Stärke u.a. verwendet werden; besonders bevor/ui*t werden Glycerin und Glucose verwendet. Als anorganische Sti(.kstoffquelle ist Ammoniaksticksioff gegenüber Nitratstickstoff bevorzugt.

Die /u dem Medium zugegebenen Aminosäuren sind L-Ltucin. L-Arginin und Glycin.

Die organischen Naturstoffe, die zu dem Medium zugegeben werden, umfassen Ribonucleinsäuren, HefcextniktciindC-iseinhydrolysiit. Die Ribonucleinsäuren können gereinigt sein oder rohe Qualität besitzen, und Verbindungen, die Ribonucleinsäuren in relativ hohen Konzentrationen enthalten, können ebenfalls verwendet werden.

Die L-Leupeptine werden nach den erlindungsgemäßen Verfahren auf folgende Weise hergestellt.

Das Kulturmedium enthält z. B 1.0 bis 6.0% Glycerin. 0.1 bis 1.0% NH₄NO.,. 0.05 bis 0.5"„ K₂HP(V 0.01 bis 0.1% MgSu₄ 7 H,(). 0.01 bis 0.1% KfI. 0.5 bis 1.25% L-Leucin. 0.5 bis 1.25% L-Arginin (als Hydrochlorid). 0.5 bis 1.25% Glycin. 0.05 bis 0.3% organische Naturstoffe, wie Riböniicleinsäure. Hefeextrakl und Cascinhydrolvsat. und 0.01 bis 0.3% Silikon-Entschäumer (pH 6.5). Nach dem Sterilisieren auf übliche Weise wird das Medium aseptisch mit der Impfkullur. die durch Kultmeruni: eines Leupeptin liefernden Stammes, wie Strepiomyces. Stamm MA839-AI (FERM-P Nr. 3017; ATCC 31 245), hergestellt wurde, angeimpft und dann wird bei 23 bis 37 C. bevorzugt bei 25 bis 30 C. gezüchtet. Wenn der pH-Wert ^7.0 übersteigt, wird der pH-Wert durch Zugabe von Schwefelsäure oder Phosphorsäure auf 6.0 bis 6,5 eingestellt. Im allgemeinen wird die Akkumulicrung von L-Leupcptin nach 3 bis 4 Tagen Fermentierung ihr Maximum erreichen.

Die so erhaltene Kulturbrühe wird dann filtriert und das Filtrat wird mit einem Harz zur Gewinnung von L-Leupeptinen behandelt. Die Harzbehandlimg kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden, bevorzugt wird sie unter Verwendung einer Harzsäule durchgeführt. Das adsorbierende Harz wird in die Säule gepackt und dann aktiviert, indem man z. B. S0%iges wäßriges Methanol durch das Harz leitet uiiu gut mit Wasser wäscht. Der pH-Wert des Leupeptine enthaltenden Kulturfiltrats wird dann auf etwa 5.0 bis 6,0 eingestellt, und dann wird das KuI-turfiltrat durch die Harzsäule für die Adsorption der Leupeptine am Harz geleitet. Nach der Adsorption wird die Säule mit Wasser gewaschen und die adsorbierten Leupeptine werden eluiert. Als Eluierungsmittel kann man niedrige Alkohole, wie Methanol. Äthanol. n-Propanol, Isopropanol. n-ButanoI und Isobutanol: wäßrige niedrige Alkohole: wäßriges Aceton; wäßriges Metha!äihv!keton: organische Lösungsmittel, die angesäuertes Wasser enthalten, und angesäuertes Wasser verwenden. Beispiele von bevorzugten Eluicrungsmittcln sind K)- bis 95%igcs wäßriges Methanol, dessen pH-Wert auf 4,0 oder niedriger mit einer anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäurc. Schwefelsäure. Salpetersäure oder > Phosphorsäure, eingestellt wurde. Eine geeignete Rii.umgcschwindigkeit der Flüssigkeit beträgt 0.5 bis 2.0 bei der Adsorptionsstufe und 0,1 bis 1,0, bevorzugi etwa 0.5. bei der Elutionsstufc. Das Eluat wird in Fraktionen definierten Volumens gesammelt. Der

ι« Leupeptine enthaltende Teil des Eluats wird erhalten, indem man diejenigen Fraktionen, die Anti-Trypsinaktivität. positive Sakaguchi-Rcaktion oder positive Rydon-Smith-Reaklion zeigen, vereinigt. Eine teilweise gereinigte Lösung aus L-Leupcptincn kann

ι "> erhalten werden, indem man die Adsorption und Desorption bei sauren Bedingungen durchführt. Da bis jetzt noch kein wirtschaftliches Verfahren für die Trennung von D- und L-Leupcptincn zur Verfügung steht, ist es erforderlich, für die Herstellung von

-» L-Lcupeptinen durch Fcrmcnlicrung Maßnahmen vorzusehen, die eine Racemisierung von L-Lcupcplinen bei den Fcrmeniicrimgs- und Reinigungsstufen verhindern. Es ist einer der wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß das crfin-

-"> dungsgemäße Verfahren eine wirksame Wiedergewinnung von L-Leupeplinen aus einem Kiilturbrühcnliltrat ermöglicht, das nur L-Leupcptinc enthält. Eine weitere Reinigung der so erhaltenen L-Lcupeptinc kann durch geeignete Kombination bekannter Rcini-

i" gussverfahren, wie Chromatographie bei sauren Bedingungen mit Aktivkohle. Aluminiumoxid (bevorzugt saures Aluminiumoxid) oder Silikagcl. und Extraktion aus einer wäßrigen Lösung mit n-Butanol o. ä. durchgeführt werden.

i> Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel I

Ein Medium, das 2% Glucose. 2% Stärke, 3%

απ Polypcpton. 0.5% NaCl uiiu 0.3% KH₂PO₄ enthält und einen pH-Wert von 7,0 besitzt, wird in 100-ml-Teile geteilt. Jeder 100-ml-Teil wird in einen 500-ml-Schüttkolben gegeben und 20 min bei 120 C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit einer Ρϊ·'ίη-schlaufe-Schrägkultur eines Leupeptine liefernden Siamms (Slreptomyees roseus. MA839-A ί [FERM-P No. 3017: ATCC 31 245]) angeimprt. und dann wird unter Schütteln 2 Tage bei 27 C gezüchtet. 200 ml der entstehenden Kulturbrühe werden zum inoku-

5(i lieren eines 30-l-Kolbenfermentalors verwendet, der 20 I des gleichen Mediums, wie es oben verwendet wurde, enthält. Dann wird 48 h bei 27 C in einer Liifisirömuiigsraie von 20 l/min und unier Rühren bei 400 U/min kultiviert. Proben, die nach einer Züchtung während 24 h, 36 h. 42 h und 48 h entnommen werden, besitzen pH-Werte von 6.7. 6.8. 6.4 bzw. 6.7 und Leupeptin-Potenzen von 35. 230. 420 bzw. 670 mcg/ml.

Die so erhaltene Kulturbrühe wird mit 5% (Gew./

bo Vol.) Filterhilfe vermischt. Dann wird filtriert und der pH-Wert wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 5.5 eingestellt. Man erhält etwa 15 1 Kulturfiltrat. das eine Leupeptin-Potenz von 665 mcg/ml besitzt. 4 1 (Gesamtpotenz = 2660 mg EinheitenTdes

Kulturfihrats werden durch eine mit 100 ml eines nichtionisehers Adsorptionsharz gepackten Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von 1 zur Adsorption der Leupeptine am Harz geleitet. Nach dem Waschen

mit Wasser werden die adsorbierten Leupepline mit 80%igem wäßrigem Methanol, dessen pH-Wert mit Chlorwasserstoflsäure auf 3,0 eingestellt wurde, eluieri. Die aktiven Eluatfrakticmen werden vereinigt, von Methanol durch Destillation bei vermindertem Druck befreit, und der pH-Wert der restlichen Lösung wird mit verdünnter Natriumhydroxidkisung auf 5,5 eingestellt. Man erhält 100 ml einer wäßrigen Lösung mit einer Potenz von 24,5 mg/ml (die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat beträgt 92%X Diese wäßrige L:-ι,γ,ϊ: wird zweimal mit 70 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Extraktschichten werden durch Destillation bei vermindertem Druck unter Zugabe von vYasser von n-Butanol befreit. Man erhält 50 ml einer wSörigen Lösung mit einer Potenz von 47 mg/ml (GesamtpiHCii.z = 2350 mg Einheit; Ausbeute aus dem Kulturfiltrat ='SS.%). Die so erhaltene wäßrige Lösung wird mit verdi.·?,nter ChlorwasserstolTsäure auf einen pH-Wert von 2,0 '^sbracht. Die Lösung wird dann in eine Chromatograpnvesäule, die mit 85 ml Aktivkohle gepackt ist zur Adsorption der Leupeptine geleitet. Die adsorbierten Leupeptine werden mit 20%ige*Ti wäßrigem Aceton eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluats werden vereinigt und von \oeton durch Destillation befreit. Man erhält eine wäßrige Lösung. Diese wäßrige Lösung wird mit einem Poly aminharz aus primären, sekundären und tertiären Aminen (OH-Form) auf pH 5,5 neutralisiert und gefriergetrocknet. Man erhält 3,31 g eines schwachpelben Pulvers mit einer Potenz von 582 meg/mg (Gesamtpotenz = 1926 mg; Ausbeute aus dem Kulturfiltrat = 72%). Das Pulver wird in 30 ml Methanol gelöst, in eine mit 90 g saurem Aluminiumoxid gepackte Säule zusammen mit Methanol gegeben und mit Methanol bei einer Raumgeschwindigkeit von 0,5 entwickelt. Die aktiven Fraktionen des Abstroms werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Das entstehende Pulver wird in Wasser gelöst, die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert und dann wird gefriergetrocknet. Man erhält 1,85 g L-Leupeptinhydrochloride mit einer Potenz von 988 meg/ mg. Die Gesamtpotenz des Pulvers beträgt 1828 mg und die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat beträgt etwa 69%. Der L-Form-Gehalt des Pulvers beträgt 100%.

Beispiel 2

Jeder 100-ml-Teil eines Mediums (pH 6,5), das 2% Glycerin, 1% Polypepton ur.d 1% Fleischextrakt enthält, wird in 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, 30 min bei 120⁰C sterilisiert, mit einer Plalinschlaufe-Schrägkultur von Streptomyces roseus, Ma 839-A I (FERM-P No. 3017; ATCC 31 245) geimpft, und dann wird 24 h bei 27° C unter Schütteln gezüchtet. Man erhält eine vorgezüchtete Brühe. Ein 100-ml-Teil eines anderen Mediums (pH 6,5), das 3% Glycerin, 0,75% L-Leucin,0,75% L-Argininnydrochlorid,0,75% Glycin, 0,5% NH₄NO₃₁O₁^/. K₂HPO₄,0,05% MgSO₄ · 7HiO, 0,05% KCl, 0,2% Ribonukleinsäure und 0,1% Silikon-Entschäumer enthält, wird in einen 500-ml-Kolben gegeben, 30 min bei 120° C sterilisiert und dann aseptisch mit 1 ml der obigen vorkultivierten Brühe inokuliert und 3 Tage bei 27" C auf einer Schüttelkulturvorrichtung, die mit einer Amplitude von 7 cm und mit 210 Hin- und Hergängen/min betrieben wird, kultiviert. Das Fortschreiten der Kultivierung wird in Tabelle VI aufgeführt.

28	72
5,9	5,7
3230	4250

Tabelle VI

Fortschreiten der Kultivierung

Züchtungszeit (h) 24

ρ H-Wert 6,7

Leupeptin (mcg/ml) 1430

Nach 72 h Kultivierung wird die Kulturbrühe zui Entfernung des Myceliums filtriert. Der pH-Werl

ίο des restlichen Filtrats (800 ml) mit einem Leupeptin· t, gehalt von 4070 mcg/ml wird auf 6 eingestellt. Dann >»ird das Filtrat durch eine Säule, die mit 120ml eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymers gepackt ist zur Adsorption des Leupeptins geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser wird das adsorbierte Leupeptir mit 50%igem wäßrigem Methanol mit einem pH-Werl von 2 eluiert. Man erhält 235 ml Leupeptinfraktion Nach der Entfernung des Methanols durch Destillation bei 40⁰C unter "vermindertem Druck aus dei

μ Leupeptinfraktion erhält ?nan 170 ml einer wäßrigen Lösung. Der pH-Wert dieser wäßrigen Lösung wird mit verdünnter, wäßriger Natriumhydroxidlösung aul 5,5 eingestellt. Dann wird dreimal mit 50 m! n-Butanol extrahiert. Die Extraktschichten werden vereinigt und bei 40° ¹C zur Entfernung von n-Butanol als Azeotrop mit Wasser destilliert. Man erhält 100 ml einer wäßrigtir Lösung, die 28 mg Potenz/ml Leupeptin enthält. Der pH-Wert der so erhaltenen wäßriger. Lösung wird mit Chlorwasserstoffsäure auf 2

jp eingestellt..Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird durch eine Säule geleitet, die 100 ml Aktivkohle gepäck'., ist, um das Leupeptin zu adsorbieren. Nach dem Waschen mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure mit einet?, pH-Wert von 2 wird das

adsorbierte Leupeptin mit 2Ö%igem wäßrigem Aceton mit einem pH-Wert von 2 eluieri. Man erhält 210 ml einer Leupeptinfraktion. Diese Leupeptinfraktion wird mit dem in Beispiel 1 verwendeten Polyaminharz (OH-Form) auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und bei vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Man erhält 4,0 g eines fast weißen Pulvers m;' einer Aktivität von 580 meg/mg. Das Pulver wird in Methanol gelöst, dann durch eine Säule geleitet, die 60 g saures Aluminiumoxid, suspendiert in Methanol, enthält, und mit Methanol entwickelt. Man erhält Leupeptinfraktionen. Die vereinigten Leupeptinfraktionen werden bei vermindertem Druck zur Trockene konzentriert; man erhält 2,22 g eines weißen Pulvers des Leupeptinhydrochlorids, das eine Potenz

so von 1000 meg/mg besitzt. Die Ausbeute aus dem Kulturfiltrat beträgt 68%.

Das obige Pulver zeigt eine spezifische Drehung [λ]{? von -75° (c = I, H₂O) und einen Schmelzpunkt von 143 bis I46°C (Zers.). Es zeigt eine positive Sakaguchi-Reaktion, positive Rydon-Smith-Reaklion und negative Ninhydrin-Reaktion. Es zeigt keine spezifische Absorption im ultravioletten Bereich, sondern nur eine Endabsorption. Wie in F i g. 2 dargestellt ist, stimmt das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses Pulvers mit dem von DL-Leupeptin, das nach einem bekannten Verfahren erhalten wurde, übercin.

20 mg der obigen Hydrochloride werden mit 6n-

Chlorwasserstofl'säure in einem verschlossenen Rohr 24 h bei 110⁰C hydrolysiert. Die freie Fettsäure im Hydrolysat wird mit Äthyläther extrahiert. Die Extraktschicht wird konzentriert und unter Verwendung einer mit einem Phenolharz (0,2 bis 0.17 mm) gepackten Säule gaschromatographiert. Man stellt nur

Essigsäure fest. Es wird somit bestätigt, daß das Pulver ein Leupeptrahydrochlorjd ist, das nur Acetyl als Acylgruppe enthält.

Danach werden etwa 200 mg des Hydrochlorids in 8 ml Wasser gelöst. Eine Lösung aus 52 mg Kaliumpermanganat in 2 ml Wasser wird tropfenweise zu der obigen Hydrochloridlösung unter Rühren bei Zimmertemperatur gegeben. Man rührt weitere 2 h, so daß die Oxydation vollständig ablaufen kann. Anschließend wird überschüssiger Kaliumpermanganat mit Natriumthiosullkt neutralisiert Das entstehende Gemisch wird durch eine mit 5 ml Aktivkohle gepackte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser wird die adsorbierte Phase mit 20%igem wäßrigem Aceton mit einem pH-Wert von 2,0 eluiert Man sammelt die Fraktionen, die eine positive Sakaguchi-Reaktion zeigen. Diese Fraktionen werden vereinigt, der pH-Wert wird mit einem Polyaminharz, wie in Beispiel I (OH-Form) auf 5,0 eingestellt und dann wird zur Trockene eingedampft. Man erhält 170 mg eines Pulvers. Das Pulver wird in 1 ml Methanol gelöst und durch eine Säule geleitet, die mit 5 g saurem Aluminiumoxid gefüllt ist, das in Methanol suspendiert ist Dann wird mit 15 ml Methanol und anschließend mit 25 ml 50%igem wäßrigem Methanol mit einem pH-Wert von 3,0 entwickelt. Die abströmenden Fraktionen, die eine positive Sakaguchi-Reaktion ergeben, werden vereinigt. Mit einem Polyaminharz, wie in Beispiel 1 (OH-Form) wird der pH-Wert auf 5,0 eingestellt. Dann wird zur Trockene eingedampft, und man erhält 75 mg Leupeptinsäure (Acyl-L-Leucyl-L-Leucyl-arginin). Etwa 10 mg dieser Leupeptinsäure werden genau .abgewogen, mit 2 ml on-ChlorwasserstofTsäure vermischt und in einem verschlossenen Rohr 24 h bei 110° C hydrolysiert. Die HydroJysatlösung wird zur Trockene eingedampft und in Wasser gelöst. Ein Teil der erhaltenen Lösung wird der Aminosäure-Analyse unterworfen, und es wird eine qualitative und quantitative Analyse der vorhandenen Aminosäuren durchgeführt. Der Rest der Lösung wird nach einem Bioassay unter Verwendung von L-Arginin erfordernden Milchsäure-Bakterien als Testorganismen unterworfen, um den L-Arginingehall zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VII aufgeführt.

Tabelle VII Zusammensetzung der Aminosäuren in dem Hydroxy- IaI von Leupeptinsäure Menge an'für Aminoiäure-Analyse

die Hydrol) «

verwendeter L-Leucin Oesamlarginin L-Arginin

Lcvpeptin-

säure

8,10 mg	3,95 mg	1,56 mg	2,61 mg
	(30,1 μΜοΙ	(14,8 μΜοΙ	(102%, bez.
	Wieder	Wieder	auf Ocsaml-
	gewinnung	gewinnung	arginin)
	89%)	87%)

Aus den obigen Ergebnissen kann man schließen, daß die Leupeptinsäure, die hydrolysiert wurde, L-Leucin und L-Arginin in einem Molverhältnis von 2: I enthält, und kein Valin, isovaiin «.md D-Arginin enthält. Dadurch wird bestätigt, daß ites nach dem

48	72
6,3	5,9
1610	2460

erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Leupeptin eine einzige Verbindung aus Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal ist.

Beispiel 3

100 ml eines Mediums (pH 6,5), das 3% Glycerin, 0,75% L-Leucin, 0,75% L-Argininhydrochlorid,0,75% Glycin, 0,5% NH₄NO₃₁O₁I % K₂HPO₄,0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,5% KCl und 0,1% Silikon-Entschäumer

ίο enthält, wird in einen 500-ml-Kolben gegeben und 30 min bei 130° C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit 1 ml vorkultivierter Brühe, hergestellt auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, inokuliert Dann wird 3 Tage bei 27°C auf einer hin- und hergehenden Schüttelkulturanlage, die mit einer Amplitude von 7 cm und 210 Hin- und Hergängen/min betrieben wird, kultiviert. Das Fortschreiten der Kultivierung wird in Tabelle VIII aufgeführt.

μ Tabelle VIII

Fortschreiten der Kultivierung Kultivierungszeit, h 24

pH-Wert 6,6

L-Leupeptin (mcg/ml) 830

Aus dem Kulturfiltrat (2350 rncg/ml, 800 ml) wird L-Leupeptin auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, extrahiert. Man erhält 1,22 g L-Leupeptinhydrochlorid.

Beispiel 4

100 ml Medium (pH 6,5), das 3% Glucose, 0,75% L-Leucin, 0,75% L-Argininhydrochlorid, 0,75% GIy ein, 0,8% (NH₄J₂SO₄,0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄- 7H₂0,0,05% KCI, 0,2% Ribonucleinsäure und 0,1% Silikon-Entschäumer enthält, werden in einen 500-ml-Kolben gegeben und 30 min bei 120° C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit 1 ml Impikultur brühe, hergestellt auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, inokuliert, und dann wird 3 Tage bei 27° C auf einer hin- und hergehenden Schü ttelkulluivorrichtung, die mit einer Amplitude von 7 cm und 210 Hin- und Hergängen/min betrieben wird, kulti viert. Das Fortschreiten der Kultivierung ist in Ta belle IX aufgeführt.

Tabelle IX Fortschreiten der Kultivierung Kultivicrungszeit, h 24

pH-Wert —

L-Leupeptin (mcg/ml) —

48	72
4,8	7,0
3170	4050

Aus dem Kulturfiltrat (3880 mcg/ml, 800 ml) wird L-Leupeptin auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, extrahiert. Man erhält 1,96 g L-Leupeplinhydrochlorid.

Beispiel 5

Je ein 100-ml-Teil eines Mediums (pH 6,5), das 3% Glycerin, 2% Peptön, 0,5% L-Leucin, 0,5% L-Argininhydrochlorid, 0,5% Glycin, 0,5% NaCI, 0,2% KH₂PO₄, 0,1% Ribonucleinsäure und 0.05% Silikon-Entschäumer enthält, wird in 500-ml-Kolben gegeben und 20 min bei 120⁰C sterilisiert. Jeder Teil wird dann mit I ml vorkultiviertcr Brühe, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, inoku-

lien. Dann wird 3 Tage bei 27°C auf einer Schüttelkulturanlage, die bei einer Amplitude von 7 cm und 210 Hin- und Hergängen/min betrieben wird, kultiviert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle X aufgeführt.

Tabelle X

Fortschreiten der Kultivierung

Kultivierungszeit, h	24	48	72
pH-Wert	6,5	6,3	6,6
L-Leupeptin (mcg/ml)	1060	2580	3870

Aus dem Kulturfiltrat (3700 mcg/ml, 800 ml) wird L-Leupeptin auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, isoliert. Man erhält 1,93 g L-Leupeptinhydrochlorid.

Beispiel 6

201 eines Mediums (pH 6,5), das 3% Glycerin, 0,75% L-Leucin,0Jj% L-Argininhydrochlorid, 0,75% Glycin, 0,5% NH₄NOj₁O^Vu K₂HPO₄,0,05% MgSO₄-7H₂0,0,05% KCl, 0,2% Ribonucleinsäure und 0,05%

Silikon-Entschäumer enthält, werden 30 min bei 120° C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wird mit 200 ml Impfkulturbrühe, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, inokuliert. Dann wird 48 h bei 27°C unter den folgenden Bedingungen kultiviert: Geschwindigkeit des Rührers = 400 U/min; Luftströmungsrate = 20 l/min. Das Fortschreiten der Kultivierung wird in Tabelle XI aufgeführt.

Tabelle XI

Kultivierungs- 24 26 42 48

zeit, h

pH-Wert 6,5 5,0 5,3 5,5

L-Leupeptin 1550 3400 4250 4450

(mcg/ml)

Aus dem Kulturfiltrat (4350 mcg/ml, jeweils 800 ml) wird L-Leupeptin auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, isoliert, wobei ein Styrol-Divinylbenzolcopolymer, ein Acrylesterpolymer und ein Phenolharz verwende! wurden und 2^2 g, i,80g bzw. 2,01g L-Leupeptinhydrochlorid erhalten wurden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. ι 2

   Patentansprüche:
   I. Verfahren zur Herstellung von L-Leupcptinen der allgemeinen Formel

   R-. R₁ CHO NI!

   Γ I I //

   R₃CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CH₁CH₁Ch₁NH-C