WO1998013375A1 - Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer wirkung, herstellungsverfahren, mittel und dsm 11 092 - Google Patents

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WO1998013375A1
WO1998013375A1 PCT/EP1997/005095 EP9705095W WO9813375A1 WO 1998013375 A1 WO1998013375 A1 WO 1998013375A1 EP 9705095 W EP9705095 W EP 9705095W WO 9813375 A1 WO9813375 A1 WO 9813375A1
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Hans Reichenbach
Gerhard Höfle
Florenz Sasse
Heinrich Steinmetz
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the invention relates to a chemical compound of the formula
  • the invention relates to a chemical compound of the formula
  • the invention relates to a chemical compound of the empirical formula C43H65N5O10S and with the following parameters:
  • UV spectrum (methanol) lambda max (log epsilon): 225 (4.20), 250 (3.86) and 280 (3.20);
  • the invention relates to a chemical compound of the empirical formula C42H63N5O10S and with the following parameters
  • UV spectrum (methanol) lambda max (log epsilon): 225 (4.23), 250 (3.91) and 280 (3.26);
  • the invention relates to a chemical compound of the empirical formula C41H61N5O10S and with an R t value (HPLC) under the following conditions: Column: Nucleosil 100 C-18, 7 ⁇ m, 125 x 4 mm;
  • the invention relates to a chemical compound having an anti-ycotic and cytotoxic effect, which can be obtained by
  • the concentrate obtained is chromatographed on a reverse phase with methanol / ammonium acetate buffer and by detection in the UV at 226 nm
  • the invention relates to a process for the production of chemical compounds with antifungal and cytostatic activity, characterized in that
  • the concentrate obtained is chromatographed on a reverse phase with methanol ammonium acetate buffer and by detection in the UV at 226 nm
  • the invention relates to an antifungal agent containing a compound according to the invention.
  • the invention relates to a cytostatic agent containing a compound according to the invention.
  • an embodiment of the invention relates to Archangium gephyra DSM 11 092.
  • the bacterium Archangium gephyra belongs to the order of the Myxococcales (Myxobacteria), subordinate to Cystobacterineae, family Archangiaceae.
  • Myxobacteria Myxobacteria
  • Cystobacterineae family Archangiaceae.
  • the Archangium gephyra Ar 315 production line was founded in February 1973 by Dr. Reichenbach from a sample of a compost heap in the botanical garden in Freiburg, German country isolated. It was deposited with the German Collection of Microorganisms (DSM) in 1996 under the number DSM 11 092.
  • the stock is kept on agar plates, preferably on yeast agar (VY / 2 agar).
  • This medium contains 0.5% baker's yeast, 0.1% CaCl2 x 2H2O, 0.1 ⁇ g / 1 cyanocobalamin and 1.2% agar.
  • the pH is adjusted to 7.4.
  • the medium is sterilized by autoclaving.
  • the plate cultures are incubated at 30 ° C.
  • the vegetative cells are long, slim rods, about 6 to 9 ⁇ m long and 0.8 ⁇ m thick. Due to the sliding movement of the bacteria, the colonies spread quickly over the culture plate.
  • the swarm colony on Hefeagar is thin, film-like, reddish brown.
  • the yeast cells in the medium are broken down, as can be seen from the clarification plant that is being built around the colonies.
  • the stem often forms pale brown fruiting bodies on this medium, which are made up of meandering ridges and contain strongly refractive myxospores. The latter are short, thick, somewhat irregular sticks, about 2.5 to 4 mm long and 1.2 to 1.8 mm thick.
  • the Ar 315 strain produces substances, namely tubulysins, that inhibit the growth of fungi, human cancer cells and other animal cell cultures.
  • the inhibitors can be isolated both from the cells and from the culture supernatant.
  • a typical Fermen- The process proceeds as follows: A fermentor with a working volume of 350 1 is filled with 300 1 culture medium (composition: 0.5% probion (single-cell protein from Hoechst); 1.0% starch (Cerestar Krefeld); 0.2% glucose; 0 , 1% yeast extract; 0.1% MgS0 4 x 7H 2 0; 0.1% CaCl 2 x 2H 0; 0.1 ⁇ g / 1 cyanocobalamin; alternatives to probion are soy flour or corn glue). The pH is adjusted to 7.4 with KOH.
  • composition 0.5% probion (single-cell protein from Hoechst); 1.0% starch (Cerestar Krefeld); 0.2% glucose; 0 , 1% yeast extract; 0.1% MgS0 4 x 7H 2 0; 0.1% CaCl 2 x 2H 0; 0.1 ⁇ g / 1 cyanocobalamin; alternatives to probion are soy flour or corn glue).
  • the pH is adjusted to 7.4
  • 1% (v / v) of an adsorber resin (Amberlite XAD-16, Rohm & Haas) is added to the medium. Inoculation is carried out with 10 l of a 3-day-old preculture which was produced in the same medium in a correspondingly smaller fermenter. Is fermented at 30 ° C with a stirring speed of 150 U / min and an aeration rate of 10 vol .-% per min. Initial foam formation is prevented by adding 50 ml silicone anti-foam (e.g. Tegosipon, Goldschmidt AG, Essen). The pH increases during the fermentation. The increase is achieved by adding 5 percent. Sulfuric acid limited to 7.8. The fermentation is ended after 5 days.
  • an adsorber resin Amberlite XAD-16, Rohm & Haas
  • the adsorber resin is separated from the culture in a process filter (0.7 m, 100 mesh) and eluted with 15 l of methanol in the course of 3 h.
  • the eluate is concentrated under vacuum until the water phase occurs, which is then extracted three times with ethyl acetate. After concentrating the organic phase in vacuo at a bath temperature of 30 ° C., 36 g of crude extract are obtained.
  • tubulysin A After evaporating the combined fractions containing tubulysin A, tubulysin B and tubulysin C to the water phase, the mixture is extracted with ethyl acetate and, after evaporation in vacuo and drying, 420 mg of tubulysin A, 240 mg of tubulysin B and 20 mg of tubulysin C.
  • UV (methanol) lambda max (log epsilon) 225 (4.20); 250 (3.86); 280 (3.30)
  • UV (methanol) lambda max (log epsilon) 225 (4.23); 250 (3.91); 280 (3.26)
  • IR KBr 3421; 2964; 2935; 2878; 1742; 1667; 1550; 1517; 1235 cm "1
  • tubulysins have a cytostatic effect on fungi, human cancer cell lines and other animal cell cultures (see table). They lead to a rapid breakdown of the microtubule scaffold in the cells. The actin skeleton remains intact. Under the influence of the tubulysins, adherently growing L929 mouse cells increase their cell volume without dividing and develop large cell nuclei, which then disintegrate in an apoptotic process.
  • Agardif fusion test 20 ⁇ g per test plate with a diameter of 6 mm

Abstract

Die Erfindung betrifft chemische Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung aus dem Archangium gephyra-Stamm DSM 11 092, Mittel mit den Verbindungen und dem Stamm.

Description

Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung, Herstellungsverfahren, Mittel und DSM 11 092
Gemäß einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine chemische Verbindung der Formel
Figure imgf000003_0001
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine chemische Verbindung der Formel
Figure imgf000004_0001
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine chemische Verbindung der Summenformel C43H65N5O10S und mit den folgenden Parametern:
1H-N R-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin A) ; 13C-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin A) ;
UV-Spektrum (Methanol) lambdamax (log epsilon) : 225 (4,20), 250 (3,86) und 280 (3,20) ;
IR-Spektrum (KBr) ny: 3390, 2959, 2934, 2876, 1747, 1667, 1553, 1515 und 1233 cm-1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine chemische Verbindung der Summenformel C42H63N5O10S und mit den folgenden Parametern
1H-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin B) ; 13C-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin B) ;
UV-Spektrum (Methanol) lambdamax (log epsilon): 225 (4,23), 250 (3,91) und 280 (3,26) ;
IR-Spektrum (KBr) ny: 3421, 2964, 2935, 2878, 1742, 1667, 1550, 1517 und 1235 cm"1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine chemische Verbindung der Summenformel C41H61N5O10S und mit einem Rt-Wert (HPLC) unter folgenden Bedingungen: Säule: Nucleosil 100 C-18, 7 μm, 125 x 4 mm;
Laufmittel : Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH
5,0) + 10 M Natriumdodecylsulfat;
Fluß: 1 ml/min;
Detektion: Diodenarray.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine chemische Verbindungen mit anti ykotischer und cytotoxischer Wirkung, dadurch gewinnbar, daß man
(a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wassrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel-Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und
(c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und
(d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt,
(e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Metha- nol/Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm
(el) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrennt,
(f) von der gemäß (el) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt, (g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und (h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt .
Diese Verbindungen können dadurch gewinnbar sein, daß man bei Stufe (e) an einer C^s -Umkehrphase chromatographiert .
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von chemischen Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wässrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel-Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und
(c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und
(d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt,
(e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Methanol Ammoniumacetat-Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm
(el) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrennt , (f) von der gemäß (el) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt,
(g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und
(h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsfo m betrifft die Erfindung ein antimykotisches Mittel mit einem Gehalt an einer erfindungsgemäßen Verbindung .
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein cytostatisches Mittel mit einem Gehalt an einer erfindungsgemäßen Verbindung .
Schließlich betrifft eine Ausführungsform der Erfindung Archan gium gephyra DSM 11 092.
Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Angaben und 3 Figuren (Strukturformeln) näher erläutert.
A. Produktionsbedingungen
A.l. Produktionsstamm
Das Bakterium Archangium gephyra gehört zur Ordnung der Myxococ- cales (Myxobakterien) , Unterordnung Cystobacterineae, Familie Archangiaceae. Der Produktionsstamm Archangium gephyra Ar 315 wurde im Februar 1973 von Dr. Reichenbach aus einer Probe von einem Komposthaufen im Botanischen Garten in Freiburg, Deutsch- land, isoliert. Er wurde 1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) unter der Nr. DSM 11 092 hinterlegt.
A.2. Sta_mmkultur
Die Stammhaltung erfolgt auf Agarplatten, bevorzugt auf Hefe- Agar (VY/2-Agar). Dieses Medium enthält 0,5 % Bäckerhefe, 0,1 % CaCl2 x 2H2O, 0,1 μg/1 Cyanocobalamin und 1,2 % Agar. Der pH- Wert wird auf 7,4 eingestellt. Das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert. Die Plattenkulturen werden bei 30 °C bebrütet.
A.3. Morphologische Beschreibung
Die vegetativen Zellen sind lange, schlanke Stäbchen, etwa 6 bis 9 μm lang und 0,8 μm dick. Bedingt durch die Gleitbewegung der Bakterien, breiten sich die Kolonien rasch über die Kulturplatte aus. Die Schwarmkolonie auf Hefeagar ist dünn, filmartig, rötlich braun. Wie an dem um die Kolonien entstehenden Klärhof zu erkennen, werden die Hefezellen im Medium abgebaut. Auf diesem Medium bildet der Stamm oft blaßbräunliche Fruchtkörper, die aus mäandrierenden Wülsten aufgebaut sind und stark lichtbrechende Myxosporen enthalten. Letztere sind kurze, dicke, etwas unregelmäßige Stäbchen, etwa 2,5 bis 4 mm lang und 1,2 bis 1,8 mm dick.
A.4. Leistungen
Der Stamm Ar 315 produziert Substanzen, nämlich Tubulysine, die das Wachstum von Pilzen, humanen Krebszellen und anderen tierischen Zellkulturen hemmen. Die Hemmstoffe können sowohl aus den Zellen wie auch aus dem Kulturüberstand isoliert werden.
A.5. Produktion der Tubulysine
Die Substanzen werden während der logarithmischen bis hin zur stationären Wachstumsphase produziert. Eine typische Fermen- tation verläuft wie folgt: Ein Fermentor mit 350 1 Arbeitsvolumen wird mit 300 1 Kulturmedium gefüllt (Zusammensetzung: 0,5 % Probion (Einzellerprotein der Fa. Hoechst); 1,0 % Stärke (Cerestar Krefeld) ; 0,2 % Glucose; 0,1 % Hefeextrakt; 0,1 % MgS04 x 7H20; 0,1 % CaCl2 x 2H 0; 0,1 μg/1 Cyanocobalamin; Alternativen zu Probion sind Sojamehl oder Maiskleber) . Der pH- Wert wird mit KOH auf 7,4 eingestellt. Zur Bindung der ins Medium freigesetzten Hemmstoffe wird dem Medium 1 % (V/V) eines Adsorberharzes (Amberlite XAD-16, Rohm & Haas) zugesetzt. Beimpft wird mit 10 1 einer 3 Tage alten Vorkultur, die im gleichen Medium in einem entsprechend kleineren Fermentor erzeugt wurde. Fermentiert wird bei 30 °C mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min und einer Belüftungsrate von 10 Vol.-% pro min. Anfängliche Schaumbildung wird durch Zugabe von 50 ml Silikon- Antischaum (z. B. Tegosipon, Goldschmidt AG, Essen) verhindert. Der pH-Wert steigt im Laufe der Fermentation an. Der Anstieg wird durch Zugabe von 5-proz. Schwefelsäure auf 7,8 begrenzt. Die Fermentation wird nach 5 Tagen beendet.
B. Isolierung von Tubulysin A, B und C
Das Adsorberharz wird in einem Prozeßfilter (0,7 m , 100 Maschen (mesh) ) von der Kultur abgetrennt, und mit 15 1 Methanol im Verlauf von 3 h eluiert . Die Konzentration des Eluates erfolgt unter Vakuum bis zum Auftreten der Wasserphase, die anschließend dreimal mit Ethylacetat extrahiert wird. Nach Einengen der organischen Phase im Vakuum bei 30 °C Badtemperatur erhält man 36 g Rohextrakt .
Dieser Rohextrakt wird durch LH-20-Gelchromatographie (Säule: d = 20 cm, 1 = 100 cm, Fluß 45 ml/min, Detektion 226 nm) mit dem Laufmittel Methanol nach UV-Banden in 6 Fraktionen aufgetrennt, wobei Tubulysin A, B und C in der 2. Fraktion von 110 bis 130 min enthalten sind. Nach Einengen der betreffenden Fraktion trennt man in 3 Portionen auf einer Eurosil-Bioselect (100-20-C- 18) -Säule (d = 4 cm, 1 = 48 cm) mit dem Laufmittel Methanol/O, 05 M Ammoniumacetat -Puffer (pH 7,0) = 60/40 und einem Fluß von 8 ml/min. Die Detektion erfolgt bei 226 nm. Rt Tubulysin C 245 bis 260, Tubulysin B 260 bis 285 min, Tubulysin A 300 bis 320 min.
Nach Eindampfen der vereinigten Tubulysin A, Tubulysin B und Tubulysin C enthaltenen Fraktionen bis zur Wasserphase extrahiert man mit Ethylacetat und erhält nach dem Eindampfen im Vakuum und Trocknen 420 mg Tubulysin A, 240 mg Tubulysin B und 20 mg Tubulysin C.
Tubulysin A
C43H65N5O10S [843]
DCI-MS (positiv-Ionen): 844.4543 für [M+H] +
^-H- und 13C-NMR siehe Tabellen 1 und 2
UV (Methanol) lambdamax (log epsilon) = 225 (4.20); 250 (3.86); 280 (3.30)
IR KBr: ny = 3390; 2959; 2934; 2876; 1747; 1667; 1553; 1515; 1233 cm"1
DC: Rf = 0.27
DC-Alufolie 60 F254 Merck. Laufmittel: Dichlormethan/Methanol =
9:1
Detektion: UV-Löschung bei 254 nm
HPLC: R = 9.7 min
Säule: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 x 4 mm
Laufmittel: Methanol/Wasser = 70/30 + 2mM Ammoniumacetat (pH 5.0)
+ 10 mM Natrium-dodecylsulfat
Fluß: 1 ml/min Detektion: Diodenarray
Tubulysin B
C42H63N5O10S [829]
DCI-MS (positiv-Ionen): 830.4361 für [M+H] +
XH- und 13C-NMR siehe Tabellen 1 und 2
UV (Methanol) lambdamax (log epsilon) = 225 (4.23); 250 (3.91); 280 (3.26)
IR KBr: ny = 3421; 2964; 2935; 2878; 1742; 1667; 1550; 1517; 1235 cm"1
DC: Rf = 0.25
DC-Alufolie 60 F254 Merck. Laufmittel: Dichlormethan/Methanol =
9:1
Detektion: UV-Löschung bei 254 nm
HPLC: Rt = 7.3 min
Säule: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 x 4 mm
Laufmittel : Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH 5.0!
+ 10 mM Natrium-dodecylsulfat
Fluß: 1 ml/min Detektion: Diodenarray
Tubulysin C
C41H61N5O10S [815]
ESI-MS (positiv-Ionen) : 816.6 für [M+H]
HPLC : Rt = 6.8 min
Säule: Nucleosil 100 C-18 7 μm, 125 x 4 mm.
Laufmittel : Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH 5,0)
+ 10 mM Natrium-dodecylsulfat
Fluß: 1 ml/min Detektion: Diodenarray
Tabelle 1 Η-NMR data of tubulysines in [D6] DMSO (600 MHz)
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Tabelle 2 13C-NMR data of tubulysines in [D6] DMSO (600 MHz)
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
*δc gemessen bei 80° C
C . Wirkung
Die Tubulysine haben eine cytostatische Wirkung auf Pilze, humane Krebszellinien und andere tierische Zellkulturen (vgl. Tabelle). Sie führen in den Zellen zu einem raschen Abbau des Mikrotubuli- Gerüsts. Das Aktinskelett bleibt erhalten. Adhärent wachsende L929-Maus-Zellen vergrößern unter dem Einfluß der Tubulysine ihr Zellvolumen, ohne sich zu teilen, und entwickeln große Zellkerne, die dann in einem apoptotischen Vorgang zerfallen.
Wirkungsspektrum
Figure imgf000018_0001
Agardif fusionstest : 20 μg pro Testblättchen von 6 mm Durchmesser
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Figure imgf000019_0002

Claims

Patentansprüche
1. Chemische Verbindung der Formel
Figure imgf000020_0001
2. Chemische Verbindung der Formel
Figure imgf000021_0001
3. Chemische Verbindung der Summenformel C43Hg5N5θιos und mit den folgenden Parametern:
1H-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin A) ; 13C-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin A) ;
UV-Spektrum (Methanol) lambdamax (log epsilon): 225 (4,20), 250 (3,86) und 280 (3,20) ;
IR-Spektrum (KBr) ny: 3390, 2959, 2934, 2876, 1747, 1667, 1553, 1515 und 1233 cm-1.
4. Chemische Verbindung der Summenformel C42Hg3 5θ^Qs und mit den folgenden Parametern
1H-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin B) ,- 13C-NMR-Spektrum gemäß Tabelle 1 (Tubulysin B) ;
UV-Spektrum (Methanol) lambdamax (log epsilon): 225 (4,23), 250 (3,91) und 280 (3,26) ;
IR-Spektrum (KBr) ny : 3421, 2964, 2935, 2878, 1742, 1667, 1550, 1517 und 1235 cm"1.
5. Chemische Verbindung der Summenformel C4χHg. N5θιos und mit einem Rt-Wert (HPLC) unter folgenden Bedingungen:
Säule: Nucleosil 100 C-18, 7 μm, 125 x 4 mm;
Laufmittel: Methanol/Wasser = 70/30 + 2 mM Ammoniumacetat (pH
5,0) + 10 mM Natriu dodecylsulfat;
Fluß: 1 ml/min,•
Detektion: Diodenarray.
6. Chemische Verbindungen mit antimykotischer und cytotoxischer Wirkung, dadurch gewinnbar, daß man
(a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wässrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff-Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel-Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und
(c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und
(d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt,
(e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Metha- nol/Ammoniumacetat -Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm
(el) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrenn ,
(f) von der gemäß (el) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt,
(g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und
(h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt.
7. Chemische Verbindungen nach Anspruch 5, dadurch gewinnbar, daß man bei Stufe (e) an einer C^8-Umkehrphase chromatographiert .
8. Verfahren zur Gewinnung von chemischen Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) Archangium gephyra DSM 11 092 in einem wässrigen Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoff -Quellen, Stickstoff-Quellen, Schwefel -Quellen, Cyanocobalamin und Mineralsalzen aerob in Gegenwart eines Adsorberharzes kultiviert und
(b) das Adsorberharz vom Kulturmedium abtrennt und mit Methanol eluiert und vom Eluat das Methanol abzieht und
(c) die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, den Extrakt einengt und einen Rohextrakt gewinnt und
(d) den Rohextrakt einer Gelchromatographie mit Methanol als Laufmittel unterwirft und ein oder mehrere Fraktionen mit einem Gehalt an Verbindungen mit antimykotischer und cytostatischer Wirkung im UV bei 226 nm detektiert, abtrennt und einengt,
(e) das gewonnene Konzentrat an einer Umkehrphase mit Methanol Ammoniumacetat -Puffer chromatographiert und durch Detektion im UV bei 226 nm
(el) eine Fraktion mit einer rascher laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e2) eine Fraktion mit einer langsamer laufenden Verbindung sowie, zeitlich getrennt,
(e3) eine Fraktion mit einer noch langsamer laufenden Verbindung abtrenn ,
(f) von der gemäß (el) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt,
(g) von der gemäß (e2) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt und (h) von der gemäß (e3) gewonnenen Fraktion das Methanol abzieht, die zurückbleibende Wasserphase mit Ethylacetat extrahiert, eindampft und trocknet und die Verbindung gewinnt .
9. Antimykotisches Mittel mit einem Gehalt an einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche l bis 7.
10. Cytostatisches Mittel mit einem Gehalt an einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
11. Arci.angiu.Ti gephyra DSM 11 092.
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