DE2024324A1 - YL 704 Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE
DR. MOLLER-BORE - DR. MANlTZ . DR
DIPL-INQ. F₁NSTERWALD . DIPL-ING G

8MONCHEN₂₂₁ROBERT-KOCH-STRi TELEFON 225110

29.0kt.197f

Wth - T 1047

SETIJJSU CO. ι UfD.,

21, Do«korn»chi 3-chome, &Lgashi~ku, Osaka,

Japan

YX 704-Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung

Prioritätj Japan vom 19ο Mai 1969 Hr. 38 648/69

Sie Erfindung betrifft eine Beihe von neuen makroliden Antibiotika, welche insgesamt als IL 704 bezeichnet werden, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung· Sie betrifft ebenfalls ihre Herstellung durch Fermentierung, ihre Konzentrierung, ihre Isolierung und dio Herstellung ihrer Salze· Sarüberhinaus betrifft sie die Antibiotika in verdünnter Form, als Bohkonzentrate und in reinen Tozbüb· Biese Produkte sind neu und besonders zur Inhibierung des Vachstume von grampositiven Bakterien wirksam.

Der XL· 704-erzeugende Stamm der Erfindung wurde aus einer Bodenprobe isoliert, welche in Saipeh, Chinesische Sepublik (Formosa) entnommen wurde. Der Staas wurde als ein

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BAD ORIGINAL

Varianten-Stamm wn St»®pt©saye®s plat©nsiffi durch seine morphologischen und pliyeiologischen Eigenschaften sowie seine Züchtungseigeneeliaften bestimmt. Sine entwicklungsfähige Kultur des ffikroorganismuB wurd® beim "Agricultural Research Service Culture Collection" des "United States Department of Agriculture, !Pretoria» Illinois, U.S.A." unter der Eingangsmuemex¹ MHXi 5761 niedergelegt·

Streptomycea ep HKBL 3?β1 a®±fffe die £<©£$eBä«ä alksobiologisohen Sigeaeehaften:

Morphologische,.

Auf einer Vielsahl von Fslhrbdd«& s®ist te? Strnm besonderes Wachstum von Aktinom7is@t®&_f wobei

gebildet werden» Bei d@r mikroikopieuiiem Bwbachtung geben sich kompakt« Op.Lmum;, die in &m Xiiiftm^elen gebildet werden. Pie Konidioplioren w@rd©3ä in. Ketten vou nicht weniger als zehn, elliptischen bis %3r3Lindriechen Bpo'r^a-ssit einer Größe you 0,6 bis ^₉Q μ gebildet· Bie Oberfläche der Sporen ist glatt. Me Sporen ballen sich häufig unter Bildung Bchwarser, feuchter (hygroskopischer) SSpopeasassen summen, wobei sie manchmal ein® achwars® Feuchtigkeit auf der Oberfläche bilden«

Die Zahlen in Hämmern entsprechen dea ΪaÄtoaw®a?ten, die in "Color Bmxaow^ Hüffiy»l^K ₉ 3» Auflage, herau^gegebea tob "Container Cooperatioa of

(1) Csa®<ak-IHxpl8itte (bei )

alt

lösliche»

BADOBtQlNAL

(2) Asparagin-GlucoBe-Hährplatte (bei 27° C) t Farbloses Wachstum mit schwach gelblich-brauner (4gc) Rückseite) Ausbildung weißer bis leicht bräunlich-grauer (3fe) pulverförmiger Luftmyzelej Bildung eines gräulich-roten (6 1/2 Ig), löslichen Pigmentes·

(3) XalsiuMaleat-nShrplatte (bei 27° C) s Farblo··· Wachs tu« mit schwach gelber (2db) Rückseite| Ausbildung weißer bis gräulich-gelbbrauner (3ge), pulverförmiger I/uf tmyzele. Diese Myzele werden später feucht und entwickeln eine dunkle, schmierige (hygroskopische) Masse von Sporen; keine Bildung eines löslichen Pigmente·.

(4) Csapek-GlucoBe-IitratlSsung (bei 27° C) t Blaßgelbes (2db) ringförmiges Wachstumj Ausbildung weißer, pulverförmiger I/uftmyzelej Bildung ein·· blaßgelben (2fb), löslichen Pigmentes·

(5) Hähr-Schrägagar (bei 37° C): Farbloses bis leicht bräunlich-graues (2ec) Wachstum mit blaßgelber (2db) Rückseite; Ausbildung gräulich-weißer (b) Luf tmyzele $ keine Bildung eines löslichen Pigment···

(6) Glucose-nähr-Schrafsagar (bei 37° C): Blaßgelbes, (2db) bis leicht bräunlich-graue· (2ec) Wachstum mit gelblichbrauner (3ne) Bückeeitet Ausbildung weißer bis leicht bräunlich-grauer (3fe) Luftmytselej keine Bildung ein·· löslichen Pigmentes·

(7) Coaguliertee Loeffler-ßerum (bei 57° C)ι Blaßgelbee (3ba) bis leicht bräunlich-graues (2do) Wachstumi Ausbildung gräulich-weißer (b), pulTerförmiger Luftmyselei keine BUdung eine· löslichen Pigmente··

(8) Kartoffelprob· (bei 37° O) t Blaßgelbee (2db) bis blaßbraunes (2fb) Wachstumj Ausbildung weißer, pulverförmiger

Luf tmyzele; keine Terlnderung der Farbe der Kartoffelunterlag··

- 3-

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BAD ORIQiNAL

(9) Pepton-Glucose-Agarplatte (bei 57° C): Farbloses bis leicht bräunlich-graues (2ec) Wachstum mit hellbrauner (4pg) Rückseite} Ausbildung weißer bis gräulich-weißer (b) Luftmyzel e; keine Bildung eines löslichen Pigmentes·

(10) Ei-HShrmedium (bei 57° G) ι Blaßgelbes (2db) Wachstum; Ausbildung weißer bis gräulich-weißer (b), pulverförmiger Luftmyzele; keine Bildung eines löslichen Pigmentes·

(11) Gelatinestrich (bei 20° C): Farbloses Wach«tu»ι keine Ausbildung eines Luftmyeelsj kein® Bildung eines 15 el ich en Pigmentes·

(12) Btärke-Agarplatte (bei 2?° C)s Blaßg@lblich-braunes (2gc) bis.; blaßbraunes (4ge) Wachstum mit blaßbrauner (5ge) Rückseite; Ausbildung leicht bratalioh-gvtuer (2fe) Luftmele« Diese Myzele werden später feucht und «entwickeln eine dunkle, schmierige Hasse von Sporen,! Ausbildung eines blaßbraunen (4gc), löslichen Pigmentes mit pH-ansseigendor Eigenschaft.

(13) Tyrosin-Agarplatte (bei 27° G) ι Blaßbraunes (4®c) bis braunes (41g) Wachstum mit leicht brauner (3^i) Bückseite) Ausbildung weißer bis bräunlich«grauer (^fe)_f pulTerförmiger Luftmysele; Bildung eines blaßrötlich-braunen (5ge), löslichen Pigmentes mit pH-a&zeigender Eigensohaft»

(14) Lackmusmilch (bei 37° C): Farbloses bis blaßgelbes (2ba) Wachstum; keine Auebildung von Luftmyzel; Wechsel der Farbe des Mediums nach rötlichgrau (6ge).

(15) Gellulosemedium (bei 27° C) ι Kein Wachstum.

(16) Bennett-Schrägagar (b@i 27° C)s Faxblos©e Wachstum

mit gelblich-braun©? (3ni) Eückeeite; in der Ausbildung von gräulich-gelbbrau&en (3g©)« bis samtartigen Ißiftayaelea«, Bieee© l%sel wlaecl in am Heifunge« phase bräunüßli-gr-sw (5^©)« wotei

Flecke mit allmählicher Ausbreitung über die gesamte Oberfläche gebildet werden; Erzeugung eines blaBgelblich-braunen (3ec), löslichen Pigmentes.

Verwendung von Kohlenstof £ quellen* Als Kohlenstoff quelle für die Stibine wurden Armbinoae, Xylose, Glucose, Mannose, Maltose, Fructose, Saccharose, Inosit, Raffinose, Galactose, Stärke, Glycerin und Mannit verwendet, jedoch werden Lactose, Rhamnose und Salisln hler nicht verwendet.

Physiologische Eigenschaften: Der Stamm ist positiv bei der ßtärkehydrolyae, der litrat-

reduktion» der MilchGoagulierung und der Milchpeptoniiierung und negativ bei der GelatineverflüSBlgung, der Tjrosinase reaktion, der Cellulasereaktion und bei der ohromogenen Wirkung·

Jemperatmp \vnfl pH-Wert fflr* das Waohstm» Der Stamm ist aerob und seigt ein gutes Wachstum bei 37° C in einem pH-Bereich von 6,0 bis 8,0. Xr wachet ebenfalls bei einem pH von 5t0 und 9,0 bei derselben Temperatur. Bei 27° C wächst er in einen pH-Bereich von 5,0 bis 9,0. Jedoch kann kein Wachstum bei eine» pH-Wert von 4,0 unabhängig von der Temperatur und bei 0° C oder 50° C unabhängig vom pH-Wert beobachtet werden.

Gemäß der Systematik von Aktinomyseten werden die Stimme, deren luftmysele feucht werden und eine dunkle, schmierige (hygroskopische) Sporenmasse in der Reifungephase ausbilden, in die Gruppe Streptomyces hygrosooplcum klassifiziert. lach der Mikromorphologie Ihrer Sporen werden die Stänme dieser Gruppe welter unterteilt in swei Gruppen, d. h. Stimm· tob

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BADORlGfNAL

Typ Streptomyces hygroecopicus und Stämme vom Typ Streptomycee platenais (H.D. Treuer et al., Applied Microbiologyι Vol*15i Ho· 3, B. 637 - 639 (1967); Alma Dietss et al., ibidj YoI. 16; Vr. 6} S. 935 · 941 (1968) _β Aus den oben genannten Eigenschaften ist festzulegen, da£ Streptomyces sp. HBRL 3761 •in ßtamm iron Typ Strepto»ycee platensis ist· Die folgenden Stan»· sind bisher als su dieser Untergruppe gehörend bekannt ι Str. platensis, 8tr. hyprascopicus var· decoieus, Str. hygroscopicus Tar· angustayceticus« Str. hygroscopieus forma, glebosus, 8tr. hygrosoopieus mr. osesByceticue, 8tr· hygroscopicue Tar· odoratas und ßtr. humidue. Jedoch sind diese Stibme Bit Ausnahme von StreptoBgrees platis^iis offensichtlich von Streptomycee sp· BlBL 3761 ia iliren fdJcromosephologisohen Blgeneohsften Terschiedaoa« ßtrepütagpees platensie ist ebenfalls Ton Strepton9«@ß ep ο IBlL 3761 durch s«tne IQokseitaa» farben auf den syntli^tiieliigi Medien unä die farbem des löaliohem Fignentes Yweehieden» Trots solcher Unterschiede siiäd jedoch Stroptoayoefl platssieiii tand Streptonyces- sp» HlL 3761 in anderen Bigeaseliaft« üinli^, einschlieBlieh der ■orphologischen und pliyüioleglsdliatä HgennahAften uaä des TenrendungsKwttare des> Κο&ί^ΜϊοίϊψιχΧΙ&η* Baher ist- um -XL 704-erBeufWde Stern* WML· 2?61 als- «ia faxiantAntasa von Strepton^o^s plattnsie

2s sei darauf Mngeiffiteei,, infi ^l^ ^Mmwm mMkt m&f Mm Tervesidung wa @tr®ptes9@e» }}l&t&m&®'~mi<Zo ip<» W$L· fpBl '

für die EeraieUoBg um i^bi^tikum® "B» ?ü# l»®®oteis!di ist. Sie sehii#£t diü ferweaimig m mttklicslKüi oder kLermis

ein« Die

kann durcfc, kcü*^mti©stXl?J %eis«tiaiim₉ %· B« strahlen«' W-Stsslilnisg wsä

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werden· Ebenfalls umfaßt die Erfindung die Verwendung von YL 704-erseugenden Stämmen, welche alt den gleichen Arten des oben genannten Stammes übereinstimmen.

Gemäß der Erfindung kann eine neue, nakrolide_f antibiotieche Zueammensetsung IL 704- hergestellt werden, indem ein XL· 704*» erzeugender Stan, s· B, Streptomjces platsnsis var· βρ· BBBL 5761 oder seine Mutanten, unter aerober Bedingung in einem wäßrigen HMhrmedium fermentiert und die antibiotieche Zueaunensetsung aus der Iermentierungslusung gewonnen wird·

Die Fermentierung kann entweder durch eine Sehüttelkultivierung oder durch eine fsuohfermentierung unter Belüftung und Bührung durchgeführt werden. Me Zusammemaetsung des Mfihrmediums kenn in einem weiten Bereich variiert werden. Als wesentlich sind erforderlich eine Kohlenstoff quelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Spurenelemente· Beispiele für geeignete Kohlenstoffqjh>11«a sind Oluoose, Lactose, Maltose, Stärke, Glycerin, Inoeit und SojabohnenS!. Geeignete Stick» etoffquellen für den Fermentierungsprose6 schließen Ftpton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Haismaiechflüseigkeit, BenmwoU« saatmehl, Soyabohnenmehl, Erdnufimehl, FroteinhydrolTsat, anorganische Ii trat β und Ammoniumsulfat ein. Beispiele *on geeigneten Quellen für anorganische SLemente sind Batriumchlorid, Kalsiumchlorid, nagneeiumeulfat, XalEiumcarbonat, Phosphat und Salse ton Schwermetallen s· B. Bisen, Zink, Kupfer und Hangan· Falls wfihrend der Fermentierung ein übermäßiges Schäumen auftritt, können Antischaummittel, *· B. ßilikonöl, pflanzlich· Öle oder oberflichanaktiTe Stoffe su den Fermentierungsmedium sugesetst worden. Sie Jerm*ntierung wird in einem neutralen Medium bei etwa 25 bis 35° C, vorsugsweise bei etwa 27° C durchgeführt· Die Ionientration der antibiotischen Aktivität in dem Fsxmentierangemedium

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kann ohne weiteres während des Ablaufes der Feraentierung mittels üteBtprofeea dieses !le&iwes &aeh dem ^ylindei^latteiiverfahren unter Verwendung von Baeillme eubtilie untersucht werden* Der pH-Wert des ParuaBfcieruiigatte&LuiiUi eelgt die Neigung in eimern frQhess. Stmdtiui des? Femeatienang- täi©f> *bsninehmen, j®doeh eteigt
an. Sie «eodmale JUiebeii

IL 704- kenn oadb etw» 4B "biß 60' & FaneafeieswDg axvelelit werden« wenn d9r'$H«4fert dee Ferae&tiexuigiiiiiediiHs etwa 7»4- bis 8,0 erreicht»

Sie «ntlblotieone Zumtmm^mmms Oa 704· in der IermentierungelBiiiifis
wachstum der Iü3croore*nieii«n
feste Bestandteile aus dm»

Anwendung von Sta&dazdaueriBtsngd&g s« B· und Zentrifugen, durch Verweadune ψοη. Biatoiiee&erde nie Filterhilfsmittel, falls erfordevlidi, entfernt» Die. antibiotlsche SSusamensetemig -Yh 70% kann aus düt Filtrat nach konventionellen Arbeiteweisen g,@mw&9m #dMen· %vm Beispiel werden die farblosen,® scbirach basisohen, Bilirer der ZusaimeneetsBung vorüugeweiiie tereb, lbcferakti@& dtte Filtrates nit Vaseer-unldslielitii« or^nieotiisnnsiiiigs» mitteln, s« B« halogexderten BbhlesiineeergitofffOf Estern ▼on ?ettsfturen₉ Ketonen oder Alkenol®» »it irier bis acht Kohlenstoffatomen, bei einem neutnlem pE-Wext im& Abdampfung des LSeungsmittele aus dem Ibrtnrakt erhalten· Alternativ wird die antiblotieohe Zueammensetsung IL 704-erhalten, indem das flltrat mit «in«m.geeigneten Adsorption^ mittel, s· B. Aktivkohle, Bantonit₉ AlumlnlamoxgFd oder Kieselgel (silica gel) behandelt wird» das Adsorptionsmittel mit wftfirlgem, angesäuertem Aceton oder niedrigeren

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-.^Γ,ίΓ-0 CAV* - BAD ORIGINAL

Alkanolen extrahiert und die freigesetzte entibioti »ehe Zusammensetzung aus dem wäßrigen Extrakt abgetrennt wird. Sine Kombination der oben genannten Arbeitsweisen ist ebenfalls zur Gewinnung und Reinigung der antibiotischen Zusammensetzung bevorzugt»

Die so erhaltene antibiotische Zusammensetzung Hr 704 iit in Methanol, Äthanol, Butanol, Hethylmcetat, Athylacetat, Butylacetat, Chloroform, Aceton, XthylÄther und Benzol sehr löslich. Sie ist m&Mg löslich in Wasser, jedoch in Cyclohexan, η-Hexan und Petroläther unlöslich» Sie ist gegenüber der Tollen«^♦P

und EiBen(III)-cblorid-Roaktion negativ· Sie ergibt ein« positive Eieen(III)-hydroxÄ!BÄt-Ee»ition₉ Si· entfärbt die färbung einer wäSrigen BromlÖsung und einer wÄSrigea Kaliumpermanganatlöaung, Si· erscheint bei ZiaeerteespeaMiti in konzentrierter Schwefelsäure rStlich-violett \φ& in konzentrierter Salzsäure tarfcar. Die Färbungen Ündorn mit Chloroform oder n-Butanol nicht·.

Das so erhaltene antibiotische Uli 704 enthält mindestens zwei Gruppen von antibiotiechen Subet&nsieÄ» eine welche ale XL 704 i. bezeichnet wird» dieser Stoff wird weiterhin in mindestens zwei Komponenten XD 704 A^ und XL 704 teilt· Bie andere Substanz wird al· TL 704 B be»eichsietj die ebenfalls weiter in mindestens swei Komponenten XL und XL· 704 Bg aufgeteilt werden kenn.

Die antibiotische Zusammeneetiong IL 704 besitzt unbestimmte physikalische Konstanten wie Schmelzpunkt, ELemen werte» spezifische Breiuag, dft da* Verhältnis des von XL· 704 A und B in der antibiotischea XL· 704 mit den. Fermentierungs- und/

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O · Bus

ar«e©eSi begimt

toad 139^@ C su « 146° C« Sie * 1,0 etifinrilsfe

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H. 1	,88	.60	O - 28,55
K - 1	•93	O - 28,12
»-1,71	O - 29,16
M - 1	O - 29,51

(4) Analyee

IL 704 A₁: C « 61/26 H - 8,38 TL 704 A₂* 0 m 60,95 H « 8,36 IL 704 B₁I G · 60,89 H · 8,33 IL 704 B₂* C · 59,99 H « 8,15

(5) Molekulargewicht (Deepfdruck -oeacaetrlsoae in Chloroform)

IL 704 A₁ - 834, 865

IL 704 A₂ - 822, 854

IL 704 B₁ « 805, 835

IL 704 B₂ - 796, 840

(6) Susunenforael

Au« den £rgtbnisi«& der SlementawiftlT·· ^nA Α« gewioht ergibt sich die SuBMBfozs«! der Antibiotika vi· folgtt
TL 704 A₁,

TL 704 A₂! IL 704 B₁:

Π. 704 B₂: ^_42656915 (?) Si« m-Spektrea (in Siijol) d«r Antibiotika sind in den Fig. 2 bis 5 der Zeichnung wiedergegeben,

(8) Die UV-Abeorpticuaeepektren (in Itheaol) der Antibiotika eind in den Tig· 6 bis 9 dear Zeichnung wiedergegeben.

(9) Löslichkeit

Die Löelichkeiten ron IL 704 A₁, A₂, B₁ iiad B₂ in organischen L5«ing«Mitteln sind dieselben wie toä IL 704.
Faxbreaktlon

IL 704 A₁, A₂, B₁ und B₂ »eigen die gleichen farb reaktion«© «ie IL 704.

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9m

(11) |Ä_a-Werte (50 %±ge® Äthanol) TX, 704 A^ 6 6,90 Πι 704 Agi 6,85 YL 704 B₁S 7»00 JL 704 B₂: 6,90

(12) Rf-Werte der Anfcibiotäka mittels S&uütebidLtoAiaKiurtegrephie sind in &w folgend»'{tabelle I «ueagebea·

platt· ~ nittel

Kieeelgel Eine

(Kieeel Gel 8 al

GF 254) 2 Bl

einen

5 »1 0,60 0₉S$ 0,47 0_$41 Gel Bäoxol nni. 2 öl 254) Aceton

0,59 0,42 0,50 0,33

lg«l Bensol imd 2 ml

el Gel

(Kittel Qel ^ Aceton 254)

(13)

Di* Antibiotika der l*^jf i&^ag ιώΜ- mi dem aalsen auf konrenticmfille W#ie·

«eise werden die Additioiüealee mDVf&niMTm» BSxwv&₉ ι· Bt 93fdrochlo3?id, Bjgrdsohxosldt Siilf&t, "^@ispiiAt 12nd die Addition·—la» oggafllgofiftg Sftuven, 9» B* Jioetat₉ Pynrmt, fartrat» Citrat, Mstlat isiid Aspasigiaftt leicht bei Yerw*¹^¹?^ des? ontepiTei&eii&en mwwytttnsiiB iKrhfn oder Sture erhalten.

- 12 - '' ■'-".';.-009886/2215 ^

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- ■ " j_tm&*^^: -■■■ ■■-*' ^; ti

Me bakteriologiechen Aktivitäten der Antibiotika der Erfindung sind wie folgt*

(1) Antibakterielles Spektrum

Die Antibiotika »eigen Aktivität gegenüber einer Ti·!» sehl von ilikrooreanienen· Die antimikrobiell· Aktivität in vitro der Antibiotika, welche duselt dl· Hetaod· mit aufeinanderfolgender sweifaobar Tet^önmiaf wurde , let in der folgernden tabelle ZX Falls nicht· anderee angegeben iat, beronen die niese auf der Aktivität xsaca 2* ft Inkubation.

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Organismen. Medium Mialaalo lahibltoriaoli»

α tk toi'b

Staphylococcus mar «an

Staphylococcus Staphylococcus

8· ftre&e reetetent)

B. iur«us

Stroptococcue Diplococcu* Park William Hemophilias pertussis

Heiiseeri« 13077

Bacillue

coil E-12

BhigellA f leMt«ri 2a

Proteu« »56

1,56 1,56

6,25

»100 >100 .1,56 0,78

0,78®

3,12 1»56

50 100 100

12,9

>100

>100 6,29· 6,29·-

Tabelle II Organismen H«dium HiaiMl· ishibitorl Zoostetrctlon (ao^

IL 70* ILTOtA

gftHietptieua

UX	1,0·	1,0·	1t0
ZZ	>100	>100	>100
XZ	>100	>100	»100
XZ	»100	>100	>100

AspergiUus nigar Ptnlcillitm notatua

Axaerkuagens

1) Kediumt f ί

löaungi III--^I>ifoo-Hlxii-Hwpm-lafueioneie«uae Bit

Pferdeeertmj IV

-flüssige· lokm^ftedliMf ΤΠ ——flüsslgss ßeboxirmud-iiediu«· 2) · - Aktivität mob 48 h

·· - Aktivität Mioh 2 Wochen iMkatwtloft

Aus 4«r Toxh«re«h«aAe& *Λ·11· ist HiTiHM₁ «sJ Ü· Antibiotika in oh*r«kt#ri*tie«h*r V·!«· posltiTta BsJctetliA, iyjruiilsssjsn» «Insr ssbl ton e?aan«cfctirtt& l«kt«ri«Ei_t s. B. und Helieeri* m«aineitidie_t und «in·* gtssm Aassbl von eäur«f tst«B BsJcttritn sktir sind· Is ist "f usv sa •rs«b«n₉ daß si· gegsDfibsr dan maistan flsi ti——flliii Bakterlan, Mycobactariun tabsreolosls «ad β·β·η eskrolid· Antibiotika Meist«at· Bakterien, l«ioht aktiT eiad·

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SAD

Ferner ist festzustellen, daß Hure Aktivita¹ tea nicht in Anwesenheit von Serum inhibiert werden»

(2) ToxUität

Die akute Koxisität der Antibiotika ist hmwitembrnmsli niedrig· Sogar wenn dies© Antttiotüm *■· B. Hta§«&, mit einem Körpergewicht tob, 20 g la «4b®i? Βοά!® wen intraperitoneal appliaiert w«r&#m_s wiM küia· Wma getötet,

O) Untersuchung auf Schuts gegenüber B&fdctioa Mäuse, welche intraperitoneaX mit Btaplsjioeoeeiae Smith (behandelt mit Hucin) imr der

Antibiotikum« geimpft wurdta_t wunften vm taß

tod geschüttt, wenn intraperitontal eto© Boiie twi 1 der Antibiotika applisiert wurde»

Aus den physikaliach-chemiechen uad biologieeheii SLgenachmf ten der Antibiotika der Erfindung ergibt eich« daß ei® Mit" glieder der basischen, makroliden Antibiotika sein können®

Unter den basischen, oakroliden Antibiotikai ffliM lertiomycin A und B, Furomacidin D, Miamycin₉ 44e«Subetane_v iosamycin und Leucomycon A uad B mit dm Antibiotika d@r Erfindung hinsichtlich der maxiaal ®n Üf-Abeorptioa b@i 230 - 2J4 mu gleichartig« Jedoch eiad Antibiotika mit Abnahme -von iosamycin uad Leuooa^oia offeaeiehtlioä ima den Antibiotika der Erfindung hiaeicAtlich üxsnu Stieketoff« gehaltes, der Holish-Beaktion vad dea f&ybaaeaA ia Scoasflatrierter Schwefelaiure uad/od«r ia kosutntrierter ealeeftnr· usw. Tersehiedea* Die physikalisch-chemisch«» Sleeaseaaf tea Ton Joeanycin und Leucoayoia siad mit deajeaiitii &Φ* der Erfindung gleichartig« Jedoch ist Joeaayeia 9oa den letsarea rerschieden, da ·β «ine starke IE-Absorption bei

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BAD ORIGINAL

1234 cm""¹ zeigt, während die Antibiotika der Erfindung keine solche Absorption seigern

Leucoayoin A ist eine Mischung τοη verschiedenen antibiotisehen Stoffen, welche in Antibiotikm der LeuooKToln und der Leucoayoin JU-Berien eingeteilt werden· Die Antibiotika der erstgenannten Serien leichncn sich durch dl· Abwesenheit der intensiven lEUAbsorptionebande bei 1220 -1260 ca"¹ aus, während die letztgenannten» Ihnlich wie Josamyein, die intensive Absorptionsbande bei 1220 -> 1260 infolge der Aoetoixyfunktlon im Molekül besitsea· Daher sind die Antibiotika der Leucomyoin A,-Seriea von den Antibiotika der Erfindung sehr verschieden« Antibiotika der Leucoaycin A^- Serien und die Antibiotika der Erfindung sind voneinander durch ihr chrona to graphisches Verhalten, i. 3· bei der Dünnechicht- und Papierchromatographi«» verschieden· Inebesoadere, wenn sie mit ithylaoetat auf einer DÖnnechichtplatte aus Aluiiiaiumoxyd (Hersteller Well» Co«) oder sdt einer 1/5 Hol Hiosphatpuff er lösung, welch« mit n-Batylaoetat gesättigt ist (pH 5» 9) auf einem filterpapier (loyb'e Filterpapier Hr. 50, vor der Entwicklung mit derselben Pufferlösung gewaschen) entwickelt werden, ist der £f-V«rt der Antibiotika der Leuoomycin A^-Serien versohiedmi von demjenigen der Antibiotika der JSrfiadung (dies ist in die 7ig· 10 und 11 der Zeichnung geieigt)» Leucomyein B ist ebenfalls von den Antibiotikm der Kpflndung hinsichtlich der LSelichkeit gegenfiber BsasoI verschieden· wurde kein den er£in<Sungsgema\3m AatibdotUkm entspreehendes Antibiotika im "Index of Antibiotics from Actonimycttes* (1967) ton ümesawa und in anderen Teröffentlichungee, gefunden. Daher sind die Antibiotika der Jpfiaflnag iisumrtig·, makroUde Antibiotika.

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⁰⁴⁰

Eine praktische und derzeit bemonugte der Erfindung wird in dm £©lg®BÄ«i Büigipielea exUntemd wiedergegeben. lsi den f olgeaÄÄ Betabs^banetti -wupiäe die Aktivität biologisch unter ¥®rw«»i«ig vom Boeilliui onibtlllB ale eapf iaälieh©m Mltac»pgiBi8»as methode bestiiQBt;» Biese JilEti¥£tät tob reia#m Hi 704 k su

In eine» te«a®ati®3fWBgiitQ£iE oii) oiaca folieos mm. %mrden 120 1 ©iaes liiijamoäiiiaa sogofeoaj, walekee SI® den Stoffe

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Bio Züchtung wurde bei 27° G unter Belüftung mit 60 - 70 l/min und wihrend mit 260 U/adn gerührt wurde durchgeführt, wobei der Innendruck auf 0,5 kg/cmr gehalten wurde« Der pB-¥ert dee Medium nimmt bei 20 h Kultivierung euf 6,3 4b· lach 30 α Kultivierung nimmt der pH-Vert de· Mediums sTImlhUnh ro. Der pH-Vert erreicht 7,8 nach etwa 45 Iu Di· antibiotUca· Zussmmensetsu&g TL 704 beginnt sieh bei «tv« 24 h Kaltinlerune usuMMiIa, Die maximal· Auebeut· (200 · 400 mog/ml) der antibiotiachen Zusammensetzung wird muh etwa 45 a lultivlerung erhalten.

2 (Extraktion und lonientrierung mittel· Aktivkohle)

Sie in Beispiel 1 erhaltene 7ermentationsl8*inf wird alt Hilf· von 5 % Matomeeaerd· filtriert, wob·! 100 1 Am

filtrate· (250 mog/ml) erhalten werden« Da· Viltrat wird auf pH »8,0 mit wtBrigem Awaonlair eingestellt· 0,5 kf

Aktivkohle und 0,5 kg Diatomeenerde werden su dem filtrat

sugesetst und die Nisehung wird 30 min gerührt. Durch diesen

Vorgang wird die entibiotische gnsss—wsstswag IL 704 toll-

■t&odig auf der Aktivkohle adsorbiert. Bis Aktivkohle wird durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen uod sweimel mit 25 1 80 9dgem vaßrigem Aceton oder «ethanol (pB - 2,0, eingestellt mit ChlorwasserstoffsÄure) extrahiert· Bach Hn stellen des jG-Vertes auf 7,0 wird der Irtrakt auf 10 1 unter Termindertem Druck konsentriert» Die so erhaltene ((

LSsung seigt eins Aktivität von 2400 mcg/ml. Die Ausbeute

betragt mehr als 95 % der Sheorie.

Beispiel ft (Sztraktion und Koassntrierumg Auren ΤιΠιιιηι,ΒΐΙΙ tni) 120 1 der in Beispiel 1 erhaltenen 7ermentationslQsung wird mit Hilfe von-§ 1t Diatomeenerde filtriert. Bas filtrat wird auf pH - 7,0 bis 8,0 eingestellt und es werden 7 kg Xatriumchlorid in dem filtrat aufgelöst. Si« Losung wird sweimal

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mit 40 1 lthylaoetat extrahiert· Mt fieteikt wird «tf10 1 unter verminderten Brück koneeateiert,, wodurch aim· fconaam-» trierte Lösung erhalten wird·» «sich« ©ine AktiyitKt von 1218 mcg/ml seigt. Me Umug viM nreimal Bit 1 1 angamtuezteA Wasser (pH · 2,0) extrahiert· 2He ^Ifirig® 8OhIdIt inxä iam auf pH - 8,0 eingestellt «ad ινβΙοκΒΐ «it 1 1 extrahiert« Si« v«ar«ijiifff; Trockene unter Versdiider

so erhaltenen rohen !Kristalle vi®tiA ia 100 al Bensol auf·- gelöst· Sie I/östüag wixd suf eim« SIU· ipoa 15,6§ JJtadxiitii

(hergestellt voa Welin Q®*\ wlilwi alt Bensol am®·-* feuchtet ist, gegeben« Mi Stole «Ufa Auea alt itütylaeetef eluiert, und die bektwlitii® JH^tl^ttt anfwietotem werden gessjoielt· Die ipwnBntlfm SLinti» eingeengt, wobei 14 g Am «itibiotifmlien TL 704- als Fulrer erhalten

Beispiel 4 (XrlBtsllieatlott - Äfsr amtibi^tisdiioa

IL 704)

4,0 g der in Beispiel 3 «timltfnem, «mtibiotisiohwi Zwsmmm» set sung IL 704 werden in 50 »1 ΒβωοΧ aufgelöst« tu der Lösung wird tropfenweise zh-fiexftfi bi® mm Auftreten einer weißen Xrübung in der Lösung gegeben· ffinoh dem Et^üä in einem Kühlschrank werden die «msgefiUton KrietaJJ.« dureh Filtration gewonnen, webei 2₉$ & &e& mtäte±@tlmtihm mensetsung IL 704 als $rtem«ffi

Beispiel S (Abtrennung tshl Si 704 A wid IL 704 B mittels Chromatographie)

5 g da&Jii} Beispiel 4 erhaltemen, aatibiotieeh«& setsung XL 704 werden in 20 ml Chloroform aufgelöst« Lösung wird auf eine Sftule *o» 500 s Kies«!««! («d^JLea

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i0rf,iV->?■.-:■: ir ν:. &*?* BAD ORIGINAL

hergestellt von Merk & Co. unter der Handelsbeseichnunf "Sieeel Gel S") gegeben, das in «In·« Bohr Tem 5 em Duroiiaesser und 60 cm Höhe eingefüllt ist· Bio Kolonne wird mit einer Mischung entwickelt, weloh« 100 Toi«,ELe. Chloroform, 0,5 Vol.TIe, 80 #Lge wfBrige gssigsfuro und J - 6 Tol.fle· Methanol enthalt, und jode 100 ml-Ofccaktiein wird Der Methanolgehalt wird auf 3 Tol.tle. la dem Kr. 1 Us 250, «uf 4 ToI.TIe. in den Fraktionen 251 - 950» auf 5 ToI.TIe. in den Traktionen Xr, 351 - 60O₉ und auf 6 ToI.TIa. in den Fraktionen oberhalb 600 eingestellt· Bei dieser Durchführung werden IL 704 A in dia Fraktionen Hr. 271 bis Hr, 661 und IL 70* 8 in dl« fraktion« «V, 691 bis Xr* 771 eluiert. Bio Staate der fraktion« Bf« J11 Mr. 469 werden Tereinigt und da# I>ga«ng—1ttol imIi iff U wobei 550 mg IL 704 1 als Itolve? gevoraen werden. 480 ag IL 704 B wird ebenfalls aus den Sluaten der fxaktio&on Nr. 662 bis 761 auf gleiche Veise wio eben gewonnen»

Sie so erhaltenen XL 704 1 und IL 704 B werden jowoii* «as einer Mischung von Benzol und n-Hexan wobei weiße bis leicht blafigelbo Xristallo erhalten vorden

Beispiel 6 (Trennung von IL 704 A und IL 704 B durch OegenstroiBTerteilung)

200 mg in Beispiel 3 erhaltenes IL 704 wird mittels Ooganstromverteilung unter Terwendung einer Mac Ilrein-Puf£orlösung (pH - 4,0) gereinigt. Diese Operation wird in der Craig¹schon Oegenstromrerteilungsapparatur durchgeführt. Vach 10O-facher überführung worden IL 704 A in den Rohren Vr. 51 bis 71 und IL 704 B in den Bohren Ir. 24 bis 30 verteilt. Auf diese Weise werden IL 704 A bsw» IL 704 3 durch Verdampfen als Pulver gewonnen·

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ORfGJNAL INSPECTED

Beispiel 7 (5ffr®mrosig von JL 704 A wad 1 äjhkä flhilen-

108 g der im Beispiel % setsu&g HL· 704- vix<& der Slui® to» 2400 g GhtaieeX ¥®ä©) «sÄiffö©2Cja₉ <3Aq Sa Bnrclra®«s®r ubA 120 oa »9 G mittel eiae MiAiEES ^©m Qo3iß ■ 15-50 τ 8 en

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auf 30 Vol.Tie. in den Fraktionen He. 201 bis 450 und «if 40 Vol.Tle. in den Fraktionen 3fr· $50 Die €10 eingestellt· Durch diese Operation wird IL 704 A^ hauptsächlich in die Fraktionen Br. 250 bis 410 und TL 704 A₂ hauptsächlich in die Fraktionen 3Ir* 480 bis 600 eluiert. Si· Kluate der Fraktionen Ir· 280 bis 350 werden miteinander vereinigt und wir Äatferaung de· Lösungsmittels eingedampft, wobei 2,1 g XL· 704 A₁ als Pulver erhalten werden· 530 ag 7X 704 wird ebenfalls au« den Huaten der Fraktionen Ir« 515 bi· 592 sit den gleichen Kitteln wie oben gewonnen·

Die eo erhaltenen IL. 704 A* bsv· IL 704 A₂ werden au· Benzol umkristallisiert_t wobei ei« weiüe »adeln ergeben.

Beispiel, 9 (Trennung und Reinigung von IL 704 B₁ und IL 704 4 g dee in Beispiel 7 erhaltenen IL 704 B wird der Säulen-Chromatographie auf einer Säule von 400 g Kieselsäure (hergestellt von Mallinokrodt Chemical Vorke) untersogen, die in einem Bohr Ton 5 cm Durchmesser und 40em Höhe elngefüllt sind, wobei al· Lösungsmittel «ine Wlwaning von Bensol und Aceton (Acetongehalt «25-45 v/vff) rerweadet wird, und es wird jede 20 ml-Fraktion gesammelt· Der Acetongehalt des LSeungsmittels wird auf 25 % in dem Fraktionen Br, 1 bis 120, auf JO % in den Fraktionen Mr. 121 bis 280 und 45 % in den Fraktionen Br. 281 bis 595 «ingestellt· Durch diese Operation wird 7X 704 B₁ hauptsächlich la die Fraktionen Kr· 115 bis 230 und IL 704 B₂ bauptstohlieh in die Fraktionen Ir. 511 bis 385 eluiert· ML· KLuate der Fraktionen W*. 120 bis 260 weiden vereinigt und sur Attfernung des L5sungs> mittels eingedampft, wobei 1,2 g IL 704 B₁ al· Pulver erhalten werden. 450 mg IL 704 B₂ wird ebenfalls aus den Husten der Fraktionen Br. 520 bis 575 »it den gleichen Kitteln wie oben gewonnen.

Bi· so erhaltenen TL 704 B₁ und IL 704 B₂ werden jeweils aus einer Mischung von Bensol und η-Hexan umkristallisiert, wob·! weiße Vadeln erhalten werden·

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren tür Herstellung einen Antibiotikums _v dadurch Siktnnieiebset, daß ein IL . Stawa von Sfcrtspfco^ye®© plftteaaiffi tar» sp. la wäßrigen NShmedim wüA^t ®®rob®ii B®dlsgujag®a kuXftivlevt' und das angeeneaeXt© Aatiliiotitaei eus d@? lOsmtetioB»· lösung gewonnen wird»

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadweli g®keans ι ί, e Is-

   net, daß die EultiTienmg unter euta®reai_s aeroben ™ Bedingungen durchgeführt

   3· Verfahren nach Aaepnich I₁, dateinäi. gekei&niebn β t, daß die Eultitlexiiiig bei eimer fatpexwtw iron etwa 25°biaetwa 35° C durchgefttot wird·

   4· Verfahren nach Aaeprueti I₉

   nit, daß die üoltifles-ung v&teenA eiaer von etwa 48 bis etva

   5. Verfahren

   n β t, daß die KiltiviesEiiis umtep Bedingungen b·! eiasr ttüqpipeteu» vom etpa 25° t>lo 35° C für elm® !»«!t^pan»· ¥wa etm gefOhrt wird.

   6. Verfahren lüteli
   net, daß die

   lösung, ihm

   ttiachbaren Ueuaismitt®! bid et«m nung des Antübiotümme aus den

   009888/221 S

   to

   7* Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch g β k ennieichn e t, daß die Gewinnung des Antibiotikums aus der FermentierungelÖsung durch Filtration der FermentierungS" löeung, Behandlungdee PiIt rat es mit einem Adsorbent bei neutralem pH, Extraktion des Adsorbens mit eine« sturem, wäßrigen Aceton oder ei^em/iSßrige» Aliaaol uM Abtrennung des freigesetzten Antibiotikume aus dem Jbctrakfc durchgeführt wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7» dadurch g · k β η η -2 θ i ch η β t_t daß Alt aktive Komponente einer Qegea» stromverteilung oder einer 81ulenohrom*tographi« mm Auftrennung in Xl 704- A und Xb 70* B unterzogen wird·

   9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekeanaeichn e t, daß das erhaltene Antibiotika IL 704 A sur Trennung in TL 704 A^ und IL 704 Ag einer Säulenchroma- ^l tographie unterzogen wird»

   10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene Antibiotika XL 704 B sur Auf·» trennung in Ht 704 B^ und XL· 704 Bg einer Säulenchromatographie untersogen wird·

   11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g β k e η η s β i β hnet, daß als XL 704-erzeugender Stamm Strptomgroes platensis var. 8p· ISBL 3761 verwendet wird.

   12. Antibiotikum XL 704 A^, welche« inebeeonder« sur des Vachstums von grampoeitiven Bakterien wirksam iet_; in ?ora von weißen Vadeln von basischer Eigenschaft, mit einem Schmelzpunkt von 122 bis 12?° C und dar spesifiachea Drehung von 0^l|^"-5O»2^o (e · 1| Phlorofon), welehes die

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   I©M.esfflt©fff ₉ Wasserstoff ₉ Stickstoff und Sauerstoff im w®ffl«iitlie&ea in- d®& £@lg®nt@» Hew±elrfes~ verhiltnieeera enfthtlts ~ . ■

   0 · 61_t3 Us H · 8_S4 ft » - 11,9 Ä 0- · 28₉6 H₉ . »it einoii tfolttoilesgewieiit -ma otws 83* oder (swell &®r lii^firttels^oaeoaetiBlseleE Htt&oie Ib fox«) nit am in &«m fig» S I»»® 6

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   dee WÄek3v3S2DD vom Opaopo in form wea ticißis-a EhäoM

   einem Schmelzpunkt von 193 *>is 194 ⁰C und der spezifischen Drehung vont^Ä] ff «-49,0° (c * 1i Chloroform), welches die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff im wesentlichen in den folgenden Gewichtsverhältnlssen enthältι C - 60,9 %i H - 8,4 %i » - 1,9 %i 0 - 28,1 % mit einem Molekulargewicht von etwa 822 oder 834 (nach der Dampfdruck-osmometrischen Methode in Chloroform) mit dem in den Fig· 5 fcsw. 7 wiedergegebenen IS-Spektrum bzw. OT-Absorptionsspektrum, mit positiver ELaen(III)-hydroxamatreaktion und negativer Stollens-, Fehling-, Moliah-, Ninhydrin-, Biuret- und Eieen(IIl)-chloridreaktion, welches die Färbung einer wäßrigen Broalösung und einer wäßrigen KaliumpermangwTmtlösnng entfärbt, sich in rötlich-violette Färbung in konsentrlerter Schwefelsäure und in fartarfärbung in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure umwandelt und das in Methanol, ithanol, Butanol, Methjlacetat, Butylacctat, Chloroform, Aceton, Xthyläther und Feniol hochloelich. ist und in Wasser leicht löslich jedoch im €^relohexan_s η-Hexan und Petroläther unlöslich ist und einen pi.«Vest von 6,85 (in 50 9&gem Ithanol) und die Rf-Werte vo& 0,68 Lauf einer Dfinnschichtplatte von Eieselgel (Kiesel Gel QF 254) bei einer Mischung von 8 ml Ithylacetat, 2 ml Ä-Hexan und einem Tropfen von konsentriertem, wäßrigem Ammoniak als Lösungsmittel], von 0,53 [auf einer SOnnschichtplatte von Kieselgel (Kiesel Gel GF 254) bei einer Mischung von 5 ml Benzol und 2 ml Aceton als Lösungsmittel] und von 0,42 [auf einer Dünnechichtplatte von Aluminiumoxyd-Kieselgel (Kiesel Gel GT 254) (4 s 1) bei einer Mischung von 3 ml Benzol und 2 ml Aceton als Lösungsmittel] zeigt·

   14· Antibiotikum XL 704 B^, welches insbesondere sur Inhibierung des Wachstums von grampositiven Bakterien wirksam ist, in Form von weißen Nadeln von basischer Eigenschaft, mit

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   einen Schmelzpunkt von 131 bis 132 ⁰C und der epezifischen Drehung vonMjp ■ -42,1° (c «1| Chloroform), welches die Elemente Kohlenetoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff im wesentlichen indan folgenden Gewichteverhältnissen enthält: C - 60,9 5*1 H - 8,3 #i N «1,7 %i 0 « 29,2 % mit einem Molekulargewicht von etwa 805 oder 835 (nach der DejBpfdruck-osmometriechen Methode in Chloroform) mit dem in den Fig. 4 und 8 wiedergegebenen IR-Spektrum bzw. TW-Absorptionsspektrum, mit positiver Eisen(III)-hydroxamatreaktion und negativer follens-, Fehling-, Holiah-, Ninhydrin-, Biuret- und Eisen( III)-Chlorid· reaktion, welches die Färbung einer wäßrigen Bromlösung und einer wäßrigen Kaliumpermanganatloeung entfärbt, sich in rötlich-violette Färbung in konzentrierter Schwefelsäure und in Tartarfärbung in konzentrierter Chlorwasserstoff säure umwandelt und das in Methanol, Ithanol, Butanol, Methylacetat, Butylacetat, Chloroform, Aceton-, Ithyläther und Benzol hochlöslich iet und in Wasser leicht löslich jedoch in Cyclohexan, η-Hexan und Fetroläther unlöslich ist und einen pE_ft-Vert von 7,00 (in 50 Jligem Ithanol) und die Bf-Werte von 0,53 [auf einer Dünnachichtplatte von Eieselgel (Kiesel Gel GF 254) bei einer Mischung von 8 ml Ithylacetat, 2 ml n-Besmn und einem Tropfen von konzentriertem, wäßrigem Amoniak als Lösungsmittel j , von 0,47 [auf einer IKinnechicht» platte von Kieselgel (Kiesel Gel GF 254) bei einer Mischung von 3 ml Benzol und 2 ml Aceton als Lösungsmittel] und von 0,50 [auf einer XHinnschichtplatte von Aluminiumoxyd-Kieaelgel (Kiesel Gel GF 254) (4 s 1) bei einer Mischung von 3 ml Benzol und 2 ml Aceton als Lösungsmittel] zeigt. .

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   Antibiotikum XL 7CW- B₂, welch·· insbesondere sur InM-bierung dee Wachstums von grampositiven Bakterien wirksam ist, in Form von weißen Hadeln von basischer Eigenschaft, mit einem Schmelzpunkt von 129 bis 132⁰O und der spezifischen Drehung von ffi*} ^ »-42,0° (o .· 1| Chloroform), welches die Elemente Kohlenstoff, Wasserst off, Stickstoff und Sauerstoff ia wesentlichen in den folgenden Gewichtsverhältnieeen enthält:

   σ - 6o,o*_} η ^$,24i η - 1,7 %i o - 29,5 % mit einem Molekulargewicht von etwa 796 oder 840 (nach der Dampfdruck-osmometrlechen Kethode in Chloroform) mit dem in den Fig. 3 und 9 wiedergegebenen IR-Spektrim bzw. UV-Abs orp ti ons epekt rum, mit positiver Bisen (III). hydroxamatreaktion und negativer Tollens-, fehling-, Molish-, iiinhydrih-, Biuret- und Eisen(III)-chloridreaktion, welches die Färbung einer wäßrigen BromlSsung und einer wäßrigen SaliumpermanganatlÖsung entfärbt, ~ Sich in rötlich-violette Färbung in konzentrierter Schwefelsäure und in Tartarfärbung in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure umwandelt und das in Methanol, Ithanol, Butanol, Hethylacetat, Butylacetat, Chloroform, Aceton, Ithyläther und Benzol hochlöelich ist und in wasser leicht löslich jedoch in Cyolohexan, n-H#^an und Fetroläther unlöslich ist und eintn pX_a-Vert von 6,90 (in 50 tigern Ithanol) und die Hf-Werte von 0,55 , [auf einer Dünnschichtplatte von Sieselgel (Kiesel Gel GF 254) bei einer Mischung von β ml Ithylacetat, 2 ml n-Hexan und einem Iropfen von konzentriertem, wäßrigem Ammoniak: als Lösungsmittel] , von 0,41 [auf einer Dünnschicht- χ platte von Kieselgel (Kiesel Gel QtF 254) bei einer Mischung von 3 ml Benzol und 2 ml Aceton als Lösungsmittel I und von 0,33 [auf einer Dünnsohichtiplatte von Aluminiumoxyd-Kieselgel (Kiesel Öel GF 254)' (4 ι 1) bei einer Mischung von 3 ml Benzol und 2 ml Aceton als LöaungsmittelJ

   ^Zeigt' 009886/2215

   16· Säure'additionesais der basisch®^ Smbstans ziaoh Anspruch 12.

   17· Säureadditionssals am hmmindmn. Btibmbmz nach inqpruch

   18· StturcadditioBsettls ämr hmim?hm ßubetams 14-·

   19· eäureadditioziasalss d®3p baelschan Substanz nach Anspruch

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   009886/2"'! S