CZ2013590A3 - Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8404 - Google Patents
Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8404 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2013590A3 CZ2013590A3 CZ2013-590A CZ2013590A CZ2013590A3 CZ 2013590 A3 CZ2013590 A3 CZ 2013590A3 CZ 2013590 A CZ2013590 A CZ 2013590A CZ 2013590 A3 CZ2013590 A3 CZ 2013590A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- strain
- sclerotia
- alkaloids
- ergocristin
- fungus
- Prior art date
Links
- 241000221751 Claviceps purpurea Species 0.000 title claims abstract description 15
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims 3
- HEFIYUQVAZFDEE-UHFFFAOYSA-N ergocristinine Natural products N12C(=O)C(C(C)C)(NC(=O)C3C=C4C=5C=CC=C6NC=C(C=56)CC4N(C)C3)OC2(O)C2CCCN2C(=O)C1CC1=CC=CC=C1 HEFIYUQVAZFDEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000576755 Sclerotia Species 0.000 claims description 23
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 21
- HEFIYUQVAZFDEE-MKTPKCENSA-N ergocristine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(N21)=O)(NC(=O)[C@@H]1C=C2C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C[C@H]2N(C)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HEFIYUQVAZFDEE-MKTPKCENSA-N 0.000 claims description 21
- 229950001817 alpha-ergocryptine Drugs 0.000 claims description 11
- YDOTUXAWKBPQJW-UHFFFAOYSA-N alpha-Ergocryptinine Natural products C1=CC(C=2C(N(C)CC(C=2)C(=O)NC2(C(=O)N3C(C(N4CCCC4C3(O)O2)=O)CC(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 YDOTUXAWKBPQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- YDOTUXAWKBPQJW-NSLWYYNWSA-N alpha-ergocryptine Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@]2(C(=O)N3[C@H](C(N4CCC[C@H]4[C@]3(O)O2)=O)CC(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 YDOTUXAWKBPQJW-NSLWYYNWSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 6
- ZAGRKAFMISFKIO-QMTHXVAHSA-N lysergic acid Chemical compound C1=CC(C2=C[C@H](CN([C@@H]2C2)C)C(O)=O)=C3C2=CNC3=C1 ZAGRKAFMISFKIO-QMTHXVAHSA-N 0.000 claims description 5
- AWFDCTXCTHGORH-HGHGUNKESA-N 6-[4-[(6ar,9r,10ar)-5-bromo-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4h-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carbonyl]piperazin-1-yl]-1-methylpyridin-2-one Chemical compound O=C([C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC(Br)=C(C=34)C2)C1)C)N(CC1)CCN1C1=CC=CC(=O)N1C AWFDCTXCTHGORH-HGHGUNKESA-N 0.000 claims description 3
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 claims description 3
- ZAGRKAFMISFKIO-UHFFFAOYSA-N Isolysergic acid Natural products C1=CC(C2=CC(CN(C2C2)C)C(O)=O)=C3C2=CNC3=C1 ZAGRKAFMISFKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims 6
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims 4
- 241000209056 Secale Species 0.000 claims 2
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 claims 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 2
- 241000228160 Secale cereale x Triticum aestivum Species 0.000 claims 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- OWEUDBYTKOYTAD-MKTPKCENSA-N ergocristine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(N21)=O)(NC(=O)[C@@H]1C=C2C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C[C@H]2N(C)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 OWEUDBYTKOYTAD-MKTPKCENSA-N 0.000 abstract 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 abstract 1
- 101150072807 lpsA2 gene Proteins 0.000 description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 229960004318 dihydroergocristine Drugs 0.000 description 4
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 4
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 4
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N Ergometrine Natural products C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N 0.000 description 2
- 108091023242 Internal transcribed spacer Proteins 0.000 description 2
- WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N Lysergic acid propanolamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- DEQITUUQPICUMR-HJPBWRTMSA-N dihydroergocristine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(N21)=O)(NC(=O)[C@H]1CN(C)[C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C2)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DEQITUUQPICUMR-HJPBWRTMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229960001405 ergometrine Drugs 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 2
- QHZUABXEBRGBLP-LKWYKXIFSA-N (6aR,9R,10aR)-N-[(2R,4R,9aS,9bR)-4-benzyl-9b-hydroxy-3,5-dioxo-2-propan-2-yl-3a,4,7,8,9,9a-hexahydrofuro[3,2-g]indolizin-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide (6aR,9R,10aR)-N-[(2R,4R,9aS,9bR)-9b-hydroxy-3,5-dioxo-2,4-di(propan-2-yl)-3a,4,7,8,9,9a-hexahydrofuro[3,2-g]indolizin-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide (6aR,10aR)-N-[(2S,4S,9bS)-9b-hydroxy-4-(2-methylpropyl)-3,5-dioxo-2-propan-2-yl-3a,4,7,8,9,9a-hexahydrofuro[3,2-g]indolizin-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9,10,10a-hexahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O.CS(O)(=O)=O.CS(O)(=O)=O.C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@]3(C(=O)C4[C@H](C(N5CCC[C@H]5[C@]4(O)O3)=O)C(C)C)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1.C1=CC([C@H]2CC(CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@@]3(C(=O)C4[C@@H](C(N5CCCC5[C@@]4(O)O3)=O)CC(C)C)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1.C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(C21)=O)(NC(=O)[C@H]1CN(C)[C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C2)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 QHZUABXEBRGBLP-LKWYKXIFSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004565 5.8S Ribosomal RNA Chemical group 0.000 description 1
- 108050003098 Amino acid adenylation domains Proteins 0.000 description 1
- 102100021723 Arginase-1 Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101000644386 Brevibacillus parabrevis Phenylalanine racemase [ATP-hydrolyzing] Proteins 0.000 description 1
- 101000906861 Chondromyces crocatus ATP-dependent tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100067254 Fusarium sp. (strain FN080326) fsa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 101000752037 Homo sapiens Arginase-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000800287 Homo sapiens Tubulointerstitial nephritis antigen-like Proteins 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 238000007476 Maximum Likelihood Methods 0.000 description 1
- 238000010629 Molecular evolutionary genetics analysis Methods 0.000 description 1
- 101150109417 NRPS gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209049 Poa pratensis Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241001330029 Pooideae Species 0.000 description 1
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- PBUNVLRHZGSROC-VTIMJTGVSA-N dihydro-alpha-ergocryptine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@]3(C(=O)N4[C@H](C(N5CCC[C@H]5[C@]4(O)O3)=O)CC(C)C)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1 PBUNVLRHZGSROC-VTIMJTGVSA-N 0.000 description 1
- 229940069062 dihydro-alpha-ergocryptine Drugs 0.000 description 1
- 229940069063 dihydro-beta-ergocryptine Drugs 0.000 description 1
- SEALOBQTUQIVGU-QNIJNHAOSA-N dihydroergocornine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@]3(C(=O)N4[C@H](C(N5CCC[C@H]5[C@]4(O)O3)=O)C(C)C)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1 SEALOBQTUQIVGU-QNIJNHAOSA-N 0.000 description 1
- 229960004290 dihydroergocornine Drugs 0.000 description 1
- LIMAOLZSWRJOMG-HJPBWRTMSA-N dihydroergocristine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@](C(N21)=O)(NC(=O)[C@H]1CN(C)[C@H]2[C@@H](C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)C1)C(C)C)C1=CC=CC=C1 LIMAOLZSWRJOMG-HJPBWRTMSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- SBFXHXZNBNFPHV-PXXBSISHSA-N epicriptine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C(=O)N[C@]3(C(=O)N4[C@H](C(N5CCC[C@H]5[C@]4(O)O3)=O)[C@H](C)CC)C(C)C)=C3C2=CNC3=C1 SBFXHXZNBNFPHV-PXXBSISHSA-N 0.000 description 1
- NESVMZOPWPCFAU-ZPRCMDFASA-N ergosine Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@]2(C(=O)N3[C@H](C(N4CCC[C@H]4[C@]3(O)O2)=O)CC(C)C)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 NESVMZOPWPCFAU-ZPRCMDFASA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 229960004905 gramicidin Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229930001118 polyketide hybrid Natural products 0.000 description 1
- 125000003308 polyketide hybrid group Chemical group 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká oboru biotechnologie, mikrobiologie, mykologie a farmaceutického průmyslu. Konkrétně se týká nového průmyslového produkčního kmene houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., který byl uložen v České sbírce mikroorganismů Masarykovo Univerzity v Brně pod přírůstkovým číslem CCM 8404. Tento nový kmen tvoří při parazitickém růstu na žitě a jiných obilninách sklerocia s vysokým obsahem námelových alkaloidů, zejména ergokristinu, a umožňuje tak zefektivnit extrakční a izolační postupy při výrobě ergokristinu podstatným zvýšením výtěžnosti těchto postupů.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká oboru biotechnologie, mikrobiologie, mykologie a farmaceutického průmyslu. Konkrétně se týká nového průmyslového produkčního kmene houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM8404, tvořící při parazitickém růstu na žitě a jiných obilninách sklerocia s obsahem námelových alkaloidů, zejména ergokristinu.
Dosavadní stav techniky
Ergokristin je významný námelový alkaloid. V humánní medicíně není používán přímo, ale ve formě svého dihydroderivátu - dihydroergokristinu. Ten je používán v lékových formách buď samostatně, nebo ve směsích s jinými účinnými látkami terapeuticky hojně užívaný dihydroergotoxin je směs dihydroergokristinu s dihydroergokorninem, dihydro-a-ergokryptinem a dihydro-p-ergokryptinem. Lze jej využít i jako výchozí látku pro přípravu polosyntetických derivátů kyseliny lysergové a/nebo ergolinu se specifickým spektrem účinků.
Ergokristin může být získáván buď saprofytní kultivací za podmínek submerzní kultivacez nebo ze sklerocií houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., kultivované paraziticky v polní kultuře na žitě (patent č. 279877) nebo jiných obilninách. Pro výrobu ergokristinu byl v ČR využíván kmen, uložený v CCM pod číslem CCM8058, který při kultivaci na žitě produkoval sklerocia s průměrným obsahem 1,26 % (hmotn.) sumy alkaloidů, vztaženo na sušinu biomasy sklerocia. Suma alkaloidů je tvořena průměrně 82,8% ergokristinu, 12,5% α-ergokryptinu a zbytek je tvořen doprovodnými alkaloidy, ergometrinem a klavinovými alkaloidy. Nízký obsah alkaloidů a relativně vysoký obsah α-ergokryptinu byl hlavní nevýhodou tohoto kmene. Nízký obsah alkaloidů je problém obecně ekonomický, uplatňující se při všech výrobách námelových alkaloidů, které vycházejí z daného námele, tedy jak čistého ergokristinu a od něj odvozeného dihydroergokristinu, tak polosyntetických námelových alkaloidů. Naproti tomu vysoký obsah α-ergokryptinu se uplatňuje pouze při izolaci čistého ergokristinu, kde je α-ergokryptin nežádoucí nečistotou, kterou je nutno odstraňovat opakovanou krystalizací, což je pracné a ztrátové.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je nový průmyslový kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM8404, uložený v České sbírce mikroorganismů Masarykovy Univerzity v Brně, ul. Tvrdého č. 14, tvořící při parazitickém růstu na obilninách, zejména na fertilním žité nebo triticale nebo na sterilním analogu žita s cytoplazmatickou samčí sterilitou (cms), popř. na žité nebo triticale s chemicky navozenou sterilitou, sklerocia s obsahem alkaloidů, zejména ergokristinu. Tento nový kmen umožňuje zefektivnit extrakční a izolační postupy při výrobě ergokristinu podstatným zvýšením výtěžnosti těchto postupů. Zvýšená výtěžnost je dána vysokým obsahem ergokristinu ve sklerociích nového kmene ve srovnání s dosud využívaným kmenem CCM8058. Celkový obsah alkaloidů (suma alkaloidů) v jednotlivých sklerociích nového kmene CCM8404 dosahuje hodnot až 3,1 % (hmotn.) při průměrném obsahu
1,8 % (hmotn.) sumy alkaloidů v sušině biomasy se spektrem alkaloidů: 88 % ergokristinu a 2,5 % α-ergokryptinu, zbytek je tvořen doprovodnými alkaloidy, ergometrinem a klavinovými alkaloidy. Současně jsou zachovány vysoké hektarové výnosy drogy, srovnatelné s ostatními vysokoprodukčními kmeny Claviceps purpurea (Fr.) Tul. (CCM8057, CCM8058, CCM8178, CCM8243). Tyto výnosy se pohybují při recentně používané agrotechnice pěstování námele od 700jkg/ha^do 2200 kg/ha, průměrně 1000 kg/ha.
Λ
Přehled obrázků ra ^kr^vdi.
Obrázek 1. Srovnání částí aminokyselinové sekvence genu pro NRPS (IpsAI a lpsA2) kmene Claviceps purpurea CM8404 s referenčními kmeny P1 (NCBI přístupový kód: IpsAI AJ011964, lpsA2 CAI59268), 20.1 (NCBI přístupový kód: IpsAI AET79183, lpsA2 AET79184), ECC93 (NCBI přístupový kód: IpsAI JN186799, lpsA2 EU730584) a gramicidin syntetasy z Bacillus subtilis (AAB22346.1). Konzervovaná sekvence důležitá pro strukturu adenylační domény zobrazená šedě, aminokyselinová residua modulu 1 až 3 zodpovědná za vazbu substrátu ohraničená černě.
Obrázek 2. Nezakořeněný fylogenetický strom kmenů a izolátu Claviceps purpurea vytvořený na základě genů pro 18S a 5,8S ribozomální podjednotky a ITS (Internal transcribed spacer) region. Součásti stromu jsou kmeny uložené v České sbírce mikroorganismů Masarykovy University v Brně (CCM8404, CCM8057, CCM8243, CCM8178), České sbírce Clavícipitales Mikrobiologického ústavu Akademie věd ČR (CCC165 - NCBI přístupový kód EU558999, CCC271 - EU344982, CCC207 EU344981, CCC428 - EU559002, CCC204 - EU559000, CCC134 - AJ133400, CCC511 - AJ311951, CCC434 - AJ311950, CCC236 - EU559001, CCC480 EU344983), sbírce Centra biologických zdrojů (NBRC) Národního japonského institutu pro technologii (NBRC6263 - AB162147, NBRC5782 - AB160991, NBRC32972 - AB160993, NBRC32971 - AB160992, NBRC32970 - AB160998), sbírky Kalifornské University v Davisu (FSA1 - EU559008, CMD1 EU559006, RH2 EU559011, WHS - EU559018, WDS - EU559016, CPE10 - EU559007, ARG1 EU559004, WLS - EU559019, WFA - EU559017, NGE1 - EU559010, IRE12 EU559009), sbírky Vědeckého Institutu pro ochranu rostlin v Pretorii (03/CP AY387490), sbírky Národního veterinárního institute v Oslo (VI04972 - FN687674, VI04915 - FN687675), sbírky oddělení biotechnologií University v Guizhou (M45581 AJ309368) a laboratorního referenčního kmene T5 (20.1 - DQ119114.1). U každého izolátu je vždy uveden hostitel, na kterém byl nalezen a země původu.
Příklady provedení /.¾
Příklad 1
PŘÍPRAVA NOVÉHO KMENE
Nový průmyslový kmen houby Claviceps purpurea (Fr.).Tul., CCM8404 byl vyšlechtěn z kmene CCM8058 popsaného v patentu c. 279877. V roce 2006 bylo sklerocium tohoto kmene převedeno do saprofytické kultury a tato byla vystavena účinku N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinu o 0,2M koncentraci po dobu 8 h^|../ Zmutované izoláty byly injekčně vyočkovány na žito a narostlá sklerocia byla analyzována na kvalitativní a kvantitativní obsah námelových alkaloidů. Nejvýše obsahové sklerocium bylo převedeno do saprofytické kultury a ta byla opět podrobena mutaci ethylmethansulfonátem 0,2M koncentrace po dobu 16 hfa^ Získané zmutované izoláty byly v roce 2007 opět injekčně vyočkovány na žito a narostlá sklerocia byla analyzována. V roce 2008 bylo sklerocium tohoto kmene převedeno do saprofytické kultury a tato byla vystavena gama záření o dávce 3000 Gy. Ozářené izoláty byly injekčně vyočkovány na žito a narostlá sklerocia byla analyzována na kvalitativní a kvantitativní obsah námelových alkaloidů. Nejvýše obsahové sklerocium s minimálním obsahem α-ergokryptinu bylo v následujících dvou letech (2009 až 2011) pasážováno na žitě v měřítku poloprovozních pokusů (cca 1ha). Nejvýše obsahové sklerocium sklizené z těchto ploch bylo převedeno do saprofytické kultury a tato byla uložena v České sbírce mikroorganismů Masarykovy Univerzity v Brně, ul. Tvrdého č. 14 pod přírůstkovým číslem CCM8404. Uvedenými mutačními zásahy došlo u kmene CCM 8404 k nárůstu průměrného obsahu i
námelových alkaloidů ve sklerociích o 43 % proti původnímu kmeni CCM8058. Současně došlo ke zkvalitnění spektra jednotlivých alkaloidů tím, že došlo ke zvýšení průměrného obsahu ergokristinu z 82,8 na 88 % v sumě alkaloidů a ke snížení průměrného obsahu nežádoucího α-ergokryptinu z 12,5/$ na 2,5 %.
Příklad 2
POPIS VLASTNOSTÍ NOVÉHO KMENE
Finálním krokem ve tvorbě ergopeptinů (ergokristinu) je kondenzace tří aminokyselinových zbytků s kyselinou D-lysergovou za katalýzy neribozomální peptidylsyntetasy (NRPS), která je kódována v referenčních kmenech Claviceps purpurea vždy dvěma geny (IpsAI a lpsA2; Haarmann et al. 2009). Z mRNA izolované ze sklerocií nového kmene CCM8404 byla připravena „paired-end“ í
knihovna pro sekvencování na platformě lllumina HiSeq 2000. Bylo získáno 43,398,800 párových čtení a ty složeny pomocí softwaru ABYSS (Birol et al., 2009) do kontigů, které odpovídají transkriptům ve sklerociu. Lokálním blastováním knihovny získaných kontigů proti oběma genům IpsAI a lpsA2 byly nalezeny kontigy obsahující ODS sekvenci kódující homologní NRPS v kmeni CCM8404. Ve sklerociích kmene CCM8404 byl detekován pouze transkript pro NRPS kódovanou genem IpsAI. Nepřítomnost transkriptu druhého genu lpsA2 ukazuje na mutaci v promotorové oblasti genu lpsA2, která vedla kjeho umlčení. Přítomnost pouze jedné NRPS vede k majoritní tvorbě pouze jednoho ergopeptinů - ergokristinu. Analýzou aminokyselinové sekvence IpsAI byly nalezeny 3 aminokyselinové adenylační domény (modul), které tvoří vazebné místo pro navázání tři aminokyselin ze struktury ergopeptinů. Byla predikována domnělá residua (vazebný motiv) důležitá pro vazbu substrátu v adenylační doméně všech tří modulů na základě homologie s NRPS se známou strukturou (Tabulka 1; Stachelhaus et al., 1999). Vazebné motivy všech tří modulů kmene CCM8404 byly porovnány s ostatními kmeny Claviceps purpurea, a to P1 (NCBI přístupový kód: IpsAI AJ011964, lpsA2 CAI59268), 20.1 (NCBI přístupový kód: IpsAI AET79183, lpsA2 AET79184) a ECC93 (NCBI přístupový kód: IpsAI JN186799, lpsA2 EU730584), jejichž sekvence jsou dostupné v databázi NCBI (National Centre for Biotechnology Information; Obrázek 1). Ze srovnání je patrné, že motivy modulů 1 a 2 jsou velmi podobné struktuře IpsAI z kmene ECC93, který produkuje směs ergokristinu a ergotaminu.
Z knihoven kontigů RNA kmene CCM8404 a kmenů CCM8057, CCM8178 a CCM8243 byla získána sekvence pro 18S a 5,8S ribozomální RNA a ta porovnána s rRNA geny pro další kmeny Claviceps purpurea, jejichž sekvence jsou dostupné v NCBI databázi. Sekvence posloužily k vytvoření fylogenetického stromu metodou „maximum likehood“ pomocí softwaru MEGA (Tamura et al., 2011; Obrázek 2). Kmen CCM8404 tvoří klastr s dalším průmyslově používaným kmenem uloženým pod sbírkovým číslem CCM8178 produkující především α-kryptin a izolátem CCC165 posbíraným v České republice na hostiteli Poa pratensis. Z fylogenetického stromu je patrné, že CCM8404 je samostatný kmen mající stejný původ s kmenem CCM8178 a odlišný od dalších průmyslově používaných kmenů CCM8057 a CCMŠ243. Kmen CCM8404 spadá do kládu, který je tvořen především přírodními izolátý Claviceps purpurea z Evropy či Severní Ameriky nalezenými především na obilovinách a travách z podčeledi lipnicovité - Pooideae.
Tabulka 1
Srovnání 3 modulů ve struktuře NRPS (IpsAI a lpsA2) zodpovědných za konjugaci aminokyselin v molekule ergopeptinu; zobrazena jsou aminokyselinová residua důležitá pro vazbu substrátu odvozená z krystalové struktury PheA domény gramicidinsyntetázy (Stachelhaus et al., 1999) pro nový kmen CCM8404 a kmeny P1, ECC93 a 20.1, jejichž sekvence jsou dostupné v databázi NCBI.
Tabulka 1
| NRPS | Modul 1 | Substrát | Modul 2 | Substrát | Modul 3 | Substrát | Produkovaný ergopeptin |
| Kmen P1 | |||||||
| IpsAI | DLFFCGGPL | Alanin | DLVGMAAVG | Phenylalanin | DITLVAGLI | Prolin | Ergotamin |
| lpsA2 | DAIFCGGPL | Valin | DLAGMGAVA | Leucin | DITLVAGLI | Prolin | a-Ergocryptin |
| Kmen ECC93 | |||||||
| IpsAI | DAIFCGGCL | Valin | DLVGMAAVG | Phenylalanin | DITLVAGLI | Prolin | Ergokristin |
| lpsA2 | DAIFCGGCL | Alanin Alanin | DLAGMGAVA | Phenylalanin Leucin | DITLVAGLI | Prolin | Ergotamin Ergosin |
| Kmen 20.1 | |||||||
| IpsAI | DAIFCGGPL | Alanin | DLVGMAAVG | Phenylalanin | DITLVAGLI | Prolin | Ergotamin |
| lpsA2 | DAVFCVGPA | Valin | DLAGMGAMI | Leucin | DITLVAGLI | Prolin | d-Ergokryptin |
| Kmen CM8404 | |||||||
| IpsAI | DAIFCGGCL | Valin Valin | DLVGMAAPI | Phenylalanin Leucin | DITLVAGLI | Prolin | Ergokristin a-Ergokryptin |
Při saprofytní kultivaci na sladinovém médiu ztuženém agarem tvoří kmen CCM8404 kolonie z typicky sfaceliového vzdušného mycelia. Mycelium je zpočátku bílé a vzdušné, po 27 dnech kultivace zvrásněné, sametové, bílé. Mycelium je tvořeno rozvětvenými hyfami a konidiemi oválného tvaru délky 7 ažJO pm a šířky 5 až 6 pm.
Při parazitickém růstu na žitě tvoří kmen CCM8404 sklerocia na povrchu světle hnědě pigmentovaná o průměrné hmotnosti 48 mg. Jednotlivá sklerocia obsahují sumu alkaloidů v množství 0,8 ^-(hmotn.)| až 3,1 % (hmotn.), vztaženo na sušinu biomasy sklerocia, při průměrném obsahu 1,8 % (hmotn.) sumy alkaloidů s převahou ergokristinu.
Příklad 3
PŘÍKLAD VYUŽITÍ NOVÉHO KMENE
Z potřebného množství trvanlivé suché námeloviny kmene CCM8404, vyrobené postupem popsaným v patentu č. 276530, se připravila vodná suspenze konidií. Touto suspenzí konidií se pomocí očkovacího stroje naočkovaly klasy žita ve fázi metání tak, že se na plochu 1 ha použilo 3,2x1011 klíčivých konidií. V době zrání žita (zasychání klasů), kdy se začala sklerocia uvolňovat z lůžka, tj. za cca 55 dnů, se provedla sklizeň narostlých sklerocií kombajnem. Z 1 ha bylo získáno 900 kg hnědých sklerocií, obsahujících v průměrném vzorku 1,8 % (hmotn.) sumy alkaloidů (vztaženo na sušinu biomasy) a tato suma byla tvořena průměrně z 88 % ergokristinem a z 2,5 % α-ergokryptinem. Získaná biomasa byla vyextrahována a extrakty byly použity pro výrobu ergokristinu.
Průmyslová využitelnost
Vynález je využitelný ve farmaceutickém průmyslu jako nový zdroj námelových alkaloidů s vysokým obsahem ergokristinu pro výrobu jak čistého ergokristinu a od něj odvozeného dihydroergokristinu, tak pro výrobu polosyntetických derivátů kyseliny lysergové a/nebo ergolinu.
Citovaná literatura:
- Birol I, Jackman SD, Nielsen CB, Qian JQ, Varhol R, Stazyk G, Morin RD, Zhao Y, Hirst M, Schein JE, Horsman DE, Connors JM, Gascoyne RD, Marra MA, Jones SJM. De novo transcriptome assembly with ABySS (2009) Bioinformatics 25, 2872-7.
- Haarmann T, Machado C, Liibbe Y, Correia T, Schardl CL, Panaccione DG, Tudzynski P. The ergot alkaloid gene cluster in Claviceps purpurea: Extension of the cluster sequence and intra species evolution (2005) Phytochem 66, 1312-20.
- Stachelhaus T, Mootz HD, Marahiel MA. The specificity-conferring code of adenylation domains in nonribosomal peptidesynthetases (1999) Chem Biol 6, 493-505.
- Stolí A. a Burckhadt E. (Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem 250, 1, 1937).
- Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods (2011) Mol Biol Evol 28, 2731-9.
Claims (9)
1. Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., uložený v České sbírce mikroorganismů Masarykovy Univerzity v Brně pod přírůstkovým č. CCM8404.
2. Izolovaný kmen houby podle nároku 1, tvořící při parazitickém růstu na obilninách sklerocia, která obsahují sumu alkaloidů od OX/^rhrnete^do 3,1 % hmotn., průměrně 1,8 % hmotn., vztaženo na sušinu biomasy sklerocia.
3. Izolovaný kmen houby podle nároku 2, kde nejméně 83 %, průměrně 88 % sumy alkaloidů je tvořeno ergokristinem.
4. Izolovaný kmen houby podle nároku 2 nebo 3, kde nejvýše 4 %, průměrně 2,5 % sumy alkaloidů je tvořeno a-ergokryptinem.
5. Kultura z kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na žitu - Secale cereale, jeho kultivarech a genetických liniích, nebo na křížencích žita - Secale cereale a pšenice - Tríticum aestivum označovaných Triticale, případně dalších jejich křížencích, jejich kultivarech a genetických liniích.
6. Sklerocia kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
7. Použití kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo kultury podle nároku 5 nebo sklerocií podle nároku 6 pro výrobu námelových alkaloidů, zejména ergokristinu.
8. Použití kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo kultury podle nároku 5 nebo sklerocií podle nároku 6 pro výrobu kyseliny lysergové.
9. Použití kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo kultury podle nároku 5 nebo sklerocií podle nároku 6 pro výrobu polosyntetických derivátů kyseliny lysergové a/nebo ergolinu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-590A CZ2013590A3 (cs) | 2013-07-25 | 2013-07-25 | Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8404 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2013-590A CZ2013590A3 (cs) | 2013-07-25 | 2013-07-25 | Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8404 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ304709B6 CZ304709B6 (cs) | 2014-09-03 |
| CZ2013590A3 true CZ2013590A3 (cs) | 2014-09-03 |
Family
ID=51495050
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2013-590A CZ2013590A3 (cs) | 2013-07-25 | 2013-07-25 | Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8404 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2013590A3 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ2023105A3 (cs) * | 2023-03-15 | 2024-08-21 | Teva Czech Industries S.R.O. | Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9309 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE881864A (fr) * | 1980-02-22 | 1980-06-16 | Richter Gedeon Vegyeszet | Procede pour la preparation de cultures de spores d'une souche virulente de claviceps purpurea sur seigle produisant de l'ergocristine |
| CH649300A5 (de) * | 1981-08-07 | 1985-05-15 | Sandoz Ag | Ergopeptinderivate, ihre herstellung und verwendung. |
| CZ279877B6 (cs) * | 1991-08-01 | 1995-07-12 | Galena, A.S. | Nový průmyslový kmen mikroorganismu druhu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8058 |
| RU2102470C1 (ru) * | 1995-08-02 | 1998-01-20 | Научно-производственное объединение "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений" | Штамм гриба claviceps purpurea tul. - продуцент эргокристина |
-
2013
- 2013-07-25 CZ CZ2013-590A patent/CZ2013590A3/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ304709B6 (cs) | 2014-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tudzynski et al. | Biotechnology and genetics of ergot alkaloids | |
| Shweta et al. | Endophytic fungi from Miquelia dentata Bedd., produce the anti-cancer alkaloid, camptothecine | |
| Hulvová et al. | Parasitic fungus Claviceps as a source for biotechnological production of ergot alkaloids | |
| Wallwey et al. | Ergot alkaloids: structure diversity, biosynthetic gene clusters and functional proof of biosynthetic genes | |
| Pu et al. | Camptothecin-producing endophytic fungus Trichoderma atroviride LY357: isolation, identification, and fermentation conditions optimization for camptothecin production | |
| Fan et al. | Vayg1 is required for microsclerotium formation and melanin production in Verticillium dahliae | |
| Aly et al. | Fungal endophytes–secret producers of bioactive plant metabolites | |
| Emri et al. | Echinocandins: production and applications | |
| Khamna et al. | L-asparaginase production by actinomycetes isolated from some Thai medicinal plant rhizosphere soils | |
| EP2261317B1 (en) | Microorganism producing cyclic compound | |
| Daletos et al. | Microbial coculture and OSMAC approach as strategies to induce cryptic fungal biogenetic gene clusters | |
| Feng et al. | Potential molecular mechanisms for fruiting body formation of Cordyceps illustrated in the case of Cordyceps sinensis | |
| EP2261238B1 (en) | Cyclic compound and salt thereof | |
| CZ2013590A3 (cs) | Izolovaný kmen houby Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM 8404 | |
| KR20150055650A (ko) | 목질진흙상황버섯 자실체의 재배방법 및 이에 의해 재배된 목질진흙상황버섯 자실체 | |
| KR101594511B1 (ko) | 신규한 꽃송이 버섯 균주 | |
| US20120059038A1 (en) | Polyketide compound | |
| Shimizu et al. | Indole-3-carbaldehyde: a tyrosinase inhibitor from fungus YL185 | |
| US20140228278A1 (en) | Antibiotics and methods for manufacturing the same | |
| JP6130248B2 (ja) | 新規化合物キノフラシン類、その製造方法、及びその用途、並びに新規微生物 | |
| CN107723308B (zh) | 一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇 | |
| CZ309511B6 (cs) | Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM8865 | |
| Lim et al. | Fungal isocyanide synthases and xanthocillin biosynthesis in Aspergillus fumigatus. mBio 9: e00785-18 | |
| CN109666680B (zh) | 一株不产黄曲霉毒素菌株ΔAflsnt2及防治黄曲霉污染的应用 | |
| CZ310113B6 (cs) | Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM9309 |