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Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die
12-Stellung von Reichsteins Substanz S
Es ist bereits bekannt, dass man auf biochemischem Wege Hydroxylgruppen als Substituenten an den verschiedensten Stellen in das Molekül von Steroiden einführen kann. Jedoch ist bisher eine Einführung einer Hydroxylgruppe ausschliesslich in die 12-Stellung auf diesem Wege nicht beschrieben worden. Man kennt lediglich eine gleichzeitige Einführung von Hydroxylgruppen in die 12-und 15-Stellung (vgl. Chem.
Ber., Bd. 90 [1957], S. 2576 ff.).
Es wurde nun gefunden, dass bei der Inkubation von Reichsteins Substanz S (4-pregnen-17cx, 21-diol- - 3, 20-dion) mit dem Pilz Coniothyrium hellebori, Rasse 078, aus der Klasse Fungi imperfecti und der Reihe Sphaeropsidales neben dem als Hauptprodukt in 50longer Ausbeute entstehenden Hydrocortison
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B, 17cx, 21-triol-3, 20-dion)- triol-3, 20-dion gebildet wird.
Dieser Befund ist umso überraschender, als nach den Angaben in der brit. Patentschrift Nr. 749, 414 bei der Inkubation des gleichen Ausgangsmaterials mit nahestehenden Pilzen der gleichen Klasse und Reihe als Nebenprodukt ausschliesslich 11-epi-Hydrocortison zu erwarten war.
Der im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens benutzte Stamm Coniothyrium hellebori wurde
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das angegebene Wachstumsverhalten : a) Gerstenähre Wachstum mit guter Pycnidienbildung b) Luzernestengel Wachstum mit guter Pycnidienbildung c) Möhrenagar Sehr gutes Wachstum mit starker Pycnidienbildung d) Reis Gutes Wachstum mit mittelmässiger Pycnidienbildung e) Hafermehlagar Sehr gutes Wachstum mit mittelmässiger Pycnidienbildung f) Bierwürze Sehr gutes Wachstum mit schwacher Pycnidienbildung g) Erde Sehr gutes Wachstum, aber keine Pycnidienbildung.
Ein Muster des Stammes wird in der Biologischen Bundesanstalt Berlin/Dahlem unter der Nr. 8996 aufbewahrt.
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren fallen Haupt- und Nebenprodukt der Knlturfiltratextrakte zunächst als kristallines Gemisch an. Seine vollständige Auftrennung durch Kristallisation ist schwierig und verlustreich. Acetyliert man das nicht weiter aufzutrennende Gemisch unter normalen milden Bedingungen, so entstehen vorwiegend die Monoacetate beider Verbindungen, die sich ebenfalls nur schwer trennen lassen. Acetyliert man dagegen das Gemisch bei höherer Temperatur, so bildet sich neben dem 21-Monoacetat des Hydrocortisons das 12ss, 21-Diacetat des 4-Pregnen-12B, 17a-21-triol-3, 20-dions. Die Trennung dieser Verbindung durch Kristallisation, Gegenstromverteilung oder Verteilungschromatographie bereitet nun keine Schwierigkeiten und gelingt praktisch quantitativ.
Das auf diese Weise rein erhältliche 4-Pregnen-12ss, 17ce, 21-triol-3, 20-dion-12B, 21-diacetat ist ein wertvolles Ausgangsprodukt für Synthesen in der Steroidreihe, insbesondere zur Herstellung pharmazeutisch ihteressanter Verbindungen.
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Beispiel : Es werden 2, 4 I einer Nährlösung hergestellt, die pro Liter folgende Bestandteile ent- hält,
50 g Dextrose
10 g Biomalz (Malzextrakt mit Calciumglycerinphosphat und Vitaminen der B-Reihe)
2 g Natriumnitrat
1 g prim. Kaliumphosphat
0,5 g Kaliumchlorid
0, 5 g Magnesiumsulfat
0,02 g Eisensulfat.
Je 1, 2 I der Lösung werden in einen Laborfermenter von 2 l Inhalt gegeben und hierin 30 min bei 1200C und 1 atü im Autoklaven sterilisiert. Die Fermenter bestehen aus einem Glasgefäss mit einem Deckel aus rostfreiem Stahl ; sie sind ausgerüstet mit einem Turbinen-Rührer, Zugabestutzen, Lufteinleitungsrohr und Luftableitung. Jeder Fermenter wird mit etwa 1 Milliarde Sporen des Coniothyrium hellebori, Rasse 078, in Form einer wässerigen Suspension beimpft und dann 48 h bei 250C mit 500 Umdr/min gerührt. Inzwischen wird in einem Stahlfermenter mit 50 l Fassungsvermögen eine Lösung von 1, 5 kg Dextrose, 30 g prim. Kaliumphosphat und 90 g Natriumnitrat in 30 l Leitungswasser bereitet ; diese Lösung wird 40 min bei 1200C und 1 atü sterilisiert.
Die Kulturen aus den beiden Laborfermentern werden steril entnommen und gemischt ; von der Mischung werden 1, 6 l zur Beimpfung des 50 lFermenters verwendet.
Nach 24stündigem Rühren unter Durchleiten von 1 bis 2 cm3 Luft pro Stunde (250C) werden 5 g Reichstein's Substanz S in 40 cm3 sterilem Dimethylformamid zugegeben. Eine gleiche Menge wird noch zweimal jeweils im Abstand von 24 h zugesetzt. 24 h nach der letzten Zugabe wird die Kultur dem Fermenter entnommen und filtriert, worauf das Kulturfiltrat in einem "Westfalia"-Zentrifugalextraktor viermal mit je 4 l Methylisobutylketon extrahiert wird. Nach chromatographischer Analyse enthält der Extrakt 7,9 g Hydrocortison und 3, 9 g 4-pregnen-128, 1701., 21-triol-3, 20-dion.
Der Extrakt wird im Vakuum bis auf ein Volumen von etwa 150 cm3 eingedampft ; beim Abkühlen kristallisiert dann die erste Fraktion aus. Das nach Abscheiden der erstenKristallfraktion anfallende Filtrat wird wieder eingedampft und durch Kühlen werden weitere Kristallfraktionen gewonnen, die vereinigt und getrocknet werden.
Man erhält auf diese Weise 11 g eines Produktes, das 660/0 Hydrocortison und 271o 4-Pregnen- - 128, 1701., 21-triol-3, 20-dion enthält. Das Rohprodukt wird zweimal aus Äthylenchlorid umkristallisiert, wodurch man 7 g chromatographisch reines Hydrocortison vom Fp. 212-2150C erhält. Die Mutterlaugen werden eingedampft und der Rückstand wird mit 10 cm3 Pyridin aufgenommen ; dann werden 5 cm3 Essigsäureanhydrid zugesetzt und das Gemisch wird 8 h auf 50 C erhitzt. Das Reaktionsprodukt wird nach üblicher Aufarbeitung auf eine Säule gegeben, die 20 g mit Äthylenglykol imprägniertes"Celite", d. h. eine unter diesem Handelsnamen bekannte Mischung verschiedener Kieselerden, enthält.
Eluierung mit einem Gemisch aus drei Teilen Cyclohexan und einem Teil Methylenchlorid ergibt 3, 5 g kristallines Material.
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analyse bestätigt die Zusammensetzung der Verbindung. Der Mischschmelzpunkt mit einem authenti- schen Präparat (J. Chem. Soc. (1955, ], S. 870) gibt keine Depression. Die JR-Spektren beider Substanzen sind praktisch identisch.
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