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Verfahren zur Hydroxylierung von 7-Desoxysteroiden der Pregnanreihe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung einer 7a-ständigen Hydroxylgruppe
in das Steroidgerüst von Verbindungen der Pregnanreihe.
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In jüngerer Zeit haben 11-Hydroxysteroidverbindungen besondere Bedeutung
als therapeutische Mittel bei der Behandlung von Krankheiten erlangt. Zu diesen
Verbindungen gehört Kendall's Verbindung F. Verfahren zur Einführung einer 7a-ständigen
Hydroxylgruppe unter Verwendung von Organismen des Genus Cephalosporium sind jedoch
noch nicht beschrieben. Es wurde nun gefunden, daß es möglich ist, durch die fermentative
Wirkung eines Organismus des Genus Cephalosporium eine a-ständige Hydroxylgruppe
in die 7-Stellung von Reichstein's Substanz S, Progesteron, verwandten Steroidverbindungen
der Pregnanreste und ihren Derivaten einzuführen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren sei durch die folgenden Formelbilder
erläutert:
In diesen Formeln bedeutet R Wasserstoff oder einen niederen Alkanoylrest. Die 7a-ständige
Hydroxylgruppe kann unter Bildung des entsprechenden Esters acyliert werden.
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Reichstein's Substanz S, 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion, ist ein
im Handel erhältliches Produkt, das aus Diosgenin hergestellt wird, das man seinerseits
aus verschiedenen Species der mexikanischen Yamswurzeln aus der Familie Dioscoreaceae
gewinnen kann. Progesteron und andere Ausgangsstoffe sind ebenfalls leicht erhältlich.
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Das Genus Cephalosporium gehört zur Klasse der Fungi Imperfecti, die
sich im allgemeinen ungeschlechtlich vermehren. Verschiedene Isolate von Cephalosporiumarten
sind als Cephalosporium asperum und Cephalosporium sp-NRRL 1966 klassifiziert worden.
Die im folgenden genannte Kultur Z 164 wurde untersucht und hat sich in morphologischer
und physiologischer Hinsicht als mit Cephalosporium sp-NRRL 1866 identisch erwiesen.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Organismus
des Genus Cephalosporium, beispielsweise Cephalosporium asperum und/oder eine andere
Cephalosporiumart, in einem geeigneten Nährmedium aerob gezüchtet und auf Substanz
S oder einem ihrer Ester, z. B. das Acetat oder eine verwandte 7-Desoxysteroidverbindung
der Pregnanreihe, wie Progesteron oder Desoxycorticosteron, einwirken gelassen.
Während des unter günstigen Bedingungen erfolgenden Wachstums des Organismus wird
eine a-ständige Hydroxylgruppe in die 7-Stellung eingeführt. Der genaue Verlauf
dieser Oxydation ist noch ungeklärt, doch ist sie das Ergebnis der durch den Organismus
während seines Wachstums gebildeten Enzyme. Ein geeignetes Nährmedium enthält eine
lösliche Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralstoffe. Kohlenstoffquellen
sind beispielsweise Maisstärke, Melasse, Maltose, Dextrose, Saccharose, Xylose,
Galactose,
Glycerin, Mannit_und verschiedene organische Säuren, wie Zitronensäure, Äpfelsäure,
Essigsäure und verschiedene kohlehydrathaltige Naturprodukte, wie Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl und viele andere leicht erhältliche Materialien,
die schon bisher als Kohlenstoffquellen:bei Fermentationsverfahren verwendet wurden.
Gewöhnlich kann eine Mehrzahl der oben angeführten Substanzen mit guten Ergebnissen
für den Aufbau des Mediums@vef#vendet werden.
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Zu den geeigneten Stickstoffquellen gehören einige der oben angeführten
Stoffe, wie Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl :und verschiedene
andere, wie Fleischextrakt, Casein, Hefe, enzymatisch verdaute Proteine und Abbauprodukte,
wie Peptone,-Aminosäuren und viele andere erhältliche Eiweißstoffe, die sich bei
Fermentationsverfahren als das Wachstum von Fungi fördernd erwiesen haben. Auch
verschiedene anorganische Stickstoffquellen, wie Harnstoff, Ammoniumsalze und Nitrate,
können dem Medium- als Quelle assimilierbaren Stickstoffs zugesetzt werden, um so
ein das Wachstum des Organismus günstig beeinflussendes Substrat zu erhalten. -Gewöhnlich
wird ein großer Teil der Mineralstofferfordernisse der Fermentation durch die nicht
gereinigten Stoffe, die als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen verwendet werden,
gedeckt oder ist in dem bei dem. Verfahren verwendeten Wasser- -vorhanden. Im allgemeinen
ist es jedoch zweckmäßig, die normalerweise vorhandenen Mineralstoffe durch zusätzliche
Mengen zu ergänzen, wenn man ein maximales Wachstum des Fungus erzielen will. Zu
den zweckmäßigenveise zusätzlich eingeführten Kationen und Anionen- gehören beispielsweise
Phosphat, Sulfat, Chlorid, Natrium, Kalium, Magnesium, Eisen, Calcium, Kobald und
Mangan. Weitere Angaben über die Verwendung von Mineralstoffen zur Förderung des
Wachstums von Fungi können der einschlägigen Literatur entnommen werden.
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Die 7-Desoxysteroidverbindungkann dem Medium vor oder 1 oder 2 Tage
nach der Beimpfung zugesetzt werden. Die Fermentation wird dann etwa 1 bis 5 Tage
oder länger weitergeführt.
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Zur Herstellung des Impfmaterials werden 5 bis 10 ml steriles Wasser
zur Suspension des Oberflächenwachstums eines Schrägagars der Kultur verwendet.
Die erhaltene Sporen- und Mycelsuspension wird zur Beimpfung von zwei bis drei 100-ml-Anteilen
sterilen Mediums in 5001n1 Erlenmeyerkolben eingesetzt, wie dies in den weiter unten
wiedergegebenen Beispielen dargelegt ist. Nach der Beimpfung werden die Kolben auf
einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung etwa 2 bis 4 Tage bei 23'C bebrütet.
Der Inhalt von zwei oder drei Kolben dient zur Beimpfung von 121 sterilen Mediums
in einem 201 fassenden Fermentationsgefäß.
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Fungi des Genus Cephalosporium wachsen bei allen Temperaturen zwischen
5 und 37°C, weshalb es möglich ist, die Oxydation innerhalb dieses Bereichs durchzuführen.
Temperaturen zwischen etwa 15 und 30'C
sind bevorzugt, und im allgemeinen
wird die Umsetzung bei etwa 23°C durchgeführt.
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Während der Gärung wird belüftet, indem man sterile Luft mit einer
Geschwindigkeit von etwa 1/3 bis 2 Volumina Luft je Volumen :Medium in der Minute
durch das Medium, leitet. Um das Mycel und andere unlösliche Bestandteile in Suspension
zu halten, wird mechanisch gerührt. Entschäumer, wie Silicone, Glyceridöle u. dgl.,
können von Zeit zu Zeit und in den erforderlichen Mengen zugesetzt werden. -Die
zu oxydierende Steroidverbindung wird in Lösung oder in feinverteilter Form in die
Fermentation eingeführt. Eine bevorzugte Arbeitsweise besteht darin, die Steroid-Verbindung
in Methanol oder andern mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln zu lösen und bei der
gewünschten Verfahrensstufe dem Fermentationsmedium zuzusetzen. Dabei -kann die
Steroidverbindung aus der Lösung ausfallen, sie wird jedoch gleichmäßig indem Medium
unter Bildung einer feinen Suspension dispergzert und kann damit durch den Organismus
leicht oxydiert werden. Die in die Fermentation eingeführte Steroidmenge kann beträchtlich
variieren, liegt jedoch im allgemeinen in der Größenordnung von 1/1o bis 1 g je
Liter Medium.
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Am. Ende der Gärung wird die gewünschte in 7-Stellung hydroxylierte
Steroidverbindung nach folgender Arbeitsweise aus dem Fermentationsmedium gewonnen,
die am Beispiel einer-. 10-ml-Fermentation. erläutert wird.. Diese Arbeitsweise
ist jedoch allgemein anwendbar und läßt sich bei Fermentationen verschiedener Ausmaße
durchführen.
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100 bis 150 ml Aceton werden zu 10 ml Gärmaische gegeben, wonach das
Gemisch einige Zeit bei Zimmertemperatur stehengelassen und anschließend abfiltriert
wird. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, bis kein Aceton mehr
zurückbleibt. Das Volumen des wäßrigen Anteils beträgt dann 10 bis 15 ml, die in
einen Scheidetrichter übergeführt und mit etwa 100 ml Wasser versetzt werden. Die
wäßrige Lösung wird dann viermal mit je 20 m1 Methylenchlorid extrahiert. Die vier
Extrakte werden vereinigt und einmal mit 20/jgem wäßrigem Natriumbicarbonat und
dann zweimal mit jeweils etwa 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen.
Die gewaschene Methylenchloridlösung wird über - wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet
und filtriert. Das Filtrat wird auf einem Dampfbad bei Atmosphärendruck auf 3 bis
5 ml eingeengt; und das Konzentrat wird in einem 10-ml-Meßkölbchen mit Methylenchlorid
aufgefüllt. Diese Lösung dient zur Ermittlung des Steroidgehalts, wie sie weiter
unten beschrieben ist.
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Bei Fermentationen im, großen Maßstab kann man das Rohprodukt oder
die Rohprodukte aus der Gärmaische durch einfache Lösungsmittelextraktion gewinnen,
wobei man ein geeignetes, mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie chlorierte
niedere Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ester und Ketone, verwendet. Die weitere Reinigung
und Abtrennung der gebildeten Steroidverbindungen aus den Extrakten wird nach an
sich bekannten Methoden durchgeführt. Zur Trennung von Steroidgemischen ist es häufig
erforderlich, chromatographische Arbeitsweisen anzuwenden.
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Zum Nachweis der in dem oben beschriebenen Gärmaischeextrakt vorhandenen
Steroidverbindungen kann man sich der Papierstreifenchromatographie bedienen. Als
Lösungsmittelsysteme kann man folgende verwenden Wasser-Methanol-Benzol, hergestellt
durch Schütteln von etwa 5001, Wasser und 5001, Methanol mit Benzol
in einem Scheidetrichter und Stehenlassen zur Erzielung der Phasentrennung oder
Schütteln von 7,5 Teilen Benzol, 25 Teilen Petroläther (Siedebereich 90 bis 100°C),
40 Teilen Essigsäure, 40 Teilen Propionsäure und 20 Teilen Wasser. Ein Teil der
unteren Schicht wird in einer offenen Schale auf den Boden eines großen Glaszylinders
gestellt. Die obere Schicht dient als mobile Phase und wird in den trogförmigen
Vorratsbehälter innerhalb des Zylinders eingefüllt. Man stellt Ständardsteroidlösungen
her, indem man jeweils 10 mg der folgenden Steroidverbindungen in jeweils 10 ml
Methylenchlorid löst Reichstein's Substanz S, Progesteron, -Desoxycorticosteron.
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Wenn es zweckmäßig ist, kann man auch andere Steroide für die Standardlösung
verwenden. Zusammen
mit einer Lösung unbekannter Zusammensetzung
wird mindestenseineStandardsteroidlösung chromatographiert. Genau 0,025 ml der Standardsteroidlösung
werden auf den Papierstreifen bei der Startlinie, etwa 10 cm vom oberen Ende des
Streifens entfernt, aufgebracht; der dann über die Kante des Trogs gefaltet und
in die mobile Phase eingetaucht wird. Der Streifen wird dann 2 bis 4 Stunden bei
37°C entwickelt. In gleicher Weise werden 0,1 ml der Lösung unbekannter Zusammensetzung
auf einen anderen Streifen aufgebracht, der dann in den gleichen Trog eingelegt
und zusammen mit dem Standard entwickelt wird. Nach ausreichender Entwicklung werden
die Streifen an der Luft getrocknet. Danach werden die Streifen mit einer alkalischen
Lösung von Tetrazoliumblau besprüht, wodurch eine Färbung mit Steroidverbindungen
hervorgerufen wird, die eine Ketolseitenkette tragen, oder die Streifen werden durch
eine Zinksulfidplatte betrachtet, nachdem man sie Ultraviolettlicht ausgesetzt hat,
wodurch es möglich wird solche Steroidverbindungen zu erkennen, die eine zur 3-Ketogruppe
a,ß-ständige Doppelbindung enthalten. Die Streifen werden neben wenigstens einem
Standardstreifen gelegt und ausgewertet. Die verschiedenen Steroidverbindungen können
durch ihre Lage auf den Streifen identifiziert werden.
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Die nach dem erfindungsgemäßenVerfahren erhältlichen 7a-Oxysteroidverbindungen
wirken ganz allgemein entzündungshemmend, eine Eigenschaft, die für Glucocorticoide,
wie Hydrocortison, typisch ist.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
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Beispiel 1 Maisquellwasser ..................... 0,6 ml Dextrose
........................... 2,0 g Lactalbuminhydrolysat ............... 2,0
g Wasser ............................. 100 ml Der auf etwa 7 eingestellte pH-Wert
fällt bei der Behandlung im Autoklav etwa 1 Einheit ab.
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121 des vorstehend beschriebenen Mediums werden in einem Autoklav
behandelt und weisen danach einen pH-Wert von etwa 6,4 auf. Das Medium wird mit
600 ml eines 3tägigen Mycelwachstums von Cephalosporium sp (Lederle Kultur Nr. Z
164) beimpft. Die Fermentation wird bei 28°C 48 Stunden durchgeführt, wonach eine
Lösung von 6 g Reichstein's Substanz S in 120 ml Methanol zugesetzt und die Fermentation
120 Stunden fortgeführt wird. Es werden täglich Proben chromatographisch untersucht,
und nach dem Ende der Gärung zeigt der Papierstreifen einen schwachen Flecken für
Substanz S und einen starken Flecken für das 7a-Oxyderivat.
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Die erhaltene Gärmaische wird abfiltriert und das Mycel mit 21 Aceton
gewaschen. Der Extrakt wird mit der Gärflüssigkeit vereinigt und das Aceton unter
vermindertem Druck abgedampft. Danach extrahiert man viermal mit je 21 Methylenchlorid.
Die Extrakte werden vereinigt und zweimal mit- gesättigter Salzlösung gewaschen.
Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird der Extrakt unter vermindertem
Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält 5 g einer schmierigen festen Substanz.
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Der Rückstand wird dann in einem Teil der Lösungsmittelphase folgenden
Systems gelöst: Essigsäureäthylester 8 Gewichtsteile, Petroläther (Siedebereich
90 bis 100°C) 3 Gewichtsteile, Methanol 6 Gewichtsteile, Wasser 4 Gewichtsteile.
Die Lösung wird an einer Säule verteilt, die aus 320 g Diatomeenerde und 160 g der
wäßrigen Phase des oben angegebenen Systems besteht. Die die gewünschte Steroidverbindung
enthaltenden Eluate werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Man erhält 4,5 g einer, schmierigen Festsubstanz. Kristallisation des Rückstands
aus Aceton-Petroläther (60 bis 70°C) liefert Kristalle vom F.= 209 bis
211'C [a] 2n`' = -I-94° (Methanol) ; Ultraviolettspektrum
bis 243 m#t (e = 14 800). Das Infrarotabsorptionsspektrum zeigt, daß die Verbindung
das 4-Pregnen-7a,17a,21-triol-3,20-dion ist. Analyse: C"H"05 (362,45).
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Berechnet ............ C 69,58, H 8,34°/o; gefunden
............ C 69,40, H 8,56 °/o. Beispiel 2 100 ml. eines Mediums (A), bestehend
aus 2 °/o Melasse (bekannt unter dem Handelsnamen Grandma's), 10/0 Pankreashydrolysat
von Casein [bekannt unter dem Handelsnamen N-Z Amin-Typ A (sheffield)] und
10/,
Maisstärke mit einem pH-Wert von 7,0, werden in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben
mit einer Sporensuspension von Cephalosporium species (Lederle Kultur Nr. Z 164)
beimpft. Der Kolben wird 72 Stunden auf einer SchüttelvärrichtungmitHin-und Herbewegung
(120 Schwingungen je Minute) bei 23°C gehalten. Danach werden 2 ml des gebildeten
Wachstums auf einen anderen Kolben, der 100 ml des Mediums A enthält, überimpft.
Die Inkubation wird wie oben beschrieben durchgeführt. Nach 24 Stunden setzt man
eine Lösung von 20 mg Progesteron in 1 ml Methanol zu. Die Inkubation wird fortgesetzt,
und 120 Stunden nach Zugabe der Steroidverbindung zeigen die Papierchromatogramme
eine gute Ausbeute von 7a-Oxyprögesteron.
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Beispiel 3 Man arbeitet unter den im Beispie12 beschriebenen Bedingungen,
verwendet jedoch 11-Desoxycorticosteron (D O C) als Substrat. Ein Papierchromatogramm
einer 120 Stunden Probe läßt nur 7a-Oxy-11-desoxycorticosteron erkennen. Diese Verbindung
wird in guter Ausbeute gebildet.
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Beispiel 4 Bei einem, weiteren Versuch unter Verwendung von Cephalosporium
sp NRRL 1866 und Cephalosporium asperum unter den in Beispie12 beschriebenen Bedingungen,
wobei Reichstein's Substanz S als Substrat dient, erhält man nach 96stündiger Fermentation
die in 7a-Stellung hydroxylierte Reichstein's Substanz S.
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Beispiel 5 Eine Lösung von 100 mg 4-Pregnen-7a,17a,21-triol-3,20-dion
in 1 ml Pyridin wird mit 0,026 ml Essigsäureanhydrid versetzt und über Nacht stehengelassen.
Nach Zugabe von Wasser werden die Kristalle abfiltriert und mit Wasser gewaschen.
Man erhält 60 mg 4-Pregnen-7a,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat (540/0) vom F. =
197 bis 203°C. Durch Umkristallisieren aus Aceton-Petroläther steigt der Schmelzpunkt
auf 210 bis 211,5°C an. Das Produkt besitzt folgende Kennzahlen: [a] D = -I-111°
(aD =-f-1,27°, 11,46 mg, 1 ml CHC13). Ultraviolett-
Analyse: C23 H32
0 s (404,49).
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Berechnet ............ C 68,29, H 7,97; gefunden ............
C 67,92, H 8,15. Beispiel 6 Ein Gemisch aus 60 mg 4-Pregnen-7a,17a,21-triol-3,20-dion,
5 ml Pyridin und 2 m1 Essigsäureanhydrid
wird über Nacht bei Zimmertemperatur
stehengelassen. Die Lösung wird auf Eiswasser gegossen, und das kristalline Material
wird abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhält 60 mg (810/,) 4-Pregnen-7a,17a,
21-triol-3,20-dion-7,21-diacetat vom F. = 253,5 bis 256°C.
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Nach Umkristallisieren aus Aceton-Petroläther liegt der Schmelzpunkt
bei 246 bis 248°C. [a] = -f-107° (aD
= -f-1,00, 18,72 mz, 2 ml CHCl,). Ultraviolett-
1632, 1235, 1042 cm-'. Analyse: C"H3407 (446,52).
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Berechnet ............ C 67,24, H 7,68, OAc 19,3; gefunden
............ C 67,50, H 7,90, OAc 19,3.