DE1036852B - Verfahren zur Herstellung von in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten Steroiden - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten Steroiden Es ist bereits bekannt, auf biochemischem- Wege, z. B. mittels Nebennieren, Nieren und Lebern, insbesondere mit deren Homogenaten oder auch bei ihrer Durchströmung (siehe z. B. F. W. K ah n t und A. Wettstein, Helv. Chim. Acta; Bd. 34, 1951, S. 1791); --ferner auf mikrobiologischem Wege (siehe z. B. P e t e r s o n und Murray, Jöurn, Am. Chem. Soc., Bd, 74, 1952, S.1871; F. W. K ah n t untl Mitarb., Experientia, Bd.8, 1952, S.422) Sauerstoff, insbesondere Hydroxy lgruppen in 11,8- und 11 a-Stellung sowie Oxogruppen in 11-Stellung von Steroiden einzuführen. - Die verwendeten Ausgangsstoffe wiesen immer die für Steroide typische 18ständige Methylgruppe auf.
• Es wurde -nun gefunden, däß man zu physiologisch besonders interessanten Produkten gelangen kann, wenn man von Verbindungen ausgeht, die in 18-Stellung eine freie bzw. funktionell abgewandelte sauerstoffhaltige Methylgruppe enthalten. Solche Verbindungen sind z. B. erhältlich durch Totalsynthese analog zu den in dem südafrikanischen Patent Nr. 22/55 beschriebenen Verfahren oder nach dem Verfahren der Patentanmeldung C 10664 IVb/12o, ferner aus Naturstoffen, die in 18-Stellung bereits einen Substituenten tragen.
• Erfindungsgemäß erhält man die neuen Produkte enzymatischer Oxydation, wenn man gesättigte oder ungesättigte, in 3,18,20-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierte Pregnander ivate bzw. ihre funktionellen Derivate der aeroben Einwirkung von Enzymen unterwirft, die Sauerstoff in die 11-Stellung einzuführen vermögen, und die,oxydierten Stoffe abtrennt. Die Ausgangsstoffe sind von beliebiger sterischer Konfiguration, auch Racemate, und enthalten an den Kohlenstoffatomen 3, 18 und 20 freie oder funktionell abgewandelte Oxy- und/oder Oxogruppen, beispielsweise Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazoll- oder_Semicarbazongruppen, ferner Enolgruppen, wie solche von Enolestern, Enoläthern oder Enaminen. Außerdem können sie weitere Substituenten aufweisen, mit Ausnahme der Stellung 11. Doppelverbindungen befinden sich beispielsweise in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 14-, 15-und/oder 16-Stellung. Insbesondere finden Verwendung gesättigte oder ungesättigte in 3,18,20,21-Stellung durch eine Sauerstoffhaltige Gruppe substituierte Pregnanderivate, die zusätzlich auch in 16- und/oder 17-Stellung einen sauerstoffhaltigen Substituenten enthalten können, vorzugsweise 3,18,20-Trioxo-, 3,20-Dioxo-18-oxy-, 3,18-Dioxy-20-oxo, 3,18-Dioxo-20-oxy-, 3-Oxy-18,20-dioxy-, 3,20-Dioxy-18-oxo-; 18,20-Dioxy-3-oxo oder 3,18,20=Trioxy-pregnanderivate, entsprechende Verbindungen mit einer Oxy- oder Oxogruppe in 21-Stellung sowie die funktionellen Derivate all dieser Verbindungen.
• Die verwendeten Enzyme können mikrobiologischer B erkunft sein, wobei man die Ausgangsstoffe z. B. zusammen mit lebenden Mikroorganismen aerob "bebrütet, die Sauerstoff in 11-Stellung- einzuführen vermögen. Man kann aber auch die Enzyme aus dem Kulturfiltrat bzw. den Mikroorganismen mehr oder weniger abtrennen und dann nicht in Anwesenheit lebender -Mikroorganismen arbeiten. Die Mikroorganismen, z. B. solche der Gruppen Mucorales; Yenicillium, Actinomyceten, wie Streptomyceten, Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, oder fungi imperfecti, werden in an sich bekannter Weise gezüchtet, z. B. in stehenden oder in untergetauchten, bewegten Kulturen, die zweckmäßig assimillierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlehydrate enthalten. Das -praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikäfabrikatiön als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder' Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglyleol; zu und be@larütet weiter. Schließlich trennt.: man vorn Mycel ab, ex- #me und trahiert das Filtrat und/oder die ',Mydelg trennt aus dem Extrakt die Reaktionsprodttlcte in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmi,schungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, ,. Kristalli-9ätioh oder Überführung ,iri funktionelle berivate,`'crie Girxrd-Verbindungen, ab: An Stelle von Enzymen mikrobiologischer Herkunft können auch z. B. solche aus tierischen Organen, insbesondereNebennieren, Verwendung finden. Das hierbei einzuschlagende Verfahren, Durchströmung durch die Organe und insbesondere die Anwendung von Homogenaten, ist ebenfalls an sich bekannt (siehe z. B. vorstehend genannte Literatur): Die Verfahrensprodukte können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwischenprodukte zu ihrer Herstellung dienen. Von größtem praktischem Interesse sind insbesondere Aldosteron und die mit ihm in nahem strukturellem Zusammenhang stehenden, in 4-Stellung ungesättigten 3,20-Diketo-11,18,21-trioxypregnene sowie die entsprechenden 3,11,20-Triketo-18,21-dioxy-pregnene und A4-3,11,18,20-Tetraketo-21-oxy-pregnene bzw. ihre funktionellen Derivate.
• Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
• Beispiel 1 41 einer Nährlösung, enthaltend 40g Rohglucose, 240 cm-' Maisquellwasser (Cornsteep liquor), 20 g Na Cl, 4 g Ca C 03 und Leitungswasser, werden mit verdünnter Natronlauge auf PH = 6,6 gebracht, gleichmäßig auf zwölf Erlenmeyerkolben von je 11 Fassungsvermögen verteilt und sterilisiert. Nach Impfen mit Cunninghamella blakesleena werden die Kolben bei 26° C mechanisch geschüttelt. Nach 60 Stunden wird eine Lösung aus 1,0 g 4-Pregnen-18,21-diol-3,20-dion in 40 cm3 Methanol gleichmäßig unter sterilen Bedingungen zu den gut entwickelten Kulturen zugegeben und noch weitere 48 Stunden bei 26° C geschüttelt. Das Mycel wird abgetrennt und das Kulturfiltrat (pH 8,2) erschöpfend mit Essigester ausgeschüttelt. Den Extrakt wäscht man mit 0,1 n-Salzsäure, 2% Natriumbicarbonatlösung und Wasser, trocknet ihn über Natriumsulfat und dampft ihn im Vakuum bei 30° C ein. Der Rückstand (980 mg) wird in warmem Benzol aufgenommen und an einer mit Benzol bereiteten Säule von 30g Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagel«) nach der Durchlaufmethode chromatographiert. Es wird mehrere Male mit je 100 crri3 Benzol, Äther, Äther-Essigester (9 : 1), Äther-Essigester (8 : 2), Äther-Essigester (1 :1), Essigester, Essigester-Methanol (9:1), Essigester-Methanol (8 :2) und Methanol cluiert. Die papierchromatographische Untersuchung der einzelnen Fraktionen zeigt, daß die ersten Fraktionen Ausgangsmaterial und die Essigester-Methanol- und die Methanol-Fraktion ein Gemisch hochpolarer Produkte enthalten. Aus den mittleren Fraktionen hingegen kann eine Verbindung abgetrennt werden, die höher polar ist als das Ausgangsmaterial. Sie enthält die in 4-Stellung ungesättigte 3-Ketogruppierung (U V Ä"", = 241 mR), die a-Ketolseitenkette (Reduktionsvermögen) und ein zusätzliches Sauerstoffatom (Analyse). Das so erhaltene 4-Pegnen-11 ß,18,21-triol-3,20-dion läßt sich durch Umlosen aus Aceton-Äther-Petroläther-Gemischen weiter reinigen. Beispiel 2 41 einer Nährlösung, enthaltend 60 g Pepton, 25 em3 Maisquellwasser (Cornsteep liquor), 200 mg Rohglucose und Leitungswasser, werden mit -verdünnter Natronlauge auf p$ 6,5 gebracht, gleichmäßig auf zwölf Erlenmeyerkolben von je 1 1 Fassungsvermögen verteilt und sterilisiert. Nach Impfen mit Rhizopus nigricans werden die Kolben bei 25° C mechanisch geschüttelt.. Nach 48 Stunden haben sich die Kulturen gutentwickelt. Unter sterilen Bedingungen wird eine Lösung aus 1,0 g 4-Pegnen-18-ol-3,20-dion in 40 cm3 Methanol gleichmäßig auf die zwölf Erlenmeyerkolben verteilt und noch weitere 48 Stunden bei 25° C geschüttelt. Nach Abtrennung des Mycels werden das Ausschütteln und die chromatographische Aufarbeitung des Extraktes in gleicher Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die papierchromatographische Untersuchung der einzelnen chromatographischen Fraktionen zeigt, daß die Essigester-Methanol- und die Essigester-Fraktionen ein hochpolares Gemisch enthalten, während aus den Äther-Essig- und den Essigester-Fraktionen eine Substanz abgetrennt werden kann, die höher polar als das Ausgangsmaterial ist. Die Kohlenstoff-Wasserstoff-Bestimmung weist auf den Eintritt eines Sauerstoffatoms hin, und das UV-Spektrum (@max = 241 m[.) zeigt die in 4-Stellung ungesättigte 3-Ketogruppierung an. Durch Umlosen aus ACeton-Äther-PetrOläther-Gemischen erhält man das 4-Pregnen-11 a,18-diol-3,20-dion. Beispiel 3 Wie im Beispiel 1 beschrieben, werden zwölf Kulturen von Cunninghamella blakesleena hergestellt. Dazu wird unter sterilen Bedingungen eine Lösung aus 1,0 g 4-Pregnen-21-ol-3,18,20-trion in 40 cm3 Aceton gleichmäßig zugegeben. Nach 48stündigem Schütteln bei 26°C wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat (p$ = 8,0) unter Kühlung mit Essigester ausgeschüttelt. Der Extrakt wird mit Eiswasser gewaschen, getrocknet, bei Zimmertemperatur eingedampft, der Rückstand (950 mg) in Methylenchlorid gelöst und an 30 g Kieselsäuregel (bekannt unter dem Handelsnamen »Silicagel«) nach der Durchlaufmethode chromatographiert. Man eluiert mehrere Male mit je 100 crn3 Methylenchlorid, Chloroform, Chloroform-Aceton (9 : 1), Chloroform-Aceton (1 :1) und Aceton. Die papierchromatographische Untersuchung zeigt Ausgangsmaterial in den ersten Chloroformfraktionen und hochpolare Produkte in den Acetonfraktionen. Die letzten Chloroformfraktionen enthalten eine Verbindung mit etwas stärkerer Polarität als 11-Desoxycorticosteron, während in den Chloroform-Aceton-Fraktionen eine Verbindung vorliegt, die sich papierchromatographisch fast gleich wie Cortison verhält. Letztere wird aus den einheitlichen Fraktionen abgetrennt und durch Kristallisation aus Aceton-Äther weiter gereinigt. Das so erhaltene 11-18-Cyclohalbacetal des 4-Pregnen-11,B,21-diol-3,18,20-trions schmilzt bei 165 bis 168° C.
• Wenn man vom 21-Acetat ausgeht, gelangt man zu derselben Verbindung. Sein Diacetat schmilzt unscharf bei 70 bis 72° C, sein daraus durch partielle Hydrolyse mit Natriumbicarbonat bei Zimmertemperatur erhaltenes 18-Monoacetat bei 220° C, das durch partielle Acetylierung erhaltene Monoacetat bei 190 bis 192° C.

Claims (4)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von in 11-Stellung durch eine sauerstoffhaltige Gruppe substituierten Steroiden durch Behandlung der entsprechenden 11-Desoxysteroide mit Kulturen von oxydierend wirkenden Mikroorganismen, mit den aus diesen gewonnenen oxydierend wirkenden Enzymen oder mit oxydierend wirkenden Enzymen, die tierischen Organen, insbesondere Nebennieren, entstammen, unter aeroben Bedingungen und Abtrennung der oxydierten Steroide, dadurch gekennzeichnet, daß man gesättigte oder ungesättigte, in 3,18,20-Stellung durch eine Sauerstoff enthaltende Gruppe substituierte Pregnane bzw. deren funktionelle Derivate als Ausgangsverbindungen für die biologische Oxydation verwendet.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Oxydation mit Kulturen von Mikroorganismen der Gruppen Mucorales, Pencillium, Actinomyces, wie Streptomyces, Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia oder Fungi imperfecti, bzw. den aus diesen gewonnenen Enzymen durchführt.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man gesättigte oder ungesättigte 3,18,20,21-tetraoxigenierte Pregnanderivate bzw. ihre funktionellen Derivate, insbesondere 4-Pregnen-18,21-diol-3,20-dion oder 4-Pregnen-21-o1-3,18,20-trion, als Ausgangsstoffe verwendet.
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man 4-Pregnen-18-ol-3,20-dion als Ausgangsstoff verwendet.