DE1095278B

DE1095278B - Verfahren zur Herstellung von 6ª‰-Hydroxysteroiden

Info

Publication number: DE1095278B
Application number: DESCH24193A
Authority: DE
Inventors: Fernando Carvajal
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: MSD International Holdings GmbH
Priority date: 1955-06-07
Filing date: 1956-06-05
Publication date: 1960-12-22

Description

Verfahren zur Herstellung von 6 ß-Hydroxysteroiden Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen Steroidverbindungen durch biologische Hydroxylierung der entsprechenden 6-Desoxyverbindungen. Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen stellen therapeutisch wertvolle Mittel sowie nützliche Zwischenprodukte bei der Synthese von physiologisch wirksamen Carticoiden, wie insbesondere 6ß-Hydroxy-1,4-pregnadienen dar, die leicht in bekannte physiologisch wirksame hormonähnliche Substanzen übergeführt werden können.
Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen können durch die nachstehende allgemeine Formel I in der X = H2, O oder (H, O R), Y --_ H oder O R und R = H oder Acyl bedeutet und die 1(2)-Stellung auch gesättigt sein kann, dargestellt werden.
Geeignete Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion, die entsprechenden 11ß-Hydroxy- oder 11 a-Hydroxyanalogen, das 11-Desoxyanaloge sowie deren 21-Ester. Weiter sind Steroide, wie 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,20-dion, und ihre Analogen mit Sauerstoff in 21-Stellung als Ausgangssubstanz verwendbar.
Die Einführung einer 6ß-ständigen Hydroxylgruppe in ein Steroidmolekül ist in der Literatur beschrieben. Peterson und Mitarbeiter (J. Amer. Chem. Soc., 75, S. 412 [1953]) haben das 6ß-Hydroxyderivat von Reichsteins Substanz S durch fermentative Reaktion zwischen 4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion und einem Mikroorganismus der Art Rhizopus arrhizus isoliert. In einer früheren Arbeit (J. Amer. Chem. Soc., 74, S. 5933 [1952]) zeigten Peterson und Mitarbeiter, daß die Reaktion zwischen dem genannten Organismus und Progesteron zu einem Gemisch von Produkten führt, das 11 a-Hydroxyprogesteron mit einem kleinen Prozentgehalt an 6ß,11 a-Dihydroxyprogesteron enthält. Über die Verwendung von Aspergillus nidulans zur Einführung der 6ß-Hydroxylgruppe in Reichsteins Substanz S und 16a-Hydroxyprogesteron zugleich mit der Einführung einer Hydroxylgruppe an anderen Stellen des Moleküls ist von Fried u. a. in Recent Progress Hormone Research 11, S. 149 [1955] berichtet worden. Weiter ist bekannt daß durch Einwirkung des Fungus Gliocladium catenulatum auf Progesteron eine geringe Menge von 6ß-Hydroxyandrostendion gebildet wird. Andere Veröffentlichungen beschreiben ebenfalls Verfahren zur Einführung einer 6ß-ständigen Hydroxylgruppe. Jedoch haben alle bekannten Verfahren zur Einführung einer 6ß-ständigen Hydroxylgruppe den Nachteil, daß ein Gemisch von Produkten erhalten wird oder, wenn ein einzelnes Produkt erhalten wird, dieses in geringer Ausbeute gebildet wird. Derartige Gemische von Produkten ähnlicher Polarität sind schwer zu trennen, und es sind dafür lange und lästige Extraktionen und Verfahrensmaßnahmen zur Gewinnung der reinen Substanzen erforderlich.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Einführung einer 6ß-ständigen Hydroxylgruppe in ein Steroidmolekül mit im wesentlichen quantitativer Ausbeute ermöglicht. Insbesondere wurde gefunden, daß ein Mikroorganismus der Gattung Chaetomium sich insofern einzigartig verhält, als nur eine Stellung des Steroidkerns angegriffen wird. Es wurde gefunden, daß von der Gattung Chaetomium die Arten C. funicolum (QM 33 C), C. cochliodes, C. mollipilium und C. succineum in ihrer Wirksamkeit einander etwa gleichwertig sind und in ihrer Gesamtheit gewissen anderen Arten der Gattung Chaetomium überlegen sind. Durch Kultur und Inkubation einer der genannten Arten von Chaetomium und durch Zusammenbringen des wachsenden Organismus mit dem Ausgangsmaterial wird nach 24 bis 72 Stunden im wesentlichen eine 100°/oige Umwandlung erreicht, und das entsprechende 6ß-Hydroxyprodukt kann leicht isoliert werden. Insbesondere wird 1,4-Pregnadien-6ß,11ß,17a,21-tetrol-3,20-dion erhalten, wenn man 1,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat mit einer Art von Chaetomium, wie C. funicolum (QM 33 C), oder einem daraus gewonnenen enzymatischen Extrakt gemäß in der Literatur beschriebenen Verfahren bebrütet.
Wenn das Ausgangsprodukt in 21-Stellung eine Estergruppe enthielt, findet manchmal eine Verseifung statt. Jedoch kann die freie 21-Hydroxyverbindung leicht von ihrem Ester auf Grund verschiedener Löslichkeit getrennt werden. Wenn ein 21-Ester erwünscht ist, ist es zweckmäßig, die freie Hydroxylgruppe in 21-Stellung wieder zu verestern.
Obgleich dargelegt wurde, daß die bevorzugten Ausgangsverbindungen 1,4-Pregnadiene sind, ist das mikrobiologische Verfahren nach der Erfindung allgemein auf eine große Mannigfaltigkeit von Steroiden anwendbar. Beispielsweise werden bei Verwendung von Cortison, Hydrocortison, Reichsteins Substanz S, Progesteron usw. 6ß-Hydroxycortison, 6ß-Hydroxyhydrocortison, 1,4-Pregnadien-6ß,16a,21-triol-3,20-dion, 6ß-Hydroxyprogesteron usw. erhalten. Diese Produkte werden ebenfalls in im wesentlichen quantitativer Ausbeute erhalten und können von dem Reaktionsgemisch leicht getrennt werden.
Die Verbindungen der ,nachstehenden allgemeinen Formel I in der R und X die in Spalte 1 angegebene Bedeutung haben, sind nützlich als Zwischenprodukte bei der Umwandlung in physiologisch aktive Corticoide, beispielsweise in 1,4,6-Pregnatriene, die z. B. durch Umsetzung von 1,4-Pregnadien-6ß, 17a,21-triol-3,11,20-trion-21-acetat mit einem Sulfonierungsmittel, wie p-Toluolsulfonylchlorid, und Behandlung des erhaltenen 6ß-p-Toluolsulfonates mit einer hochsiedenden Base, wie Diäthylanilin, in die therapeutisch wirksame Substanz 1,4,6-Pregnatrien-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat übergeführt werden können.
Die Verbindungen der Formel I, die am Kohlenstoffatom 11 oder 21 keine Sauerstoffunktion haben, können leicht nach den in der Literatur beschriebenen Verfahren in die sauerstoffhaltigen Analogen übergeführt werden. Beispielsweise kann eine Sauerstoffunktion am Kohlenstoffatom 11 durch einen Mikroorganismus der Gattung Curvularia oder Rhizopus u. dgl. eingeführt werden, während die Sauerstoffunktion am Kohlenstoffatom 21 mikrobiologisch durch eine Art von Ophiobolus herbotrichus oder chemisch durch Halogenierung, Acyloxylierung und, wenn es erwünscht ist, Verseifung eingeführt werden kann.
Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen, insbesondere jene, die eine Sauerstoffunktion an den Kohlenstoffatomen 11 und 21 besitzen, wirken als Schleiminhibitoren und sind in der Corticoidtherapie bei der Behandlung gewisser Entzündungskrankheiten allgemein anwendbar. Sie können oral in Form von Tabletten, Kapseln u. dgl. oder parenteral in Lösungen oder Suspensionen in nicht giftigen Trägern verabfolgt werden.

Beispiel 1 1,4-Pregnadien-6ß,17 a,21-triol-3,11,20-trion In jeden von zehn 300-cm3-Erlenmeyerkolben werden 100 cm3 eines Nährbodens der folgenden Zusammensetzung gebracht:

Hefeextrakt (bekannt unter dem

Handelsnamen »Difco<c) ....... 3 bis 10 g

Kornkeimflüssigkeit . . . . . . . . . . . 1 g

Dextrose ..................... 10 g

Destilliertes oder Leitungs-

wasser ................. auf 1 1 aufgefüllt

Jeder Kolben wird mit Sporen einer Agarmediumkultur von Chaetomium funicolum (QM 33 C) oder mit einem 1- bis 101)/oigen, unter Flüssigkeit wachsenden Inoculum, das 24 bis 48 Stunden gewachsen ist, geimpft. Das Gemisch wird durch Schütteln der Kolben auf einer rotierenden Schüttelmaschine mit etwa 250 Umdrehungen pro Minute 24 bis 48 Stunden bei 28° C bebrütet. In jeden Kolben (der jetzt ein reiches Wachstum zeigt) werden unter aseptischen Bedingungen 50 mg 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion in 2 cm3 Äthanol gegeben. Das Fermentationsgemisch wird dann 24 bis 72 Stunden bei 28° C geschüttelt, wonach eine vollständige Umwandlung erreicht wird. Das Gemisch wird gründlich mit Chloroform extrahiert, und die kleine Fraktion des Produktes, die in dem Mycelium zurückbleibt, wird extrahiert, indem das Mycelium ein paar Minuten mit Chloroform gekocht wird. Die Chloroformextrakte werden vereinigt und auf einen Rückstand eingedampft, wobei etwa 5 mg Rohprodukt erhalten werden. Der Rückstand wird mit Chloroform verrieben, wobei sich ein kristalliner Feststoff bildet, der durch Umkristallisation aus Aceton gereinigt wird und 1,4-Pregnadien-6ß,17a,21-triol-3,11,20-trion liefert; F. = 222 bis 224°C; @max = 236 mit.; E = 12000.

Beispiel 2 1,4-Pregnadien-6ß, l lß,17 a,21-tetrol-3,20-dion Man geht im wesentlichen wie im Beispiel 1 vor und verwendet 1,4-Pregnadien-llß,17a,21-triol-3,20-dion als Substrat. Man läßt eine Kultur von Chaetomium cochliodes (QM 624), wie im Beispiel 1 beschrieben wurde, in einem Medium der folgenden Zusammensetzung wachsen:

Enzymatisches Hydrophat von

Lactalbumin (bekannt unter

dem Handelsnamen »Edamin«) 29 g

Kornkeimflüssigkeit . . . . . . . . . . . 3 g

Technische Dextrose (bekannt

unter dem Handelsnamen

»Cerelose«) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 bis 50 g

Wasser . . . . . . . . . . . . . . . .. . . auf 1 1 aufgefüllt

Nach Beendigung der Fermentation wird das Gemisch mit Methylenchlorid extrahiert und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wird mit etwas Methanol digeriert und aus Methylenchlorid-Hexan umkristallisiert, wobei 1,4-Pregnadien-6ß,11 ß,17 a,21-tetrol-3,20-dion erhalten wird; Am", = 241 mp,; E = 13200.

Beispiel 3 1,4-Pregnadien-6ß,17 a,21-triol-3,20-dion Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wird bei Verwendung von 1,4-Pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion als Substrat die Verbindung dieses Beispiels erhalten, die durch Kristallisieren aus Aceton gereinigt wird; Am", = 242 m#L; E = 13100.
Beispiel 4 1,4-Pregnadien-6ß,17 a-diol-3,20-dion Wenn in dem im Beispiel l beschriebenen Verfahren 1,4-Pregnadien-17a-ol-3,20-dion Gramm für Gramm eingesetzt wird, wird 1,4-Pregnadien-6ß,l7a-diol-3,20-dion erhalten; Am"" = 242 m#t; E = 12900.
Es kann auch Chaetomium succineum (QM 1044) als Kultur verwendet werden.
Beispiel 5 1,4-Pregnadien-6ß,17a,21-triol-3,11,20-trion-21-acetat Eine Lösung von 25 mg der Verbindung von Beispiel 1 in 2 cm3 wasserfreiem Pyridin wird in 6 mg Essigsäureanhydrid in einer wasserfreien Atmosphäre gegossen. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und dann in verdünnte Schwefelsäure und Eis gegossen. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, getrocknet und aus Methanol kristallisiert, wobei das 21-Acetat dieses Beispiels erhalten wird; Amax = 236 m#t; E = 12800.
Beispiel 6 1,4-Pregnadien-6ß,17 a,21-triol-3,11,20-trion-6ß,21-diacetat Wenn die Essigsäureanhydridmenge bei dem in dem vorhergehenden Beispiel beschriebenen Verfahren auf 100 mg erhöht wird, wird das Diacetat dieses Beispiels erhalten und durch Kristallisieren aus Aceton-Hexan gereinigt; A"tax = 236 m#t; E = 12500.
Beispiel 7 1,4-Pregnadien-6ß,11 ß,17a,21-tetrol-3,20-dion-21-acetat Eine Lösung von 50 mg des Produktes von Beispiel 2 in 3 bis 4 cm3 wasserfreiem Pyridin wird mit 11 bis 12 mg Essigsäureanhydrid behandelt und wie im Beispiel 5 verarbeitet. Das so erhaltene 21-Acetat wird durch Kristallisieren aus Aceton gereinigt; Am", = 240 mu ; E = 13100. Beispiel 8 1,4-Pregnadien-6ß,11ß,17 a,21-tetrol-3,20-dion-6ß,21-diacetat Wenn bei dem in dem vorhergehenden Beispiel beschriebenen Verfahren die Essigsäureanhydridmenge auf 100 mg erhöht wird, wird das Diacetat dieses Beispiels erhalten und durch Kristallisieren aus Methylenchlorid-Hexan gereinigt; 2."x = 240 mg.; E = 13100.
Beispiel 9 1,4-Pregnadien-6ß,17 a,21-triel-3,11,20-trion-6ß-benzoat-21-acetat Zu einer Lösung von 100 mg des Produktes von Beispiel 5 in 2 cm3 wasserfreiem Pyridin werden 100 mg Benzoylchlorid zugesetzt und das Gemisch 1 Stunde gerührt. Die Lösung wird in wäBrige Schwefelsäure und Eis gegossen und der erhaltene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Durch Kristallisation aus Methanol wird 1,4-Pregnadien-6ß,17a,21-triol-3,11,20-trion-6ß-benzoat-21-acetat erhalten.
Beispiel 10 1,4-Pregnadien-6ß,11ß,17 a,21-tetrol-3, 20-dion-6p-toluolsulfonat-21-acetat Eine Lösung von 100 mg des Produkts von Beispiel 7 in 2 cm3 wasserfreiem Pyridin wird mit 100 mg p-Toluolsulfonylchlorid behandelt. Das Gemisch wird wie im Beispiel 9 verarbeitet, und das Produkt dieses Beispiels wird durch Kristallisation aus Aceton-Hexan erhalten. Beispiel 11 In analoger Weise wurden die folgenden Verbindungen hergestellt

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von 6ß-Hydroxysteroiden der nachstehenden allgemeinen Formel I worin X = O oder H, OH, Y = H oder O R und R4 = H oder Acyl bedeutet und in der die 1(2)-Stellung auch gesättigt sein kann, bzw. von deren Acylaten durch Bebrütung von entsprechenden 6-Desoxysteroiden der nachstehenden allgemeinen Formel II in der X und Y die obige Bedeutung haben und in der die 1(2)-Stellung auch gesättigt sein kann, mit der Kultur eines hydroxylierend wirkenden Mikroorga-

Claims

nismus oder den daraus gewonnenen, oxydierend wirkenden Enzymen und Abtrennung des erhaltenen hydroxylierten Steroids, insbesondere durch Extraktion der Gärlösung, dadurch gekennzeichnet, daB man eine Kultur einer Art Chaetomium als Mikroorganismus verwendet und das erhaltene 6ß-Hydroxysteroid gegebenenfalls in bekannter Weise acyliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daB Chaetomium funicolum verwendet wird. In Betracht gezogene Druckschriften: Experientia 1I, 10, 1946, S. 408ff.; Journ. Amer. Chem. Soc., 72, 1950, S. 4534.