-
Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-41,4-steroiden In der Patentanmeldung
P 17035 IVb/12 o ist ein Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-d1#4-steroiden durch
Fermentierung von 3-Keto-44-Steroiden mit einem Mikroorganismus der Art Nocardia
beschrieben. Es ist ferner bekannt, daß eine Spezies von Corynebacterium, nämlich
Corynebacterium simpler, 3-Keto-41,4-Steroide durch Dehydrierung von 3-Keto-44-steroiden
bildet (Journal of American Chemical Society, Bd. 77, S. 4184 [19551).
-
Es wurde nun gefunden, daß sich dieses Verfahren mit hohen Ausbeuten
an 3-Keto-d1#4-Steroiden unter leichter kontrollierbaren Bedingungen noch besser
durchführen läßt, wenn man dem Reaktionsmedium kleinere Mengen an antibakteriellen
Antibiotika zusetzt. Diese Maßnahme ist besonders wirksam, wenn eine größere Impfmenge
von Nocardia oder einer Spezies des Corynebacteriums dem Steroidreaktionsgemisch
zugesetzt wird. Häufig stellt man bei Verwendung einer großen Impfmenge ohne ein
Antibiotikum eine Zerstörung des Steroidgehaltes im Reaktionsgemisch fest. Die Verwendung
einer größeren Impfmenge der ausgewählten Spezies ergibt bei der Herstellung der
3-Keto-d1#4-steroide eine größere Wirtschaftlichkeit und eine wirksamere Ausnutzung
der wertvollen Vorrichtung, weil dadurch höhere Enzymwirksamkeit in dem Reaktionsgemisch
geschaffen wird, die die Umwandlung von größeren 3-Keto-44-steroidmengen zuläßt.
Diese höhere Enzymwirksamkeit bei der durch Fermentierung bewirkten Herstellung
von 3-Keto-41,4-Steroiden wird möglich gemacht, wenn man kleinere Mengen eines antibakteriellen
Antibiotikums zusammen mit der Impfmenge in das Reaktionsgemisch gibt. Die vorliegende
Erfindung schafft also für die Industrie ein wirtschaftlicheres und praktischeres
Verfahren zur Herstellung von 3-Keto-41,4-steroiden, von denen einige als Verbindungen
bei der Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten, wie z. B. rheumatoider
Arthritis, Asthma und Dermatose, wertvoll sind.
-
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine 3-Keto-d4-steroidverbindung
mit 18 bis 21 C-Atomen mit den oxydierenden Enzymen eines Mikroorganismus der Art
Nocardia oder der Art Corynebacterium in Gegenwart einer die gewünschte Steroidausbeute
vergrößernden Menge wenigstens eines Antibiotikums zusammengebracht.
-
Die Umwandlung von 3-Keto-d 4-steroiden in 3-Keto-41,4-steroide mittels
oxydierender Enzyme der Spezies der Genera Nocardia und Corynebacterium erfolgt
innerhalb von bis zu etwa 2 Tagen. Bei der Verwendung einer großen Impfmenge aus
den Spezies Nocardia oder Corynebacterium, beispielsweise etwa 5 °/o und mehr, bis
zu etwa 20 °/a des gesamten Reaktionsvolumens, werden merklich geringere Ausbeuten
an den gewünschten Steroiden erzielt. Völlig unerwartet wurde nun gefunden, daß
bei der Verwendung von Impfmengen der obigen Größenordnung 3-Keto-d1#4-steroide
in ausgezeichneter Ausbeute sogar nach nur 12 Stunden erhalten werden, wenn eine
kleine Menge eines antibakteriellen Antibiotikums, wie z. B. eines Tetracyclins,
Neomycin, Streptomycin oder Dihydrostreptomycin zu dem Reaktionsgemisch gegeben
wird. Unter einem Antibiotikum von der Art des Tetracyclins wird Tetracyclin, Oxytetr
acyclin und Chlortetracyclin, Bromtetracyclin, Desmethyltetracyclin und Desmethylchlortetracyclin
und deren verschiedene aktive Salze und Derivate, wie beispielsweise die sauren
Salze, z. B. die Halogenwasserstoffsalze und Metallsalze, wie z. B. die Alkalimetallsalze,
verstanden. Amphotere Substanzen entweder in wasserfreier oder hydratisierter Form
können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Verbindungen von Neomycin, Streptomycin
und Dihydrostreptomycin sind z. B. das Sulfat oder das Phosphat. Auch die freien
Basen können verwendet werden. Die Menge des zu dem Reaktionsgemisch zuzugebenden
Antibiotikums soll so groß sein, daß eine Gesamtblockierung des Enzymsystems der
Mikroorganismen nicht stattfindet. Eine Steroidumwandlung findet also dann nicht
statt, wenn eine zu große Menge des Antibiotikums zu dem Reaktionsgemisch gegeben
wird, obgleich keine merkliche Steroidzersetzung festgestellt wird. Bei einer zu
kleinen Menge des Antibiotikums ist die Steroidzersetzung ziemlich ausgeprägt, wenn
auch eine Umwandlung zu 3-Keto-d1>4-steroiden dabei stattfindet. Bei jedem dieser
Antibiotika soll zur Erzielung der gewünschten 3-Keto-41,4-steroidausbeute eine
bestimmte Konzentration verwendet werden. Es
scheint keine für alle
Antibiotika geeignete allgemeine Konzentration anwendbar zu sein.
-
Es wurde weiter gefunden, daß man, abgesehen von den ausgezeichneten
Ausbeuten, die Konzentration des in dem Reaktionsgemisch anwesenden Antibiotikums
zur Regulierung der zur Erzielung maximaler Steroidausbeuten erforderlichen Zeit
verwenden kann. Wird beispielsweise eine Impfmenge der Spezies Nocardia oder Corynebacterium
von 50/, und eine Tetracyclinmenge von 5 ;,/ccm in einem die Verbindung F
(44-Pregnenl lß,17a,21-triol-3,20-dion) enthaltenden Reaktionsmedium verwendet,
so werden maximale Ausbeuten von 84 °/o Prednisolon in 40 Stunden erzielt. Wird
eine Menge von 100y Streptomycin pro ccm verwendet, so wird nach 40 Stunden eine
Ausbeute von 79 % Prednisolon erzielt.
-
Es können auch Gemische der Antibiotika verwendet werden. Wird beispielsweise
ein Gemisch von 1 y Oxytetracyclin und 0,25 y Neomycin pro ccm des Reaktionsgemisches
verwendet, so wird in etwas weniger als 30 Stunden eine maximale Ausbeute von 68
°/o erzielt. Gemische dieser Antibiotika sind besonders wirksam, wobei im Verhältnis
zur Wirksamkeit von Oxytetracyclin oder Neomycin allein eine synergistische Wirkung
festgestellt wird. Ferner wird bei einer Menge von 0,5,y
Oxytetracyclin
und 0,125 y Neomycin bei Verwendung einer Impfmenge von 5 °/o eine 641)/oige Ausbeute
an Prednisolon erhalten.
-
Die zur Erzielung der maximalen Ausbeuten allgemein erforderliche
Reaktionszeit hängt von der Menge des verwendeten Antibiotikums ab. Zur Erzielung
bester Ergebnisse werden die Antibiotika von der Art des Tetracyclins in einer Menge
von etwa 2 bis 15 y/ccm des Reaktionsgemisches bei Verwendung einer 501,-Impfmenge
der Spezies Nocardia oder Corynebacterium verwendet. Streptomycin und Dihydrostreptomycin
werden in einer Konzentration von 50 bis 200 y/ccm Reaktionsmedium und Neomycin
in einer Menge von 1 bis 4 y/ccm verwendet. Werden die Antibiotika in größeren Konzentrationen,
als der vorstehend angegebenen oberen Grenze entspricht, verwendet, so werden die
Steroidausbeuten geringer und längere Reaktionszeiten erforderlich. Bei größeren
Impfmengen bis zu 18 °/o können zur Erzielung bester Ergebnisse größere Antibiotikamengen
verwendet werden. Ein Gemisch von 1,0 y/ccm Oxytetracyclin und 0,25 y/ccm Neomycin
ergibt beispielsweise eine 77°/oige Umwandlung der Verbindung F zu Prednisolon innerhalb
von nur 16 Stunden. Bei einer Konzentration von 4 y/cem Oxytetracyclin und 1 y/ccm
Neomycin wird bei der gleichen Impfmenge eine 69°/oige Ausbeute an Prednisolon innerhalb
von 60 Stunden erhalten.
-
Andere Antibiotika werden auf ihre Wirksamkeit in dem erfindungsgemäßen
Verfahren durch ein einfaches Testverfahren untersucht. Dieses beruht auf der Feststellung
von Steroiden, die in einem Gärungsreaktionsmedium für kleine Versuche enthalten
sind. Beispielsweise können eine Anzahl von Proben der Reaktionsmedia in kleinen
Fermentationsbehältern hergestellt werden, zu denen jeweils das gleiche Volumen
der Impfmenge eines Mikroorganismus der Spezies Nocardia oder Corynebacterium zusammen
mit verschiedenen Mengen der Antibiotika zugegeben werden. Die Wirksamkeit der zu
untersuchenden Antibiotika wird durch periodische Untersuchung der Proben der Reaktionsmedia
mittels Papierchromatographie festgestellt, wobei die Gesamtmenge des in dem Reaktionsgemisch
anwesenden Steroids durch Bestimmung der Prozentsätze der noch in dem Reaktionsgemisch
anwesenden 3-Keto-44-steroide und 3-Keto-41#4-steroide festgestellt wird. In der
Literatur sind viele Standard-Papierchromatographieverfahren, die mit Vorteil verwendet
werden können, beschrieben. Durch diese einfachen Testverfahren kann die optimale
Antibiotikakonzentration sowie die Zeit zur optimalen Umwandlung von 3-Keto-44-steroiden
in 3-Keto-41#4-steroide bestimmt werden. So haben sich z. B. Penicillin, Tyrothycin,
Polymixin, Chloramphenicol, Erythromycin, Carbomycin, Bacitracin, Viomycin, Gramicidin,
Novobiocin, Dextromycin, Oleandomycin, Magnamycin und Chlormycetin als wirksam erwiesen.
Antifungale Antibiotika, wie z. B. Nystatin, Thiolutin, Cycloheximid und Rimocidin,
bewirken nicht die enzymatische Umwandlung von 3-Keto-d 4-steroiden zu 3-Keto-41#4-steroiden.
-
Als Ausgangsstoffe für das erfindungsgemäße Verfahren dienen z. B.
Verbindung F (Hydro- |
cortison) 9a-Fluoroverbindung F |
Verbindung E (Cortison) 14a-Oxy-Verbindung F |
Corticosteron 11-Epihydrocortison |
Verbindung S d4,e-Androstadiendion |
14a-Oxyverbindung S 1Iß,17a-Dioxyprogesteron |
Desoxycorticosteron 414-Dehydroverbindung S |
Androstendion Testosteron |
19-Nortestosteron Progesteron |
17a-Oxyprogesteron 16-Dehydroprogesteron |
11-Ketoprogesteron d 9 (11)-Dehydroverbin- |
dung S |
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind verschiedene Spezies
der Genera Nocardia und Corynebacterium brauchbar. Die Mikroorganismen können leicht
aus öffentlichen Kultursammlungen erhalten werden. Beispielsweise umfaßt die Spezies
des Genus Nocardia der American Type Culture Collection in Washington D. C., die
für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar ist, Nocardia convuluta, ATCC 4275,
Nocardia corallina, ATCC 4275, Nocardia erythropdis, ATCC 4277, Nocardia gardneri,
ATCC 12635, Nocardia minima, ATCC 8074, Nocardia polychromogenes, ATCC 3409, wobei
die Organismen der Spezies Nocardia opaca und Nocardia globeruls besonders wertvoll
sind. Spezies des Genus Corynebacterium, wie z. B. die Spezies C. simplex, die bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren brauchbar ist, sind gleichfalls in der American
Type Culture Collection erhältlich. Die verschiedenen Spezies der Nocardia und Corynebacterium
unterscheiden sich beachtlich bezüglich der Leichtigkeit und Schnelligkeit, mit
der die Dehydrierung bewirkt wird. Auch innerhalb der Stämme der gleichen Spezies
gibt es Unterschiede. In ähnlicher Weise gibt es Unterschiede bei den verschiedenen
Steroidsubstraten hinsichtlich der Leichtigkeit und Schnelligkeit, mit der die Dehydrierung
des A-Ringes stattfindet. Es ist jedoch durch einfachste Routineversuche möglich,
die optimalen Bedingungen für die Dehydrierung jedes besonderen Steroids für jede
besondere Spezies des Mikroorganismus und eines jeden besonderen Antibiotikums festzustellen.
-
Vorzugsweise wird folgendes Verfahren für die Umwandlung von 3-Keto-44-steroiden
angewendet: Die Nährmedien werden mit Kulturen der gewählten Nocardia- oder Corynebacterium-Spezies
geimpft. Ein derartiges Medium besteht beispielsweise aus einem Gemisch einer bakteriologischen
Standardnährbrühe und zugesetzten Kohlehydraten. Die Kultivierung von Nocardia und
Corynebacterium ist sehr ausführlich in vielen Veröffentlichungen beschrieben. Die
geimpfte sterile Nährlösung läßt man 2 bis 3 Tage in Schüttelflaschen
wachsen,
um eine Impfmenge für größere Gefäße zu erhalten. Die größeren, gerührten und belüfteten
Gefäße werden wiederum zur Impfung von Gefäßen, die in industriellen Verfahren für
submerse Gärung verwendet werden, benutzt. Ein Medium des oben beschriebenen Typs
wird für die erfindungsgemäße industrielle Oxydation der Steroide verwendet. Es
können natürlich beträchtliche Veränderungen des Mediums vorgenommen werden. Im
allgemeinen sind ein Kohlehydrat, eine Quelle für organischen Stickstoff, Mineralsalze
und verschiedene Spurenmetalle erforderlich.
-
Die Steroidverbindung kann dem Nährmedium und dem mit den ausgewählten
Spezies geimpften Medium unmittelbar zugeführt werden. Proben des geschüttelten
und belüfteten Gemisches werden von Zeit zu Zeit entnommen, um die Umwandlung der
Steroidverbindung zu dem oxydierten Produkt festzustellen. Das Gemisch wird während
des Wachstums der Zellen und der Umwandlung des Steroids zwischen 20 und 37°C gehalten.
Im allgemeinen sind zur maximalen Produktion der Oxydationsprodukte etwa 12 bis
40 Stunden erforderlich. Das Wachstum der Zellen kann auch schon vor Zugabe des
Steroids beendet sein. Bei der Herstellung von Prednisolon (41,4-Pregnadien-11ß,17a,21-triol-3,20-dion)
verwendet man die reine Verbindung F als Ausgangsmaterial. Auch kann die Verbindung
F, die durch die Gärung von Verbindung S mit einem Mikroorganismus des Genus Curvularia,
wie in der USA.-Patentschrift 2658023 beschrieben, hergestellt wird, direkt
in situ durch Zugabe einer Nocardia- oder Corynebacterium-Spezies zu der ursprünglichen
Fermentierungsflüssigkeit in Prednisolon umgewandelt werden. Dieses letztere Verfahren
ist zweckmäßig, da es eine Verbesserung der Gesamtausbeute an Prednisolon aus der
Verbindung S ergibt. Es ist ferner deshalb zweckmäßig, weil es die Notwendigkeit
zur Isolierung und Reinigung der Verbindung F vermeidet.
-
Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten antibakteriellen
Antibiotika sollten vor oder während der Zugabe der Impfmenge hinzugegeben werden.
Sie können in irgendeiner geeigneten Form verwendet werden. Da sie in so geringen
Konzentrationen verwendet werden, werden gewöhnlich die Halogenwasserstoffsalze,
wie beispielsweise das Hydrochlorid oder andere Salze, wie z. B. die Sulfate, verwendet.
Verschiedene Aktivitätskonzentrationen pro Gewichtseinheit einiger löslicher Salze
der oben beschriebenen Antibiotika werden nachstehend angegeben:
7I mg |
Oxytetracyclinhydrochlorid ............... 885 |
Tetracyclinhydrochlorid .................. 970 |
Chlortetracyclinhydrochlorid .............. 965 |
Streptomycinsulfat ...................... 765 |
Neomycinsulfat ...... .................. 650 |
Aktivitätskonzentrationen anderer löslicher Formen der Antibiotika sowie der Antibiotika
selbst sind in der Literatur angegeben.
-
Die Produkte, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden,
werden aus wäßrigen Lösungen mittels mit Wasser nicht mischbarer organischer Lösungsmittel
nach bekannten Methoden extrahiert. Niedere halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie
z. B. Chloroform, sind besonders brauchbar. Nach der Extraktion werden die Lösungsmittel
abdestilliert, und das feste Produkt wird isoliert. Dieses Produkt wird weiter durch
Umkristallisation aus organischen Lösungsmitteln oder durch Chromatographie, z.
B. über Tonerdekolonnen oder andere geeignete absorbierende Stoffe, gereinigt. Die
Verwendung einer Kieselsäuregel-Äthanol-Kolonne mit Gemischen aus Methylenchlorid
und 2 bis 5 Volumprozent Äthanol (950/,) als Entwickler ist besonders vorteilhaft.
-
Für manche Zwecke ist es nicht erforderlich, die Produkte zu trennen,
sondern es kann das rohe Gemisch als solches verwendet werden. In einigen Fällen
kann es vorteilhaft sein, das Rohprodukt zu acylieren und mit den erhaltenen Estern
weiterzuarbeiten, die etwas beständiger sind. Die verfahrensgemäß hergestellten
Produkte werden als Zwischenprodukte für die Synthese anderer Verbindungen verwendet.
Beispielsweise können sie besonders leicht einer Aromatisierung nach I n h o f f
e n unter Bildung von Derivaten des Östrons unterworfen werden. Ferner kann z. B.
die 1-Dehydroverbindung S nach Standardverfahren, z. B. durch Oxydation mit Chromsäure,
in das entsprechende 17-Ketosteroid übergeführt werden.
-
Außer den obenerwähnten Verwendungen sind viele der nach der hier
beschriebenen Umsetzung hergestellten Verbindungen biologisch äußerst wertvoll.
Wenn beispielsweise Hydrocortison mit Nocardia oder Corynebacterium gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren behandelt wird, erhält man Prednisolon, das bei der Behandlung von rheumatoider
Arthritis wertvoll ist und gegenüber Hydrocortison Vorteile hat. Wenn man Cortison
behandelt, so erhält man die als Prednison bekannte Verbindung, die gleichfalls
bei der Behandlung von rheumatoider Arthritis wertvoll ist. Es wurde gefunden, daß
andere 3-Keto-d 1.4-steroide eine große Wirksamkeit als Nebennierenrindenhormone
besitzen und für die gleichen Zwecke wie Hydrocortison wertvoll sind.
-
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse sind
nicht vollständig aufgeklärt. Man nimmt jedoch an, daß bei der Verwendung großer
Impfmengen der Spezies Nocardia oder Corynebacterium bei der technischen Herstellung
die Steroide des Reaktionsgemisches durch das Wachstum von Bakterien zerstört werden.
Das Antibiotikum dürfte bei gewissen Konzentrationen in irgendeiner Art die an der
Zerstörung der Steroide beteiligten Enzyme blockieren, ohne die Dehydrierung der
1(2)-Stellung zu beeinträchtigen.
-
Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
-
Beispiel 1 Man ließ Curvularia lunata, NRRL-2380, 24 Stunden bei 28°C
auf einem Nährboden aus Sojabohnenmehl und KZ H P 04 wachsen. Während des Wachstums
wurde mit einer Geschwindigkeit von 300 U/min gerührt und 1i2 Volumen Luft pro Volumen
Medium pro Minute durchgeleitet.
-
191 dieser Kultur wurden unter sterilen Bedingungen zu 3801 eines
sterilen Gärmediums folgender Zusammensetzung gegeben:
Na N 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,20/, |
M9S04. 7 H20 . ..... .. .. .. ... ... . 0,050/0 |
K Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 0,050/, |
Fe S 04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0 |
Rohrzucker ....................... 1,00/0 |
CaCl2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 0,050/, |
Na4P207 ......................... 0,40/0 |
Polyoxyäthylenderivate von Teilestern |
gewöhnlicher Fettsäuren (Laurin-, |
Palmitin-, Stearin- und Ölsäure) und |
vom Sorbit abgeleiteter Hexit- |
anhydride (bekannt unter dem |
Handelsnamen Tween 80) . . . . . . . . 0,25 Volum- |
prozent |
Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3,00/, |
Der PH-Wert wurde nach dem Sterilisieren mit K O H auf 7,0 eingestellt.
Das Gärmedium wurde mit 1150 U/min gerührt und 1/2 Volumen Luft pro Volumen Medium
pro Minute 24 Stunden bei 28°C durchgeleitet. Das Gärmedium wurde dann mit 2 Volumen
sterilem Wasser verdünnt. 150 g Verbindung S-Monoacetat, das unter Erhitzen auf
80°C in 3,31 Monomethyläther des Äthylenglycols (bekannt unter dem Handelsnamen
Methylcellosolve) gelöst worden war, wurde dann zu 3801 des verdünnten Mediums zugegeben.
Die Umwandlung zu Verbindung F wird zweckmäßig durch Papierchromatographie überprüft.
Nach 12 bis 24 Stunden war die Verbindung S in 90 g der Verbindung F umgewandelt
worden. Nach Zugabe von 1331 sterilem Wasser wurde der PH-Wert mit K 0 H auf 7,5
eingestellt. Das verdünnte Gemisch wurde bei 80°C entwa 5 Minuten erhitzt, und es
wurden 571 eines Zusatzes der folgenden Zusammensetzung zugegeben:
N H4 N 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4,00/, |
K2 H P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 8,70/, |
Mg S 04 - 7 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,250/0 |
NaCl ............................. 0,00501 , |
FeS04 - 7 11,0 . . . .. ... . .. . . . .. . . . . . 0,00010/0 |
Fumarsäure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/, |
Der pH-Wert wurde mit K 0 H auf 7,0 eingestellt. Nocardia opaca, ATCC 4276, ließ
man unter Rühren mit 300 U/min und einer Belüftung von 1 Volumen Luft pro Volumen
Medium pro Minute 40 Stunden bei 28°C in einer Nährlösung der folgenden Zusammensetzung
wachsen:
Maiswasser ......................... 10/0 |
Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/ |
0 |
Glycerin ............................ 2% |
Traubenmelasse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,21)4 |
CaC 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 0,10/0 |
Der pll-«"ert wurde vor der Zugabe von Ca C03 auf 7,0 eingestellt. 28,451 hiervon
wurden zu dem die Verbindung F enthaltenden Reaktionsgemisch gegeben, durch das
dann '/,Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute geblasen wurde. Vor der Zugabe
des Impfproduktes wird eine solche Menge Oxytetracyclinhydrochlorid zu dem die Verbindung
F enthaltenden Reaktionsgemisch zugegeben, daß 5 y des Antibiotikums pro ccm des
endgültigen Reaktionsvolumens zugegen sind. Das Gärmedium wird während der mit 1/2
Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute vorgenommenen Belüftung bei 28` C gehalten.
Nach 40 Stunden erhält man Prednisolon durch Extrahieren des Reaktionsgemisches
mit Chloroform, Aufbringen des Extrakts auf eine Kieselsäuregelkolonne und Auswaschen
mit Gemischen von Methylenchlorid und Äthanol in ausgezeichneter Ausbeute, die 68
0!0, bezogen auf die Verbindung F, beträgt. Beispiel 2 Eine Kultur von N. opaca,
ATCC 4276, wurde wie im Beispiel 1 hergestellt. Ein Gärmedium wurde darauf hergestellt,
indem man 381 des im Beispiel 1 beschriebenen Zusatzes zu 3801 Wasser gab, das mit
K O H auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt worden war und vorher etwa 5 Minuten
auf 80°C erhitzt worden war.
-
21
1 des N. opaca-Gärmediums wurden dann zu dem Reaktionsgemisch
gegeben. Es wurde eine solche Menge Tetracyclinhydrochlorid zugegeben und außerdem
60 g der Verbindung F in kristalliner Form. Innerhalb von 40 Stunden wurde wie im
Beispiel 1 eine 86%ige Prednisolonausbeute erhalten. Beispiel 3 C. lunata, NRLL-2380,
ließ man wie im Beispiel 1 unter Verwendung des folgenden sterilen Gärmediums wachsen:
Glucosemonohydrat (bekannt unter dem |
Handelsnamen Cerelose) . . . . . . . . . . . 1,00/, |
Lactose ........................... 2,00/0 |
Maiswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6,00/0 |
Nag S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 0,10/0 |
Maismehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 1,20/0 |
Sojabohnenöl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 ccm/3,71 |
Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 0,550/0 |
Der PH-Wert wurde mittels KOH vor Zugabe von CaCO3 auf 6,25 eingestellt. Nach dem
Verfahren des Beispiels l wurden so 133g Verbindung S in 75g Verbindung F umgewandelt.
-
N. opaca, ATCC 4276, ließ man wie im Beispiel 1 wachsen und wandelte
Verbindung F in Prednisolon um: Hierbei wurde das gleiche Verfahren angewandt, jedoch
wurde an Stelle von Oxy tetracyclin ein Gemisch von Oxytetracyclin und Neomycinsulfat
verwendet, das ausreichte, um 13 y/ccm Oxytetracyclin und 3,3 y/ccm Neomycin
zu erhalten. Innerhalb von 40 Stunden wurde eine 70%ige Ausbeute an Prednisolon
erhalten. Beispiel 4 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde wiederholt. An Stelle von
Oxytetracyclin wurde eine solche Menge an Streptomycinsulfat verwendet, die ausreichte,
um eine Konzentration von 100 y Streptomycin pro ccm des Reaktionsmediums zu erhalten.
Es wurde eine 790/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten. Beispiel 5 Das Verfahren
des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei an Stelle von Oxytetracyclin eine Konzentration
von 1 y Oxytetracyclin und 0,25y Neomycin pro ccm des Reaktionsmediums verwendet
wurden. Innerhalb von 28 Stunden wurde eine 680/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten.
Beispiel 6 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter Verwendung von 0,5
y Oxytetracyclin und 0,125 y Neomycin an Stelle von Oxytetracyclin
wiederholt. Nach 26 Stunden wurde eine 640/0ige Ausbeute an Prednisolon erhalten.
Beispiel 7 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde unter Verwendung von 75,801 N. opaca
Wachstumsmedium in Gegenwart von 1 y/ccm Oxytetracyclin und 0,25 y/ccm Neomycin
wiederholt. Innerhalb von 16 Stunden hatte eine 77%ige Umwandlung der Verbindung
F in Prednisolon stattgefunden. Beispiel 8 Das Verfahren des Beispiels 1 wurde unter
Verwendung von 102,331 N. opaca Wachstumsmedium in Gegenwart von 4 y/ccm Oxytetracyclin
und 1 y/ccm Neomycin wiederholt. Innerhalb von 60 Stunden wurde eine 69%ige Ausbeute
an Prednisolon erhalten.
-
Beispiel 9 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, wobei an
Stelle von Tetracyclin eine Konzentration von 15 y Tetracyclin pro ccm Reaktionsmedium
verwendet wurde. Innerhalb von 40 Stunden wurde eine 800/0ige Ausbeute an Prednisolon
erhalten.
Beispiel 10 Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt,
wobei an Stelle von Tetracyclin eine Menge an Neomycinsulfat verwendet wurde, die
ausreichte, um eine Konzentration von 4,y Neomycin pro ccm des Reaktionsmediums
zu erhalten. Innerhalb von 40 Stunden wurde eine 68o/oige Ausbeute an Prednisolon
erhalten.
-
In jedem dieser Fälle wurden die Produkte aus dem Reaktionsgemisch
durch Extraktion gewonnen und mittels Papierchromatographie ausgewertet. Es wurde
gefunden, daß stets eine Doppelbindung in der 1-Stellung eingeführt worden war.