DE3235884C2 - - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung von Steroidverbindungen durch die Verwendung von Cyclodextrin als Zusatzstoff.

Bei der Herstellung von Steroidverbindungen kommt es oft vor, daß man eine Stufe der mehrstufigen Synthese durch die Anwendung einer spezifischen Funktion eines Mikroorganismus durchführt. Die Mikroorganismus-Zellen, die aus den Zellen extrahierten Enzyme, die eventuell fixierten Zellen oder die fixierte Enzyme verwendenden Biokonversionsprozesse laufen in einem wäßrigen Medium ab. Obwohl die enzymatische Reaktion in diesem Medium sicher abläuft, ist gleichzeitig ein Nachteil im Vergleich mit den Reaktionen in organischen Lösungsmitteln darin zu sehen, daß die Steroide in Wasser schlecht löslich sind. Die Wasserlöslichkeit einer Reihe von Steroidverbindungen ist sehr schwach, d. h. die Konzentration ist niedriger als diejenige Konzentration, bei welcher die Biokonversionsprozesse noch ökonomisch durchführbar sind. Bei den bekannten Verfahren ist ein bestimmter Teil des Substrats bzw. des Steroidprodukts während der Reaktion in fester Form anwesend. Die Auflösung des Substrats in der festen Phase kann die Reaktionsgeschwindigkeit bestimmen, im Fall von heterogener Teilchengröße wird die Geschwindigkeit der Auflösung mit Erhöhung der Durchschnittsgröße der nicht aufgelösten Teilchen immer niedriger. Es kann vorkommen, daß wegen der Auflösungsprobleme die Reaktion von der Erreichung der gewünschten Umwandlung zum Stillstand kommt.

Mehrere Verfahren wurden zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des Substrat-Steroids oder der Auflösungsgeschwindigkeit des Produkts ausgearbeitet.

Gemäß GB-PS 12 11 356 wird zur Erreichung eines homogenen, zerkleinerten Substrats das in die Reaktion eingeführte Steroid vorher mechanisch dispergiert. Nach US-PS 41 24 607 wird das Substrat von Feinkorngröße in einer separaten Stufe hergestellt, indem man die in einem organischen Lösungsmittel hergestellte Steroidlösung in Wasser emulgiert und das Lösungsmittel abdestilliert. Bei mehreren Verfahren wird das Steroid in einem organischen Lösungmittel aufgelöst, und die Ausscheidung erfolgt unmittelbar in dem Biokonversionsprozeß. Nach HU-PS 1 49 678 wird das zur Eintragung des Substrats verwendete Lösungsmittel (Pyridin, Essigsäure) vor dem Anfang der Biokonversion neutralisiert, und die Löslichkeit wird bei Alkoholen durch die Zugabe von Alkali-Erdmetall-Chloriden verbessert.

Gemäß GB-PS 10 83 204 wird die Löslichkeit des Steroid-Substrats in dem Reaktionsmedium durch die Zugabe eines organischen Lösungsmittels, zweckmäßig Dimethlysulfoxid, verbessert, das schon bei dem Einsatz oder nach dem Einsatz verwendet wird. Nach einer anderen Lösung wird die Wasserlöslichkeit des Steroidsubstrats mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gesichert; in diesem Fall wird der schnelle Stoffübertritt durch die große Grenzfläche der gebildeten Emulsion ermöglicht (s. Biotechn. Bioeng. 21, 39 (1979)). In der pharmazeutischen Industrie verwendet man oft Solubilisierungsmittel. So z. B. erhöht man gemäß DE-OS 15 43 431 erheblich die Androstendion-Ausbeute durch die Zugabe von Solubilisierungsmitteln bei der Herstellung der Verbindung aus 4-Cholesten-3-on.

Die bekannten Lösungen vermindern zwar die mit der schwachen Wasserlöslichkeit der Steroidsubstrate verbundenen Nachteile, sind aber nicht ökonomisch oder zeigen ungünstige Wirkungen auf das System. Falls z. B. das Substrat in mikrokristalliner Form hergestellt wird, bedeutet dies mehr Arbeitsvorgänge in der technologischen Reihe und verursacht einen Stoffverlust. Nach anderen Beobachtungen wird der Mikroorganismus während einer längeren Zeit durch das organische Lösungsmittel in der zur bedeutenden Erhöhung der Wasserlöslichkeit der Steroide nötigen Menge geschädigt (Steroids, 12, 525 (1968)).

Wenn man Solubilisierungsmittel verwendet, steigert sich nach Erfahrungen die Schaumbildung, und dies verhindert eine genügende Belüftung des Biokonversionssystems.

Die Dispergierung eines Steroidsubstrats wird gemäß US-PS 36 39 212 durch den Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels aus der Reihe der Fettsäureester erhöht. Aus der US-PS 40 57 469 ist der Zusatz einer glyceridhaltigen Substanz zur Stimulierung des Wachstums eines zur Oxidation von Sterinen verwendeten Mikroorganismus bekannt. Schließlich ist es auf der Literaturstelle Chemical Abstracts 94, 103 689b (1981) bekannt, daß Cholsäuren Einschlußverbindungen mit β- Cyclodextrin bilden, die wasserlöslich sind und sich für eine Injektionsapplikation eignen.

Das Ziel der Erfindung ist die Ausarbeitung eines Verfahrens, das einerseits die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vermindert und gleichzeitig die Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide sichert.

Es wurde gefunden, daß Cyclodextrine in Biokonversionssystemen zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Steroidmoleküle, bei Vorliegen eines festen Rückstands zur Erhöhung der Lösungsgeschwindigkeit und dadurch zur erheblichen Beschleunigung der Biokonversionsreaktion, weiterhin in einem gegebenen System zur Eliminierung der eine weitere Reaktion hemmenden Produkthemmung und in bestimmten Fällen zur Blockierung bestimmter Reaktionen durch die Behinderung einiger sterischer Gruppen des Steroidmoleküls vorteilhaft verwendet werden können. Die α- und β-Cyclodextrine bzw. deren Gemische wirken katalytisch in einer Ester-Hydrolyse. Wenn die Mikroorganismen zwei oder mehrere Funktionen aufweisen, so können die selektiven Wirkungen das Verhältnis der Reaktionsprodukte beeinflussen. Die obigen Wirkungen werden im folgenden zusammenfassend als "Intensivierung" bezeichnet.

Erfindungsgemäß wird die Reaktion der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide so intensiviert, daß man diese in Gegenwart von α-, β- oder γ-Cyclodextrin oder einem beliebigen Gemisch derselben durchführt. Gegebenenfalls gewinnt man nach der Umwandlung des Cyclodextrin aus dem Gemisch. Unter "Cyclodextrin" ist im folgenden α-, β- oder γ-Cyclodextrin oder ein beliebiges Gemisch davon zu verstehen. Vor der mikrobiologischen Umwandlung oder zu deren Beginn oder in einer bestimmten Phase der mikrobiologischen Umwandlung setzt man auf 1 Mol Substrat 0,2 bis 3 Mol Cyclodextrin zu. Nach einer Ausführungsmethode wird das entsprechende Cyclodextrin vor dem Einsatz des Substrats in das Biokonversionsmedium eingeführt. Nach einer anderen Ausführungsmethode wird das Substrat mit dem Cyclodextrin umgesetzt, und der erhaltene Substrat-Einschlußkomplex bzw. dessen wäßrige Lösung oder Suspension wird zum Biokonversionsmedium gegeben. Nach einer weiteren möglichen Ausführungsform wird das Cyclodextrin allein oder in Form eines mit dem Substrat gebildeten Einschlußkomplexes, gewünschtenfalls eine wäßrige Lösung oder Suspension des Einschlußkomplexes während der mikrobiologischen Reaktion, üblicherweise nach Erreichung von 30 bis 50% Umwandlung zugegeben. Die Lösung des Cyclodextrins oder des Cyclodextrins und des Substrat-Einschlußkomplexes können vor der Eintragung in das Biokonversionsmedium sterilisiert werden, oder sie können mit dem Biokonversionsmedium zusammen sterilisiert werden. Cyclodextrin kann aus dem wäßrigen Biokonversionsmedium so zurückgewonnen werden, daß man das Steroid mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das Cyclodextrin durch die Zugabe eines dessen Löslichkeit stark vermindernden Lösungsmittels, bevorzugt Hexan, aus dem Raffinat ausfällt und durch Filtrieren isoliert und das Cyclodextrin gewünschtenfalls trocknet.

Die Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung der Steroide gemäß der Erfindung ist sehr vorteilhaft, da diese Wirkung in der Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und in der Verminderung der Reaktionszeit offenbar wird; die Konzentration des Substrats in dem Medium kann erhöht werden, die Produkthemmung kann eliminiert werden, und von den möglichen Reaktionen kann die gewünschte Reaktion katalysiert werden, d. h. die mikrobiologische Selektivität kann gesteigert werden.

Die Herstellung der Cyclodextrin-Steroidsubstrat-Einschlußkomplexe kann nach mehreren Varianten durchgeführt werden. Nach einer Variante ist das Medium der Biokonversion eine wäßrige Lösung entsprechender Konzentration des gewählten Cyclodextrins, zu welcher das Substrat-Steroid gegeben wird, und der Einschlußkomplex wird der Gleichgewichtslage entsprechend gebildet (Variante 1).

Nach einer anderen Methode wird, um den Einsatz des Steroids in das System zu vermeiden, in einem separaten Tank die wäßrige Lösung des Substrat-Cyclodextrin-Einschlußkomplexes hergestellt, die durch Filtrieren sterilisiert und so zum Biokonversionsmedium gegeben wird (Variante 2). In Gegenwart von etwas Wasser ist nach der Erfahrung das Gemisch aus Cyclodextrin und Steroid umkristallisierbar, ein Steroid-Cyclodextrin wird gebildet, das bei einem Biokonversionsprozeß, der keiner Sterilisierung bedarf, in fester Form verwendet werden kann (Variante 3).

Die Cyclodextrine sind Glucose-Polymere von natürlichem Ursprung, die aus sechs, sieben oder acht Glucose-Einheiten bestehende geschlossene Makroringe sind. Ihre Struktur wird durch die spezielle Anordnung der Hydroxylgruppen charakterisiert. Alle sekundären Hydroxylgruppen sind an dem einen Rand des Ringes zu finden, wohingegen die primären Hydroxylgruppen an dem anderen Rand des Ringes aufzufinden sind. Daraus folgt, daß die äußere Oberfläche des Ringes hydrophil ist; daher sind die Cyclodextrine wasserlöslich.

Die innere Seite des Ringes ist hydrophob. Die Cyclodextrine bilden mit Molekülen von entsprechender Größe und Form Einschlußkomplexe. Das aus sechs Glucopyranose-Einheiten bestehende Cyclodextrin ist α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin wird aus sieben Glucopyranose-Einheiten aufgebaut, und γ- Cyclodextrin besteht aus acht Glucopyranose-Einheiten. Nach der Bindungsart werden Cyclodextrine auch Cycloamylosen genannt. Komplexe von Steroidmolekülen mit Cyclodextrin wurden schon während der Erforschung mehrerer pharmakologischer Wirkstoffe und mehrerer solubilisierender Stoffe untersucht (Lech und Pauli: J. Pharm. Sci. 55, 32 (1966)). Im Fall von Testosteron und Cortisonacetat wurden die wahrscheinlichen stöchiometrischen Verhältnisse der Komponenten festgestellt. Durch die Solubilisierung wollte man die Resorption der pharmazeutischen Wirkstoffe beeinflussen. Die Cyclodextrine wurden aber nicht zur Intensivierung der Reaktion bei der mikrobiologischen Umwandlung von Steroid- Substraten verwendet. Es wurde festgestellt, daß der Komplex von Steroid-Substrat und Cyclodextrin in einem wäßrigen Medium sofort dissoziiert, und der Komplex liegt in einem Biokonversionssystem in einem dynamischen Gleichgewicht mit den freien Steroid- und Cyclodextrin-Molekülen vor. In einem festen, ein suspendiertes Steroid enthaltenden Biokonversionssystem ist die jeweilige Konzentration des für das Enzym erreichbaren gelösten Anteils immer von der Lösungsgeschwindigkeit des die Versorgung mit Ausgangsprodukt sichernden Substrats und der Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion abhängig. Wenn die Auflösung ein langsamerer Prozeß ist, so bleibt während der Reaktion die Konzentration der Steroidlösung weit unter dem Sättigungswert, und die Reaktion wird dadurch im Sinne des Grundgesetzes der enzymatischen Reaktion wesentlich langsamer. Das Substrat setzt sich aus dem Cyclodextrin-Einschlußkomplex praktisch augenblicklich frei. Die Menge des gelösten Substrats bleibt in diesem Fall während des ganzen Prozesses ganz bis zum Ende des Prozesses auf dem Sättigungswert, und so wird die maximale Konversionsgeschwindigkeit der gegebenen Enzymreaktion gesichert.

Bei anderen Steroid-Umwandlungsreaktionen kann das Produkt nach dem sogenannten Endprodukthemmungsmechanismus die Reaktion verlangsamen oder zum Stillstand bringen, wenn es an das Enzym oder die Oberfläche der Zelle gebunden ist. Wegen der unterschiedlichen Struktur des Substrats und der Endproduktmoleküle bilden diese mit dem Cyclodextrin Komplexe von mehr oder weniger unterschiedlicher Stabilität. Es wurden nun günstige Reaktionsbedingungen gefunden, unter welchen das sonst eine Endprodukthemmung verursachende Steroid in einen Cyclodextrin-Komplex überführt wird, ohne die Zugänglichkeit des Substrat-Steroids zu verschlechtern. Wenn die Stabilität des Substrat-Cyclodextrin-Komplexes die Stabilität des Endprodukt-Cyclodextrin-Komplexes übertrifft, dann kann durch Verwertung der Komplexbildung die Endprodukthemmung so aufgehoben werden, daß man das Cyclodextrin nur nach einem gewissen Fortschritt der Reaktion einsetzt, wenn ein Überschuß des Produkts im System nachgewiesen werden kann.

In weiteren Untersuchungen wurde auch festgestellt, daß die enzymatische Hydrolyse von veresterten Steroidmolekülen durch die Herstellung eines entsprechenden α- und/oder β- Cyclodextrin-Komplexes beschleunigt werden kann. Dies kann vermutlich durch die katalytische Wirkung erklärt werden, die aus der Struktur des Cyclodextrins folgt.

Bei verschiedenen mikrobiologischen Umwandlungen wurde auch beobachtet, daß die Cyclodextrin-Komplexbildung andere Verhältnisverschiebungen verursachen kann; so kann im Fall eines entsprechend stabilen Komplexes durch die Verminderung der Zugänglichkeit des Moleküls die Geschwindigkeit einer Reaktion gegebener Konfiguration vermindert oder die Reaktion sogar eliminiert werden.

Die Einschlußkomplexe bildende Eigenschaft und deren Wirkung auf die Intensivierung der Biokonversionsreaktion ist für Steranverbindungen allgemein gültig. Im folgenden werden Einzelheiten des Verfahrens an Beispielen von Östran-, Androstan-, Pregnan-, Cholestan-, Stigmastan- und Nor- Verbindungen demonstriert.

Beispiel 1

Substrat: Hydrocortison
Mikroorganismus: Arthrobacter simplex (ATCC 6946)
α-Cyclodextrin, Geschwindigkeitserhöhung
Substrateinführung: 1. Variante

Eine Agarkultur von Arthrobacter simplex (ATCC 6946) wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen, und man inokuliert mit 5 cm³ dieser Suspension folgenden Nährboden:

Glucose: 0,3%, enzymatisch hydrolysiertes Casein 0,5%, Hefeextrakt: 0,1%, pH = 6,7. Man ergänzt die Lösung mit Wasser auf 100 cm³ und sterilisiert in einem 500 cm³-Erlenmeyer- Kolben. Man kultiviert bei 32°C an einer Flach-Rüttelmaschine von einer Hubzahl von 230/18 Stunden, man gibt 5 mg Hydrocortison, in 0,5 cm³ Methanol gelöst, zur Kultur, und das gewünschte Enzym wird induziert. Die Induktion dauert 3 Stunden, die unter den gleichen Bedingungen wie alle Kultivierungen durchgeführt wird. 50 cm³ der delta-1-Dehydrogenase- Enzym enthaltenden Kultur werden in einem 950 cm³, steriles Wasser enthaltenden 3-Liter-Erlenmeyer-Kolben vorgelegt, und die Umwandlung wird mit der so erhaltenen 20fach verdünnten Aktivkultur durchgeführt. Das eingesetzte Substrat besteht aus 2 g Hydrocortison, der Einsatz erfolgt durch die Verwendung des obigen Zusatzes folgendermaßen:

Man gibt 20 g α-Cyclodextrin zur Kultur, nach deren Auflösung löst man das Hydrocortison in 20 cm³ Methanol auf, wobei das Methanol 10 Gew.-% CaCl₂ enthält. Die Lösung gibt man zu der das α-Cyclodextrin enthaltenden Kultur. Die Umwandlung erfolgt 5 Stunden lang bei 32°C an der oben erwähnten Rüttelmaschine. Die Gegenwart des α-Cyclodextrins verhindert bei der Eintragung des Substrats in das wäßrige Medium dessen Ausscheidung, die Umwandlung des aufgelösten Substrats erfolgt mit einer durch die Enzymaktivität bestimmten größeren Geschwindigkeit als in dem System, das das Substrat in Form einer Suspension enthält. Die Umwandlungsdauer des obigen Substrats ohne Cyclodextrin beträgt 8 Stunden. Am Ende der Umwandlung beträgt der Steroidgehalt der Fermentbrühe: 1920 µg/cm³ Prednisolon, 40 µg/cm³ 20-β- Hydroxyprednisolon und 8 µg/cm³ Hydrocortison.

Beispiel 2

Substrat: 17-α-Methyl-testosteron (Androstan-Derivat)
Mikroorganismus: Arthrobacter simplex (ATCC 6946)
β-Cyclodextrin, Aufhebung der Endprodukthemmung
Substrateinsatz: Variante 1

Die nach Beispiel 1 hergestellte und induzierte Kultur wird auf das Fünffache verdünnt und zur delta-1-Dehydrierung von Methyl-testosteron verwendet, indem man zur Ingangsetzung der Biokonversion eine Lösung von 1,0 g Methyl-testosteron in 10 cm³ Methanol in das System einführt. Die Umwandlung wird dünnschichtchromatographisch beobachtet. Das eingetragene Substrat scheidet sich im System aus und wird während der kontinuierlichen Auflösung dehydriert. Bei Erreichung von ca. 400 µg/cm³ delta-1-Methyltestosteron gibt man zum System 6,0 g β-Cyclodextrin. Der Zusatz bildet einen Komplex aus dem entstehenden Produkt; da ist deshalb wichtig, weil sonst die enzymatische Reaktion wegen des Übergewichts des Produkts aufgrund des bekannten Endprodukthemmungs-Mechanismus langsamer und schließlich überhaupt nicht fortgesetzt würde. Die Komplexbildungsneigung des β-Cyclodextrins gegenüber dem Produkt ist ca. 5fach so intensiv wie die gegenüber dem Substrat. Der Einsatz erfolgt in der zweiten Stunde der Umwandlung, und die Inkubation wird aufgrund von dünnschichtchromatographischen Untersuchungen in der sechsten Stunde eingestellt.

Der Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umwandlung beträgt 970 µg/cm³ delta-1-Methyl-testosteron, 6 µg/cm³ Methyl- testosteron. Ohne die Zugabe von Cyclodextrin wird die Reaktion bei einer Rückstand-Substrat-Konzentration von 100 bis 120 µg/cm³ unterbrochen.

Beispiel 3

Substrat: 5-Pregnen-3β,17α,21-triol-20-on-21-acetat [acyliertes Pregnen-Derivat]
Mikroorganismus: Flavobacterium lucecoloratum [NIB 9324]
γ-Cyclodextrin: Variante 3

Mit einer Schrägagarkultur von Flavobacterium lucecoloratum [NCIB 9324] inokuliert man 200 cm³ Nährboden in einem 750-cm³- Erlenmeyer-Kolben. Die Kultivierung führt man bei 30°C 20 Stunden an einer Flachrüttelmaschine von einer Hubzahl von 230 durch. Mit der Kultur inokuliert man 5 Liter sterilen Nährboden von gleicher Zusammensetzung in einem Laboratoriumsfermentor. Zusammensetzung: 1,0 Gew.-% Hefeextrakt, 0,1 Gew.-% Kaliumhydrogenphosphat, 0,4 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat. Zum inokulierten Nährboden gibt man 250 mg Substrat, gelöst in 1,5 cm³ Dimethylformamid. Die Lösung wird steril filtriert. Die Gegenwart des Substrats ermöglicht die Bildung der nötigen Enzyme während des Wachstums der Kultur. Nach 12 Stunden Kultivierung ist die Bakterienzahl und die Enzymaktivität zur Ingangsetzung der Biokonversion geeignet, und man gibt nun 100 g 5-Pregnen-3β,17α, 21-trihydroxy-20-on-21-acetat zur Kultur, das mit γ-Cyclodextrin vorbehandelt wurde. Die Behandlung erfolgt folgendermaßen:

Man homogenisiert 100 g Substrat mit der gleichen Menge γ- Cyclodextrin und 200 cm³ Wasser 20 Minuten. Während dieser Zeit bildet ein Anteil des Substrats mit dem Cyclodextrin einen leicht löslichen Komplex. Die Suspension wird in den Fermentor eingeführt, und man inkubiert weitere 11 Stunden, bis das Substrat verbraucht ist. Bedingungen der Inkubation in dem Laboratoriumsfermentor: 30°C, Rühren mit 420 UpM, Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 l/l/Minute. Die Umwandlung wird durch Dünnschichtchromatographie beobachtet. Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umwandlung: 9020 µg/cm³ Reichstein-S-Verbindung: 4-Pregnen-17α,21-dihydroxy- 3,20-dion, 30 µg/cm³ Substrat. Ohne Cyclodextrin könnte die Biokonversion erst mit einer Menge von 10 g/l Substrat günstig durchgeführt werden.

Beispiel 4

Substrat: 4-Pregnen-17α,21-dihydroxy-3,20-dion-17-acetat [acyliertes Corticosteroid]
Mikroorganismus: Curvularia prasadii [IMI 71475]
β-Cyclodextrin: Katalyse der Esterhydrolyse
Substrateintragung: Variante 1

Mit einer Suspension von Sporen, die von einer Schrägagarkultur von Culvularia prasadii (IMI 71475] abgewaschen wurden, inokuliert man 100 cm³ Nährboden in einem 500-cm³- Erlenmeyer-Kolben. Zusammensetzung des Nährbodens: 1,0 Gew.-% Sojamehl, 0,3 Gew.-% Maismarmelade, 0,3 Gew.-% Maisstärke, 0,5 Gew.-% Malzextrakt, pH = 6,2. Die Kultur wird bei 26°C 24 Stunden hergestellt. 10 cm³ der Kultur werden zur Inokulierung von 100 cm³ Nährboden in einem gleich großen Kolben verwendet. Der Nährboden enthält keinen Malzextrakt, hat aber sonst die gleiche Zusammensetzung, wie oben beschrieben. Der Mikroorganismus wird bei 26°C geschüttelt und so vermehrt. Zur noch wachsenden, 16 Stunden alten Kultur gibt man das umzuwandelnde Substrat. Das Substrat ist 4-Pregnen- 17α,21-dihydroxy-3,20-dionacetat, aus welchem 0,12 g, in 3 cm³ Methanol gelöst, zum System gegeben werden. Man inkubiert weiter, wonach die Kultur die Verbindung in 11β-Stellung hydroxyliert, wobei Hydrocortison-17-acetat entsteht. In der 20. Stunde der durch Dünnschichtchromatographie beobachteten Umwandlung beträgt das Rückstand-Substrat 10 Gew.-%. Man gibt dann 0,96 g β-Cyclodextrin zu. Das Cyclodextrin wirkt katalytisch auf die enzymatische Hydrolyse der Acetylgruppe des Steroidmoleküls, so daß während der übrigbleibenden Zeit der Biokonversion neben der langsam werdenden Hydroxylierung die Abspaltung der Acetylgruppe erfolgt. Nach weiteren ca. 3 Stunden kann der Prozeß unterbrochen werden.

Steroidgehalt der Fermentbrühe am Ende der Umwandlung: Hydrocortison [4-Pregnen-11β,17α,21-trihydroxy-3,20-dion] 0,730 mg/cm³, Hydrocortison-17-acetat 0,185 µg/cm³, Reichstein- S-17-acetat 0,005 µg/cm³, Reichstein-S-Verbindung 0,040 µg/cm³.

Beispiel 5

Substrat: Hydrocortison
Mikroorganismus: Arthrobacter simplex [ATCC 6946]
β-Cyclodextrin: Geschwindigkeitssteigerung
Substrateingabe: Variante 2

Eine auf festem Nährboden gewachsene Arthrobacter-simplex (ATCC 6946)-Kultur wird abgewaschen, und man inokuliert 5 Liter sterilen Nährboden mit ungefähr 30 cm³ Suspension in einem Laboratoriumsfermentor.

Zusammensetzung des Nährbodens: 0,3 Gew.-% Glucose, 0,3 Gew.-% Pepton, 0,1 Gew.-% Hefeextrakt, pH = 6,8. Die Kultur wird bei 35°C, 240 UpM Rühren und 0,5 l/l/Min. Belüftung 20 Stunden hergestellt. Mit 1 Liter der Kultur inokuliert man in einem Laboratoriumsfermentor 9 Liter sterilisierten Nährboden, dessen Zusammensetzung folgende ist: 0,5 Gew.-% Glucose, 0,5 Gew.-% Pepton, 0,4 Gew.-% Hefeextrakt, pH = 6,8. Die Kultur wird bei 35°C, bei 600 UpM Rühren und 0,3 Liter/Liter/Min. Belüftung 18 Stunden lang hergestellt, wonach zur Induzierung der Enzymbildung eine Lösung von 0,5 g Hydrocortison in 50 cm³ Methanol zugegeben wird. Man inkubiert weitere 4 Stunden, wonach die Aktivkultur in einen säurefesten Apparat gepreßt wird, wo das Medium der Biokonversion vorher vorbereitet worden war.

Medium: In die Vorrichtung füllt man 90 Liter Leitungswasser und 1200 g β-Cyclodextrin, die Vorrichtung erhitzt man auf 100°C, und das Medium wird bei dieser Temperatur 20 Minuten sterilisiert und dann auf 35°C abgekühlt. Man löst 1,0 g 2-Methyl-1,4-naphthochinon und 400 g Hydrocortison in 4 Liter 400 g CaCl₂ enthaltendem Methanol auf; die Lösung wird steril filtriert und in den Apparat eingeführt. Die Kultur wird eingepreßt, worauf der Biokonversionsprozeß in Gang gesetzt wird. Während des Prozesses ist das Steroidsubstrat praktisch in Lösung; das ist deshalb wichtig, weil bei dem Anfang der Produktausscheidung die Gefahr der Mischkristallbildung aus dem Substrat und aus dem Produkt eliminiert wird.

Bedingungen der Inkubation der Biokonversion: 35°C, 180 UpM Rühren und 0,6 l/l/Min. Belüftung. Aufgrund der dünnschichtchromatographischen Analyse unterbricht man die Reaktion bei einer Substratmenge von 2 Gew.-%, die Fermentbrühe wird durch Gegenstromextraktion - auf einer Vorrichtung, die die Gegenwart von festem Material zuläßt (z. B. einem Drehscheiben-Extraktor) mit Ethylacetat zweimal extrahiert. Der Extrakt wird im Vakuum bei max. 40°C auf eine Konzentration von 8 g/l eingeengt - ca. 50 Liter erstes Konzentrat -, mit einem Gemisch von 40 g Aktivkohle und 100 g Celite behandelt, und das Gemisch wird bis zur Kristallisierung - ca. 2 Liter - weiter eingeengt. Die Suspension wird auf 5 bis 10°C gekühlt und nach einigen Stunden filtriert. Die Mutterlauge wird mit der fünffachen Menge Diisopropylether ausgefällt, gekühlt und filtriert.

Die Menge an Produkt beträgt 375 g, dessen Qualität wie folgt charakterisiert werden kann:

Um das β-Cyclodextrin zurückzugewinnen, wird der Extrakt mit 1 Liter Cyclohexan 1 Stunde bei 18 bis 20°C gerührt. Der gebildete Rückstand wird filtriert, in ungefähr 1 Liter Wasser suspendiert, und das Cyclohexan treibt man unter Kochen (durch Wasserdampfdestillation) aus dem Gemisch. Die wäßrige β-Cyclodextrin-Suspension wird eine Nacht bei 5 bis 10°C gehalten, und die Kristalle werden filtriert und im Vakuum getrocknet. Man gewinnt 700 g β-Cyclodextrin zurück, das wiederverwendet werden kann.

Beispiele 6 bis 11

Die folgenden mikrobiologischen Umwandlungen wurden analog den Beispielen 1 bis 5 unter den in diesen Beispielen angegebenen Bedingungen durchgeführt; man verwendet Cyclodextrin zur Intensivierung der erwünschten Reaktionen.

Beispiel 6

Substrat: Sitosterin
Mikroorganismus: Mycobacterium sp. [NRRL B 3805]
β-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung
Substrateinsatz: Variante 1
Endprodukt: Androsta-4-dien-4,17-dion

Den Abbau der Seitenkette des Substrats führt man nach der Methode von Marscheck, W.J., Kraychi, S. und Muir R.D. (1972), Appl. Microbiol. 23, 72 durch. Steroid/Cyclodextrin- Molverhältnis 1 : 0,2. Der Nährboden enthält 0,5% Na₂HPO₄ · 7H₂O. Infolge der Anwesenheit von Cyclodextrin kann die ohne Cyclodextrin erreichbare Konzentration von 1 g/l Sitosterin bei unveränderter Umwandlungsdauer (ca. 170 Stunden) auf 2 g/l Sitosterin erhöht werden.

Beispiel 7

Substrat: Progesteron
Mikroorganismus: Ophiobolus herpotrichus
β-Cyclodextrin, vollständige Umwandlung
Substrateinsatz: Variante 1
Endprodukt: 21-Dihydroxy-progesteron

Die Reaktion wird nach der Methode von Meystre et al., Helv. Chim. Acta 37, 1548 (1954) durchgeführt. Steroid/ Cyclodextrin-Molverhältnis 1 : 0,2. Der Nährboden ist Biermaische, mit welcher der Mikroorganismus 3 Tage kultiviert wird; man gibt dann die Lösung von Progesteron-Substrat in Aceton bis zur Erreichung einer Konzentration von 0,25 g/l Fermentbrühe zu. Ohne Verwendung von Cyclodextrin dauert die Umwandlung weitere 3 Tage und der Substratrückstand ist ungefähr 25%. Wenn 24 bis 30 Stunden nach Beginn der Biokonversion Cyclodextrin zum Reaktionsgemisch gegeben wird, wird die Menge des Substratrückstands wesentlich kleiner.

Beispiel 8

Substrat: 4-Pregnen-17α,21-dihydroxy-3,20-dion (Reichstein-S)
Mikroorganismus: Curvularia lunata (IFO 49)
β-Cyclodextrin, Beeinflussung des Verhältnisses der Reaktionsprodukte
Substrateintragung: Variante 1
Hauptprodukt: Hydrocortison

Die Reaktion wird nach der Methode von Kondo, E. und Mitsugi, T., J. Agrc. Chem. Soc. Japan 35, 521 (1961) durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin-Molverhältnis: 1 : 0,3. Ohne Zugabe von Cyclodextrin erhält man bei der Biokonversion 35-40 Gew.-% 6-β-Hydroxy-Reichstein S, 15-20 Gew.-% 11α-Hydroxy-Reichstein-S und etwa 5 Gew.-% 7,14 α-Dihydroxy- und 5 Gew.-% 6-β-14α-Dihydroxy-Reichstein-S. Wenn in der 0. Stunde der Biokonversion in dem obigen Verhältnis β-Cyclodextrin zu dem Gemisch gegeben wird, kann der Anteil von 11α-Hydroxy-Reichstein-S (epi-Hydrocortison) im Produkt auf das Doppelte erhöht werden.

Beispiel 9

Substrat: 16α-Methyl-Reichstein-S
Mikroorganismus: Curvularia lunata (ATCC 12017)
β-Cyclodextrin, Verbesserung der Effektivität der Konversion
Substrateinsatz: Variante 1
Endprodukt: 11β-17α,21-Trihydroxy-16α-methyl-pregn- 4-en-3,20-dion (16α-Methyl-hydrocortison)

Die Reaktion wird nach der Methode von Canonica, L. et al. Gazz. Chim. Ital. 93, 368 (1963) durchgeführt. Molverhältnis von Steroid/Cyclodextrin: 1 : 1. Ohne Verwendung von Cyclodextrin entsteht das Hauptprodukt in einer Menge von ca. 55 Gew.-%. Wenn in der 0. Stunde der Biokonversion in dem obigen Verhältnis β-Cyclodextrin zu dem Reaktionsgemisch gegeben wird, steigert sich der Anteil des Hauptproduktes um 5-10%.

Beispiel 10

Substrat: 3β,17α,21-Trihydroxy-pregn-5-en-20-on-21-acetat
Mikroorganismus: Flavobacterium dehydrogenans (ATCC 13930)
β-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung
Substrateinsatz: Variante 1
Endprodukt: Reichstein-S

Die Reaktion wird nach US-PS 30 09 936 durchgeführt. Steroid/Cyclodextrin-Molverhältnis: 1 : 0,3. Mit Cyclodextrin kann die Konzentration auf das Doppelte gesteigert werden.

Beispiel 11

Substrat: Lanatozid-A (Digitalis-Glucosid)
Mikroorganismus: Streptomyces purpurascens
β-Cyclodextrin, Konzentrationserhöhung
Substrateinsatz: Variante 1

Die Reaktion wird nach der HU-PS 1 76 250 durchgeführt. Lanatosid-A/Cyclodextrin-Molverhältnis 1 : 1. Ohne Verwendung von Cyclodextrin gibt man zu einer 2tägigen Kultur von Streptomyces purpurascens eine Lösung von Lanatosid-A in organischen Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,5 g/l. Wenn zu dem Reaktionsgemisch nach 2 Tagen dauernder Kultivierung in der 0. Stunde der Biokonversion unter Einhaltung des obigen Verhältnisses β-Cyclodextrin gegeben wird, kann die Konzentration des Substrats auf 2 g/l erhöht werden.

Claims (4)

1. Verfahren zur Intensivierung der mikrobiologischen Umwandlung von Steroidverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man diese in Gegenwart von α-, β- oder γ-Cyclodextrin oder einem beliebigen Gemisch derselben durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cyclodextrin vor, bei Beginn oder während der mikrobiologischen Reaktion dem Reaktionsgemisch zugibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cyclodextrin in einer Menge von 0,2 bis 3 Mol, berechnet auf 1 Mol des Substrats, einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Cyclodextrin in Form seines Einschlußkomplexes mit dem Substrat einsetzt.