SE452777B - Forfarande for intensifiering av den mikrobiologiska omvandlingen av steroidforeningar - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 452 777 lande av ett homogent, finfördelat substrat. Enligt US-PS 4 124 607 framställs substratet med finkorn- storlek i ett separat steg genom att man emulgerar den i ett organiskt lösningsmedel framställda ste- roidlösningen i vatten och avdestillerar lösningsmed- let. Vid flera förfaranden upplöses steroiden i ett organiskt lösningsmedel och separationen sker omedel- bart vid bioomvandlingsprocessen. Enligt HU-PS 149 678 neutraliseras det för införande av substratet använda lösningsmedlet (pyridin, ättiksyra) innan bio- omvandlingen påbörjas och lösligheten förbättras vid alkoholer genom tillsats av jordalkalimetallklorider.

Enligt GB-PS 1 083 204 förbättras steroid- substratets löslighet i reaktionsmediumet genom till- sats ett organiskt lösningsmedel, lämpligen dimetyl- sulfoxid, som redan används vid insättandet eller ef- ter insättandet. Enligt en annan lösning säkerställer man steroidsubstratets vattenlöslighet med ett med vatten icke-blandbart lösningsmedel och i detta fall möjliggörs den snabba materialtransporten genom den stora gränsytan hos den bildade emulsionen (se Bio- techn. Bioeng. 21, (1979) 39). Inom den farmaceutiska industrin använder man ofta solubiliseringsmedel. Så exempelvis ökar man enligt DE-PS 1 543 431 avsevärt androstendionutbytet genom tillsats av solubilise- ringsmedel vid framställning av föreningen utgående från 4-kollesten-3-on.

De kända lösningarna minskar visserligen de med steroidsubstratets ringa vattenlöslighet förknip- pade nackdelarna men är icke ekonomiska eller uppvi- sar ogynnsamma verkningar på systemet. Om exempelvis substratet framställs i mikrokristallin form betyder detta flera arbetsförlopp i den teknologiska serien och förorsakar en materialförlust. Enligt andra obser- vationer skadas mikroorganismen under en längre tid av det organiska lösningsmedlet i den för en betydan- 10 15 20 25 30 35 452 777 de ökning av steroidens vattenlöslighet erforderliga mängden (Steroids 12 (1968) 525).

Om man använder solubiliseringsmedel ökar' erfarenhetsmässigt skumbildningen och detta förhind- rar en tillfredsställande luftning av bioomvandlings- systemet. Ändamålet med uppfinningen är att tillhanda- hålla ett förfarande, som å ena sidan minskar nackde- larna hos de enligt teknikens ståndpunkt kända förfa- randena och samtidigt ger en intensifieringax'reaktio- nen vid den mikrobiologiska omvandlingen av steroider.

Det har visat sig att cyklodextrinerna med fördel kan användas i bioombandlingssystem för att förbättra steroidmolekylernas vattenlöslighet för att i fast tillstånd öka lösningshastigheten och därigenom avsevärt öka bioomvandlingsreaktionen, vidare för att i ett givet system eliminera den för vidare reaktion hämmande produkthämningen och i vissa speciella fall för att blockera bestämda reaktioner genom blockering av några steriska grupper i steroidmolekylen. a- och B-cyklodextrinerna respektive blandningar därav verkar katalytiskt vid en esterhydrolys. När mikroorganismer- na uppvisar tvâ eller flera funktioner, så kan de se- lektiva verkningarna påverka förhållandet mellan reak- tionsprodukterna. Ovan angivna verkningar betecknas sammanfattningsvis i det följande som en "intensifie- ring".

Enligt uppfinningen intensiveras reaktionen vid mikrobiologisk omvandling av steroider genom att man omsätter steroidsubstratet i närvaro u-, B- eller Y-cyklodextrin eller blandningar därav och eventuellt efter omvandlingen utvinner cyklodextrinet från bland- ningen. Med “cyklodextrin" avses i det följande a-, 6- eller Y-cyklodextrin eller en godtycklig blandning där- av. Före den mikrobiologiska omvandlingen eller vid dess början eller i en bestämd fas av den mikrobiolo- 10 15 20 25 30 35 452 777 giska omvandlingen tillsätter man 0,2 - 3 mol cyklo- dextrin per mol substrat. Enligt en utföringsform in- förs motsvarande cyklodextrin i bioomvandlingsmediumet före insättandet av substratet. Enligt en annan utfö- ringsform omsätts substratet med cyklodextrinet och det erhållna substrat-inklusionskomplexet respektive dess vattenhaltiga lösning eller suspension införs i bioomvandlingsmedium. Enligt en ytterligare möjlig ut- föringsform tillsätts cyklodextrinet som sådant eller i form av ett med substratet bildat inklusionskomplex, eventuellt en vattenlösning eller vattensuspension av inklusionskomplexet, under den mikrobiologiska reak- tionen, vanligtvis efter uppnående av en omvandlings- grad av 30 - 50%. Lösningen av cyklodextrinet eller cyklodextrinet och substrat-inklusionskomplexet kan steriliseras före införandet i bioomvandlingsmediumet eller också kan de steriliseras tillsammans med bio- omvandlingsmediumet. Cyklodextrin kan återvinnas ur det vattenhaltiga bioomvandlingsmediumet på så sätt att man extraherar steroiden med ett organiskt lös- ningsmedel och utfäller cyklodextrinet ur raffinatet genom tillsats av ett lösningsmedel, som kraftigt minskar dess löslighet, företrädesvis hexan, och iso- lerar cyklodextrinet genom filtrering och eventuellt torkar det.

Intensifieringenaflrden mikrobiologiska om- vandlingen av steroider enligt uppfinningen är mycket fördelaktíg, eftersom denna verkan ger sig till känna som en ökning av reaktionshastigheten och som en minsk- ning av reaktionstiden; substratets koncentration i mediumet kan höjas, produkthämningen kan elimineras och av de möjliga reaktionerna kan den önskade reaktionen katalyseras, dvs den mikrobiologiska selektiviteten kan stegras.

Framställningen av cyklodextrin-steroidsub- strat-inklusionskomplexen kan utföras enligt flera va- 10 15 20 25 30 35 452 777 rianter. Enligt en variant är mediumet vid bioomvand- lingen en vattenlösning med lämplig koncentration av det önskade cyklodextrinet, till vilken substratsteroi- den sätts och inklusionskcmplexet bildas motsvarande jämviktsläget (variant 1).

Enligt en annan metod framställs vattenlös- ningen av substrat-cyklodextrin-inklusionskomplexet i en separat tank för att undvika insättning av ste- roiden i systemet, komplexet steriliseras genom filt- rering och sätts därefter till bioomvandlingsmediumet (variant 2). I närvaro av något vatten är erfarenhets- mässigt blandningen av cyklodextrin och steroid om- kristalliserbar, ett steroid-cyklodextrin bildas, som kan användas i fast form vid en bioomvandlingsprocess, som icke kräver sterilisering (variant 3).

Cyklodextrinerna är glukospolymerer av natur- ligt ursprung, som är slutna makroringar bestående av 6, 7 eller 8 glukosenheter. Deras struktur karakteri- seras genom den speciella positionen av hydroxylgrup- perna. Alla sekundära hydroxylgrupper återfinner man vid den_ena kanten av ringen, medan de primära hydroxyl- grupperna återfinns vid den andra kanten av ringen.

Därav följer att den yttre ytan av ringen är hydrofil och därför är cyklodextrinerna vattenlösliga.

Den inre sidan av ringen är hydrofcb. Cyklo- dextrinerna bildar med molekyler av motsvarande stor- lek och form inklusionskomplex. Det av 6 glukopyrancs- enheter bestående cyklodextrinet är a-cyklodextrin, S- -cyklodextrin är uppbyggt av 7 glukopyranosenheter och Y-cyklodextrin består av 8 glukopyranosenheter. Till följd av bindningsarten benämns cyklodextrinerna även cykloamyloser. Komplex av steroidmolekyler med cyklo- dextrin har redan undersökts vid studium av flera far- makologiska aktiva substanser och flera solubiliseran- de ämnen (Lech und Pauli: J. Pharm. Sci. 55, (1966) 32).

I fallet testosteron och ortisonacetat fastställdes 10 15 20 25 30 35 452 777 de sannolika stökiometriska förhållandena mellan kom- ponenterna. Genom solubilisering ville man påverka resorptionen av det farmaceutiska aktiva ämnet. Cyklo- dextrinerna användes emellertid icke för intesivering av reaktionen vid den mikrobiologiska omvandlingen av steroidsubstrat. Man har konstaterat att komplexet av steroidsubstrat med cyklodextrin i ett vattenhaltigt medium genast dissocierar och komplexet föreligger i ett bioomvandlingssystem i dynamisk jämvikt med de fria steroid- och cyklodextrinmolekylerna. I ett fast bio- omvandlingssystem, som innehåller en suspenderad ste- roid, är ifrågavarande koncentration av den för enzy- met erhâllbara lösta andelen alltid beroende av lös- ningshastigheten hos det substrat som säkerställer ef- terföljande reaktion och av den enzymatiska reaktionens hastighet. Om upplösningen är en långsammare process, så kommer under reaktionen steroidlösningens koncent- ration att vida understiga mättningsvärdet och reak- tionen kommer därför att förlöpa väsentligt långsam- mare enligt lagarna för den enzymatiska reaktionen.

Substratet frigörs från cyklodextrinet i inklusions- komplexet praktiskt taget ögonblickligen. Mängden av det upplösta substratet kommer i detta fall att under hela processen fram till processens slut att ligga vid mättningsvärdet och på sätt tillförsäkras en maxi- mal omvandlingshastighet för den givna enzymreaktionen.

Vid andra steroidomvandlingsreaktioner kan produkten enligt den s.k. slutprodukthämningsmekanis- men fördröja eller inställa reaktionen, när den är bunden till enzymet eller cellens yta. Till följd av den skilda strukturen hos substratet och slutprodukts- molekylerna bildar dessa med cyklodextrin komplex av mer eller mindre olika stabilitet. Enligt våra under- sökningar har man funnit så gynnsamma reaktionsbe- tingelser under vilka den steroid, som annars föror- sakar slutprodukthämning, överförs till ett cyklo- 10 15 20 25 30 35 452 777 dextrin-komplex utan att substratsteroidens tillgäng- lighet försämras. När substrat-cyklodextrin-komplexets stabilitet överstiger slutprodukt-cyklodextrin-komp- lexets stabilitet, kan genom utnyttjande av komplex- bildningen slutprodukthämningen upphävas på så sätt att man endast tillsätter cyklodextrinet efter det att reaktionen har fortskridit i viss omfattning, om man i systemet kan påvisa ett överskott av produkten.

Vid ytterligare undersökningar har man kons- taterat att den enzymatiska hydrolysen av de förest- rade steroidmolekylerna kan accelereras genom fram- ställningen av ett motsvarande a- och/eller ß-cyklo- dextrin-komplex. Detta kan förmodligen förklaras ge- nom den katalytiska verkan som följer av cyklodextri- nets struktur.

Vid olika bioomvandlingar har man även kons- taterat att cyklodextrin-komplex-bildningen kan ge upphov till andra fenomen; så exempelvis kan i fallet av ett motsvarande stabilt komplex hastigheten hos en reaktion av given konfiguration minskas eller reaktio- nen till och med elimineras genom en minskning av till- gängligheten av molekylen.

Denna inklusionskomplexbildande egenskap och dess verkan på intensifieringenznrbioomvandlingsreak- tioner är allmänt tillämplig på steranföreningar. Nedan återges detaljerna vid förfarandet på exempel av östran-, androstan-, pregnan-, kolestan-, stigmastan- och nor- -föreningar utan att skyddsomfånget begränsas till des- sa exempel.

Exempel 1 Substrat: hydrokortison Mikroorganism: Arthrobacter simplex (ATCC 6946) a-cyklodextrin, hastighetsökning Substratinförande: enligt variant 1 En agarkultur av Arthrobacter simplex (ATCC 6946) tvättas med fysiologisk saltlösning och man inoku- lerar med 5 cm* av denna suspension följande närsubstrat: 10 15 20 25 30 35 452 777 0,3% glukos, 0,5% enzymatiskt hydrolyserat kasein, 0,1% jästextrakt, pH = 6,7. Man späder lösningen med vatten till 100 cms och steriliserar i en 500 cma Erlenmeyer-kolv. Odling sker vid 3200 i en plattskak- maskin med ett slagtal av 230/18 timmar, man sätter till kulturen 5 mg hydrokortison upplöst i 0,5 cm3 metanol och det önskade enzymet induceras. Induktio- nen tar 3 timmar och utförs under samma betingelser som odlingen. 50 cma av den 6-1-dehydrogenas-enzym- -haltiga kulturen införs i en 3 l Erlenmeyer-kolv, som innehåller 950 cma sterilt vatten, och omvand- lingen utförs med den på så sätt erhållna ZO-faldigt ut- spädda aktiva kultren. Det satsade substratet uppgår till 2 g hydrokortison och insättandet därav sker på följande sätt under användning av ovan angivna till- sats: V Man sätter 20 g a-cyklodextrin till kulturen och efter upplösning därav upplöser man hydrokortiso- net i 20 cm: metanol, varvid metanolen innehåller 10 viktprocent CaCl2. Lösningen sätter man därefter till den kultur som innehåller u-cyklodextrinet. Omvand- lingen sker vid 32°C under 5 timmar i ovannämnda skak- maskin. Närvaron av a-cyklodextrinet förhindrar ut- fällning av substratet vid införande därav i det vat- tenhaltiga mediumet och omvandlingen av det upplösta substratet sker med en större, genom enzymaktiviteten mycket större hastighet än i det system som innehål- ler substratet i form av en suspension. Omvandlingsti- den för ovan angivna substrat utan cyklodextrin uppgår till 8 timmar. Mot slutet av omvandlingen är jäsnings- mediumets steroidhalt 1920 um/cm3 prednisolon, 40 ug/cma 20-B-hydroxi-prednisolon och 8 ug/cma hydrokortison.

Exempel 2 Substrat: 17a-metyl-testosteron (androstan-' derivat) Mikroorganism: Arthrobacter simplex (ATCC 6946) 10 15 20 25 30 35 452 777 ß~cyklodextrin, upphävande av slutprodukthäm- ning Substratinsättning: variant 1 Den enligt exempel 1 framställda och induce- rade kulturen späds fem gånger och används för 6-1-de- hydrogenering av metyl-testosteron genom att man för igångsättande av bioomvandlingen i systemet inför en lösning av 1,0 g metyl-testosteron i 10 cma metanol.

Omvandlingen följs tunnskiktskromatografiskt. Det in- förda substratet utfaller i systemet och dehydrogeneras under kontinuerlig upplösning. Vid erhållande av ca 400 ng/cma 6-1-metyl-testosteron sätter man till systemet 6,0 g ß-cyklodextrin. Tillsatsen bildar ett komplex av den erhållna produkten, detta är viktigt av den anled- ningen att i annat fall den enzymatiska reaktionen till följd av överskottet av produkten på grund av den kända slutprodukthämningsmekanismen skulle gå allt långsammare och slutligen över huvud taget icke fortsät- ta. Komplexbildningsbenägenheten hos B-cyklodextrin med avseende på produkten är ca fem gånger så intensiv som med avseende på substratet. Insättandet sker under den andra timmen av omvandlingen och inkubationen avbryts med ledning av tunnskiktskromatografiska undersökningar under den sjätte timmen.

Jäsningsmediumets steroidhalt vid slutet av om- vandlingen uppgår till: 970 ug/cms 6-1-metyl-testosteron, 6 ug/cma metyl-testosteron. Utan tillsats av cyklodext- rin avbryts reaktionen vid en återstodssubstratkoncent- ration av 100-120 pg/cma.

Exempel 3 Substrat: 5-pregnen-33,17a,21-triol-20-on-21- -acetat (acylerat pregnen-derivat) Mikroorganism: Flavobacterium lucecoloratum (NIB 9324) Y-cyklodextrin: variant 3.

Med en snedagarkultur av Flavobacterium luceco- 10 15 20 25 30 35 452777 10 loratum (NCIB 9324) inokulerar man 200 cma närsubstrat i en 750 cm3 Erlenmeyer-kolv. Odlingen utförs 20 timmar vid 30°C i en plattskakmaskin med ett slagtal av 230. Med kulturen inokulerar man 5 l sterilt närsubstrat av sam- ma sammansättning i en laboratoriefermenteringsapparat.

Sammansättningen är 1,0 viktprocent jästextrakt, 0,1 viktprocent kaliumvätefosfat, 0,4 viktprocent dikalium- vätefosfat. Till det inokulerade närsubstratet sätter man 250 mg substrat upplöst i 1,5 cma dimetylformamid.

Lösningen sterilfiltreras. Närvaron av substratet möj- liggör bildningen av det erforderliga enzymet under kulturens tillväxt. Efter 12 timmars odling är bakte- irietalet och enzymaktiviteten lämpliga för igångsät- tande av bioomvandlingen och man sätter nu 100 g preg- nen-36,17a,21-trihydroxi-20-21-acetat till kulturen, som har förbehandlats med Y-cyklodextrin. Behandlingen sker på följande sätt: Man homogeniserar 100 g substrat med samma mängd Y-cyklodextrin och 200 cma vatten under 20 minu- ter. Under denna tid bildar en proportionell andel av substratet ett snabblösligt komplex med cyklodextri- net. Suspensionen införs i fermenteringsapparaten och man inkuberar ytterligare 11 timmar till dess substra- tet har förbrukats. Betingelser för inkubationen i la- boratoriefermenteringsapparaten är: BOOC, omröring med 420 varv per minut, luftning med en hastighet av 0,5 l/ 1/minut. Omvandlingen följs tunnskiktskromatografiskt.

Jäsningsmediumets steroidhalt är efter avslutad omvand- ling: 9020 pg/cma Reichstein-S-förening: 4-pregnen-17u,- 21-dihyaroxi-3flo-d1on, 30 ug/cma substrat. utan cykle- dextrin skulle bioomvandlingen kunna utföras med fram- gång först med en mängd av 10 g/l substrat.

Exemgel 4 Substrat: 4-pregnen-17d,21-dihydroxi-3,20-dion- -17-acetat (acylerad kortikosteroid) Mikroorganism: Curvularia prasadii (IMI 71475) 10 15 20 25 30 35 452 777 11 B-cyklodextrin, katalys av esterhydrolysen Substratinförande: variant 1.

Med en suspension av sporer, som har avtvät- tats från en snedagarkultur av Culvularia prasadii (IMI 71475) inokulerar man 100 cms närsubstrat i en 500 cma Erlenmeyer-kolv. Närsubstratets sammansätt- ning är: 1,0 viktprocent sojamjöl, 0,3 viktprocent majsmarmelad, 0,3 viktprocent majsstärkelse, 0,5 vikt- procent maltextrakt, pH = 6,2. Kulturen framställs un- der 24 timmar vid 26°C. 10 cma av kulturen används för inokulering av 100 cma närsubstrat i en lika stor kolv.

Närsubstratet innehåller inget maltextrakt men har i övrigt samma sammansättning som ovan. Mikroorganismen skakas vid 20°C och förökas. Till den fortfarande till- växande, 16 timmar gamla kulturen sätter man det för omvandling avsedda substratet. Substratet är 4-pregnen- -17d,21-dihydroxi-3,20-dionacetat, av vilket 0,12 g upplöst i 3 cms metanol sätts till systemet. Man inku- berar vidare, varefter kulturen hydroxylerar förening- en i 116-ställning, varvid hydrokoriston-17-acetat er- hålls. Vid den tjugonde timmen av den tunnskiktskroma- tografiskt följda omvandlingen uppgår återstodssubstra- tet till 10 viktprocent. Man tillsätter då 0,96 g B- -cyklodectrin. Cyklodextrinet verkar katalytiskt på den enzymatiska hydrolysen av acetylgruppen i steroid- molekylen och därför avspjälkas acetylgruppen samti- digt med den allt långsammare gående hydroxyleringen under resterande tid av bioomvandlingen. Efter ytter- ligare ca 3 timmar kan processen avbrytas.

Jäsningsmediumets steroidhalt vid slutet av omvandlingen är: hydrokortison (4-pregnen-11ß,17a- -21-trihydroxi-3,20-dion) 0,730 mg/cm3, hydrokortison- -17-acetat 0,185 ug/cma, Reichstein S-17-acetat 0,005 pg/cma, Reichstein-S-förening 0,040 ug/cma.

Exemgel 5 Substrat: hydrokortison 452 10 15 20 25 30 35 777 12 Mikroorganism: Arthrobacter simplex (A/CC 6946) B-cyklodextrin, hastighetsökning Substrattillförsel: variant 2 En pâ fast närsubstrat tillväxt kultur av Arthrobacter simplex (ATCC 6946) tvättas och man inoku- lerar 5 l sterilt närsubstrat med ungefär 30 cms sion i en laboratoriefermenteringsapparat. suspen- Närsubstratets sammansättning är: 0,3 viktpro- cent glukos, 0,3 viktprocent pepton, 0,1 viktprocent jästextrakt, pH = 6,8. Kulturen framställs vid 35oC un- med 0,5 l/ inokulerar der omröring vid 240 varv/minut och luftning l/minut under 20 timmar. Med 1 l av kulturen man i en laboratoriefermenteringsapparat 9 l sterilise- rat närsbustrat, vars sammansättning är: 0,5 viktpro- cent glukos, 0,5 viktprocent pepton, 0,4 viktprocent jästextrakt, pH = 6,8. Kulturen framställs vid 35°C un- der 18 timmar med omröring vid 600 varv/minut och luft- ning med 0,3 l/1/minut, varefter för inducering av enzymbildningen en lösning av 0,5 g hydrokortison i 50 cma metanol tillförs. Man inkuberar ytterligare 4 timmar, varefter den aktiva kulturen införs i en syra- fast apparat, där bioomvandlingsmediumet i förväg har preparerats.

Medium: i apparaten inför man 90 l kranvatten och 1200 g 6-cyklodextrin, apparaten upphettas till 100°C och mediumet steriliseras vid denna temperatur 20 minuter och kyls därefter till 35°C. Man upplöser 1,0 g 2-metyl-1,4-naftochinon och 400 g hydrokortison i 4 l metanol innehållande 400 g CaCl2, lösningen ste- rilfiltreras och införs i apparaten. Kulturen införs i apparaten, varvid bioomvandlingsprocessen igångsätter.

Under processen föreligger steroidsubstratet praktiskt taget helt i lösning och detta är viktigt av den anled- ningen att man vid början av produktseparationen eli- minerar risken för blandkristallbildning mellan substra- tet och produkten. 10 15 20 25 30 35 452 777 13 Betingelser vid bioomvandlingsinkubationen är: 35°C, omröring vid 180 varv/minut och luftning med 0,6 l/1/minut. Med ledning av tunnskiktskromatografisk ana- lys avbryter man reaktionen vid en substratmängd av 2 viktprocent och jäsningsmediumet extraheras två gånger med etylacetat genom motströmsextraktion i en apparat, som tillåter närvaron av fast material (exempelvis en vridplattextraktor). Extraktet indunstas i vakuum vid högst 40°C till en koncentration av 8 g/l - ca 50 l av ett första koncentrat - och behandlas med en bland- ning av 40 g aktivt kol och 100 g celite och blandning- en indunstas vidare till kristallisation - ca 2 1. Sus- pensionen kyls till 5-10°C och filtreras efter några timmar. Moderluten utfälls med en femfaldig mängd di- isopropyleter, kyls och filtreras.

Produkten uppgår till 375 g och dess kvali- tet kan karakteriseras på följande sätt: renhet 98 viktprocent torkningsförlust 1 viktprocent sulfataska 0,1 viktprocent hydrokortison-återstod 1,2 viktprocent andra steroider 0,35 viktprocent 234-236°c Ea]É° = +98° (dioxan, c = 1 viktprocent) smältpunkt För att återvinna B-cyklodextrinet omrörs extraktet med 1 l cyklohexan 1 timme vid 18-20°C. Den bildade återstoden filtreras, suspenderas i ca 1 l vatten och cyklohexanen avdrivs frân blandningen un- der kokning (genom vattenångdestillation). Den vatten- haltiga 6-cyklodextrin-suspensionen hålls en natt vid 5-10°C, kristallerna filtreras och torkas i vakuum.

Man återvinner 700 g ß-cyklodextrin, som kan återan- vändas.

Exemgel 6-11 Följande mikrobiologiska omvandlingar utför- des analogt med exemplen 1-5 under de i exemplena an- 10 15 20 25 30 35 452 777 14 givna betingelserna, varvid man använde cyklodextrin för intensivering av den önskade reaktionen.

Exempel 6 Substrat: progesteron Mikroorganism: Mycobacterium sp. (NRRL B 3805) 6-cyklodextrin, koncentrationsökning Substratinförande: variant 1 7 Slutprodukt: androstat-4-dien-4,17-dion Nedbrytningen av substratets sidokedja utförs enligt metoden av Marscheck, W.J. Kraychi, S. och Muir R.D. (1972) Appl. Microbiol. 23, 72. Molförhâllandet steroid/cyklodextrin är 1:0,2. Närsubstratet innehål- ler 0,5% Na2HPOn.7H2O. Pâ grund av närvaron av cyklo- dextrin kan den utan cyklodextrin erhållna sitosterin- koncentrationen 1 g/l höjas till 2 g/l under oföränd- rad omvandlingstid (ca 170 timmar).

Exempel 7 Substrat: progesteron Mikroorganism: Ophiobolus herpotrichus B-cyklodextrin, fullständig omvandling Substratinförande: variant 1 Slutprodukt: 21-dihydroxi-progesteron Reaktionen utförs enligt metoden av Meystre et al., Helv. Chim. Acta 37 (1954) 1548. Molförhâllandet steroid/cyklodextrin är 1:0,2. Närsubstratet är ölmäsk, i vilken mikroorganismen har odlats 3 dagar, och man tillsätter därefter en acetonlösning av progesteron- substrat till dess man uppnår en koncentration av 0,25 g/1 jäsningsmedium. Utan användning av cyklodextrin tar omvandlingen ytterligare 3 dagar och substratåterstoden är ungefär 25%. Om cyklodextrin sätts till reaktions- blandningen 24-30 timmar efter påbörjad bioomvandling blir mängden substratåterstod väsentligt mindre.

Exempel 8 Substrat: 4-pregnen-17d,21-dihydroxi-3,20-dion (Reichstein-S) 10 15 20 25 30 35 452 777 15 Mikroorganism: Curvularia lunata (IFO 49) B-cyklodextrin, inverkan på förhållandet mellan reaktionsprodukterna Substratinförande: variant 1 Huvudprodukt: hydrokortison Reaktionen utförs enligt metoden av Kondo, E. och Mitsugi, T., J. Agro. Chem. Soc. Japan 35 (1961) 521. Molförhållandet steroid/cyklodextrin är 1:0,3.

Utan tillsats av cyklodextrin erhåller man vid bioom- vandlingen 35-40 viktprocent 6-B-hydroxi~Reichstein-S, 15-20 viktprocent 11a-hydroxi-Reichstein-S och ca 5 viktprocent 7,14u-dihydroxi- och 5 viktprocent 6-B- -14u-dihydroxi-Reichstein-S. Om under den första tim- men av bioomvandlingen B-cyklodextrin sätts till bland- ningen i ovan angivna förhållande kan förhållandet 11a- -hydroxi-Reichstein-S (epi-hydrokortison) i produkten ökas till det dubbla.

Exemgel 9 Substrat: 16u-metyl-Reichstein-S Mikroorganism: Curvularia lunata (ATCC 12017) B-cyklodextrin, förbättring av omvandlingens effektivitet Substratinförande: variant 1 Slutprodukt: 11ß~17a,21-trihydroxi-16a-mety1- -pregn-4-en-3,20-dion (16u-metyl- -hydrokortison) Reaktionen utförs enligt metoden av Canonica, L. et al. Gass. Chim. Ital. 93, (1963) 368. Molförhål- landet steroid/cyklodextrin är 1:1. Utan användning av cyklodextrin erhålls huvudprodukten i en mängd av ca 55 viktprocent. Om under den första timmen av bioom- vandlingen B-cyklodextrin sätts till reaktionsbland- ningen i ovan angivna förhållande ökar andelen av hu- vudprodukten med 5-10%. 4ExemEel 10 substrat= ss,1va,21-trinyaroxi-pregn-5-en- -20-on-21-acetat 10 15 20 25 30 35 452 777 16 Mikroorganism: Flavobacterium dehydrogenans (ATTcc 13930) B-cyklodextrin, koncentrationsökning Substratinförande: variant 1 Slutprodukt: Reichstein-S Reaktionen utförs enligt US-PS 3 009 936.

Molförhållandet steroid/cyklodextrin är 1:0,3. Med cyklodextrin kan koncentrationen ökas till det dubb- la.

Exemgel 11 Substrat: Lanatozid-A (Digitalis Glucosid) Mikroorganism: Streptomyces purpurascens B-cyklodextrin, koncentrationsökning Substratinförande: variant 1 Reaktionen utförs enligt HU-PS 176 250. Mol- förhâllandet lanatosid-A/cyklodextrin är 1:1. Utan an- vändning av cyklodextrin sätter man till en 2 dagar gammal kultur av Streptomyces purpurascens en lösning av lanatosid-A i organiska lösningsmedel i en koncent- ration av 0,5 g/1. Om man till reaktionsblandningen efter 2 dagars odling under den första timmen av bio- omvandlingen sätter B-cyklodextrin i ovan angivna för- hållande kan koncentrationen av substratet ökas till 2 g/l.

Claims (10)

10 15 20 25 30 452 777 Patentkrav

1. Förfarande för intensifieringznrden mikro- biologiska omvandlingen av steroider, k ä n n e - t e c k n a t reaktionen av steroidsubstratet i närvaro av d-, B- av, att man utför den mikrobiologiska eller Y-cyklodextrin eller en godtycklig blandning där- av och eventuellt återvinner cyklodextrinet från sys- temet efter avslutad omvandling.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e - t e c k n a t av, att man i systemet inför cyklo- dextrinet före den mikrobiologiska reaktionen, vid början därav eller under reaktionen.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n - n e t e c k n a t av, att man använder cyklodextrinet i en mängd av 0,2 - 3 mol per mol substrat.

4. Förfarande enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av, att man inför det lämp- liga cyklodextrinet ifråga före införande av substratet i bioomvandlingssystemet.

5. Förfarande enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av, att man använder inklu- sionskomplexet av substrat/cyklodextrin för mikrobio- logisk omvandling.

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e - t e c k n a t av, att man använder en lösning eller suspension av substrat-cyklodextrin-inklusionskomplexet.

7. Förfarande enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av, att man inför cyklodext- rinet i systmet efter fullföljda 35-50% av den mikro- biologiska omvandlingen.

8. Förfarande enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av, att man före införandet i bioomvandlingsmediumet steriliserar cyklodextrinet respektive dess med steroidsubstratet bildade inklu- sionskomplex eller eventuellt en lösning därav. 10 15 20 25 30 35 452 777

9. Förfarande enligt något av kraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av, att man steriliserar det i bioomvandlingsmediumet införda cyklodextrinet jämte mediumet.

10. Förfarande enligt krav 1, t e c k n a t k ä n n e - av, att man extraherar steroiden med ett organiskt lösningsmedel från det vattenhaltiga bioomvandlingsmediumet och utfäller cyklodextrinet genom tillsats av ett lösningsmedel, som kraftigt ned- sätter lösligheten, lämpligen hexan, isolerar cyklo- dextrinet från raffinatet genom filtrering och even- tuellt torkar cyklodextrinet.