CS239932B2

CS239932B2 - Method of intensification of microbiological trnsformation of steroids

Info

Publication number: CS239932B2
Application number: CS826856A
Authority: CS
Inventors: Nagy Udrvardy; Istvan Bartho; Gabor Hantos; Maria Trinn; Zsuzsa Vida; Jozsef Szejtli; Agnes Stadler; Ilona Habon; Marta Balazs
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet; Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1981-09-28
Filing date: 1982-09-24
Publication date: 1986-01-16
Also published as: IT8223453A0; FR2513656B1; ES516007A0; DK422182A; DE3235884C2; DE3235884A1; SE452777B; BE894501A; ES8400146A1; IT1157322B; GB2108965A; US4528271A; FR2513656A1; JPS5867194A; CH656642A5; GB2108965B; ATA357182A; JPH047197B2; SE8205506L; SE8205506D0

Description

(54) Způsob zintenzivnění mikrobiologické přeměny steroidů

Způsob zintenzivnění mikrobiologické přeměny steroidů, s použitím pomocných látek, při němž se mikrobiologická přeměna provádí za přítomnosti alfa-, beta- nebo gama-cyklodextrinu nebo za přítomnosti libovolné směsi těchto látek v množství 0,2 až 3 moly na 1 mol steroidního substrátu a po skončení přeměny se cyklodextrin popřípadě ze systému regeneruje a vrací zpět k mikrobiologické přeměně.

Vynález se týká způsobu zintensivnění mikrobiologické' přeměny steroidních sloučenin použitím přísady na bázi c.ykkodextrinu.

Při výrobě steroidaích sloučenin často dochází k tomu, že se'jeden stupeň vícestupňové syntézy těchto látek provádí při využití specifické funkce některého mikroorganismu. Buňky mikroorganismu, enzymy, extrahované z těchto buněk, popřípadě fixované buňky nebo fixované enzymy z těchto buněk se použivaSí při biologických způsobech přeměny, které probíhaaí ve vodném prostředí. Přestože tyto enzymaaické reakce ve svrchu uvedeném prostředí probíhají velmi standardně, maaí současně ve srovnání s reakcemi, probíhajícími v organických rozpouštědlech tu podstatnou nevýhodu, že steroidní sloučeniny jsou nesnadno rozpustné ve vodě. Roopuusnost celé řady steroidních sloučenin ve vodě je velmi malá, což v řadě případů znamená, že jejich výsledná koncentrace je niiáí než koncentrace, při které biologické způsoby přeměny jsou ještě proveddtelné z ekonomického hlediska.

V případě známých způsobů se v průběhu reakce obvykle nachází , určité množší substrátu nebo určité množní výsledného steroidního produktu v průběhu reakce v pevné formě. Rozpouštění substrátu z uvedené pevné fáze může určovat výslednou reakční rychlost v případě heterogenní velikosti částic je rychlost rozpouštění při zvyšování průměru částic nerozpuštěného podílu stále nižší. Může dokonce do;jít k tomu, že v důsledku špatného rozpouštění se reakce sama zastaví před dosažením požadované přeměny·

Ke zvýšení rozpustnosti sterol^ího substrátu ve vodě nebo ke zrychlenému rozpouštění produktu byla navrhována celá řada postupů.

V briskkém patentn-č.. ' 1 211 356 se k dosažení humooeentíhu rozptýleného substrátu před reakcí přiváděný steroid mechanicky disperguje. Podle US patentu č. 4 124 607 se subbtrát s jemnými zrny připravuje v odděleném stupni tak, že se steroidní roztok, získaný podle v organickém rozpouštědle disperguje ve vodě a pak se rozpouštědlo oddásstluje. Je možno také po8tupovva,tak, že se steroidní sloučenina rozpustí v organickém rozpouštědle a vysrážení se provádí až v průběhu biologické přeměny. Podle maďarského patentu č. 149 678 se rozpouštědlo, použité k rozpuštění sul^s^t^irátu, například pyridin nebo kyselina octová, před počátkem biologické přeměny neutralizuje a rozpustnost se zlepšuje v případě alkoholu přidáním chloridů alkalických kovů a chloridů kovů alkalických zemin.

Podle britského patentu č. 1 083 204 se zlepšuje rozpustnost steroidního substrátu v reakčním prostředí tak, že se přidává některé z organických rozpouušědel, s výhodou dimeeyysulfoxid, a to současně se substráeem nebo po jeho uvedení do reakční směěi. Je také možno postupovat tak, že se rozpustnost steroidního substrátu zajišťuje pomocí rozpouštědel nemísstelných s vodou, v tomto případě je umožněna rychlá výměna látek velkou hraniční plochou ve vzniklé emulzi, jak je uvedeno například v pubbikaci B-otechn. Bioeng. 21 . 39 (1979). Ve farmaceutickém průmrslu se často používá činidel, napom^haících rozpoutání. Podle NSR patentu č. 1 543 431 je možno podstatně ztyšit výtěžek sndrustendionl při jeho výrobě z 4-kolleзttn-3-onu přidáním činidel tohoto typu. <

Známá řešení mohou zmennšt nevýhody, spojené se špatnou ruzpultnoutí steroidního substrátu ve vodě, nejsou však ekonomické nebo ííSí nepříznivé účinky na celý systém. Například v případě, že se vyrobí s^bs^t v milkOlkyssalické formě, znamená to nutnost většího počtu pracovních stupňů při technologickém postupu a mimoto ke ztráám výsledného míSteiáll· Podle jiných pozorování dochází také k poškození mikroorganismu při delším působení organického rozpouštědla, zejména v množs-V.!, jehož je zapotřebí k' ' dost^enému zvýšení rozpustnost tteyuidl ve vodě, jak bylo popsáno například v pubbikaci Steroids, J2, 525/196β).

V případě, že se používá činidel, usnadňujících rozpouštění, dochází současně ke tvorbě pěny, což ztěžuje dostatečné provzdušňování systému, v němž probíhá biologická přeměna.

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob, který by na jedné straně odstraňoval nevýhody známých postupů, na druhé straně by při prováděni tohoto způsobu mělo dojít ke zintensivnění mikrobiologické přeměny steroidů.

Nyní bylo zjištěno, že cykLodextriny je možno použít v systémech pro biologickou přeměnu ke zlepšení rozpustnosti steroidních molekul ve ' . . vodě, v případě nerozpustného zbytku ke zvýšení rychlosti jeho rozpouštění a tím k podstatnému zvýšení rychlosti biologické přeměny a mimoto v daném systému k zábraně zpomaaení reakce při vznikání většího výsledného produktu a k zábraně blokády reakce působením některých stxriclýih skupin ve steroidní-molekule. C^b^!^L^(^d^3^t^]riny alfa- a beta- nebo jejich sméěi mají katalytický účinek při hydrolýze esterů. V případě, íe mikroorganismus má dvě nebo větší počet funkcí, může dooít k selektivnímu ovlivnění poměru mezi reakčními produkty, tedy ke zintenzivnění celé přeměny,

Předmětem vynálezu je způsob zintenzivnění mikrobiologické přeměny steroidů, s použitím pomociých látek, který se provádí tak, íe se mikrobiologická přeměna uskutečňuje za přítomno ti alfa -, beta- nebo gjmaa-yУlojdχtrinu nebo za přítomnost libovolné směsi těchto látek v m^ísv! 0,2 aí 3 moly na 1 mol steroidního substrátu a po skončení přeměny se cyklodextrin popřípadě ze systému regeneruje a vrací zpět k mikrobiologické přeměně. Pod pojmem cykloddetriť', se dále rozumí alfa-, beta- nebo gamaa-yУlojfχtrit nxbo libovolná směs těchto látek. Před . počátkom mikrobiologické přeměn/, při jejím začátku nebo v průběhu přeměny se přidává na 1 mol substrátu celkem 0,2 aí 3 moly cykljdextritu. Podle jednoho z možných provedení se přidává odppliddjící cyOndextrin před přívodem sub» strátu do směsi pro biologickou přeměnu.

Podle dalšího možného provedení se smísí subbtrát s cyklodettrinem a vzniklý Skluzní komplex nebo jeho vodný roztok nebo jeho suspenze se pak přidávají do prostředí pro biologickou přeměnu. Podle dalšího možného provedení se cyklodextrin přidává jako takový nebo ve formě ^kluzního komplexu se substrátem, popřípadě ve formě vodného roztoku nebo suspenze ^kluzního komplexu v průběhu mikrobiologické reakce, obvylkLx po dosaíení 30 aí 50% přeměny. Roztok cyklldextritu nebo inkluzního komplexu cykljdeχtritu a substrátu je možno před přívodem do prostředí pro biologickou přeměnu sterilizovat nebo je moíno tyto látky sterilizc)ijt společně s prostředím pro biologickou přeměnu. СуУкос^х^^ je moíno získat z vodného prostředí pro biologickou přeměnu tak, íx se steroid extrahuje organickým rozpouštědlem a суУк^ех^^ sx vysráíí přidáním rozpouštědla, které silně sniíuje jeho rozpustnost, s výhodou hexanu a pak se odfiltruje a popřípadě suší.

Zintenzivnění mikrobiologické přeměny steroidů podle vynálezu je velmi výhodné, protoíe zajišlujx reakční rychlosti a tím zkrácení doby reakce, současně je moíno zvýýit 10^0X^801 s^bírštu v prostředí, odstraňuje se nepříznivý vliv hromadění výsledného produktu, z většího počtu možných reakcí je možno katalyzavat plíafoianlu reakci a je také moím zvýis selektivitu mikrobiologického postupu.

Skluzní komplex cyklldextгitu se steroidním substráXem je možno vyrofabt různými způsoby. Podle jednoho způsobu sx k prostředí pro biologickou přeměnu přidá vodný roztok plíjflvanéhl cyklodextrinu určité koncentrace’ a k němu se přidá steroidní subbtrát, čímí vznikne Skluzní komplex. (Vaaianta 1).

Je také možno postupovat tak, íx sx vyloučí přímě přidávání steroidů do systému a v odděleném tanku se vyrobí vodný roztok inkl-uzního komplexu substaátu s cy^^e^^nem, který se sterilizuje filtrací a pak sx přidá do prostředí pro biologickou přeměnu (varianta 2). Za přítomnost určitého mn^s^ví vody jx moíno směs cyklodextrinu a steni-dů přxkryštelovat za vzniku krystalického komplexu steroidů s cyklodextrinem, který jx moíno p^x^á^í^^t při biologické přeměně, ktxrá nevyíaduje sterilizaci, v pevné formě (varianta 3).

Cyklodextriny jsou polymery glukózy přírodního původu, které sestávají z velkých kruhů ze 6, 7 nebo 8 glukózových jednotek. Jejich struktura je charakterizována zvláštním uspořádáním hydroxylových skupin. Všechny sekund&mí hydrotylové skupiny se nacházejí na stejném ola*aji kruhu, primární hydroxylové skupiny se nacházeei na opačném okraji. V důsledku toho je zevní plocha kruhu hydrooilnd a z tohoto důvodu jsou cyklodextriny rozpustné ve vodě.

V^třní strana kruhu je hydrofóbní. Cykkodextriny mohou vytvářet s molekulami odpooídaaící velikosti a tvaru inkluzní komplexy. Су^ос^х^^ s obsahem 6 glukopyrano'zových jednotek je elia-cyklodextrin, beta-cyklodextrin je tvořen 7 glukopyranozotými jednotkami a gamía-yklolextrin je tvořen 8 glukopyranozovými jednotkami. Podle své vazby se nazývají cyklodextriny také cyklojpylo'zy. Kornptexy steroidních molekul s cyklodextrnnem již byly sledovány v průběhu zkoumání většího počtu fa^a^^gických účinných látek a látek, napomPhhjících rozpouštění, jak bylo popsáno například v publikaci Lech a Pauli: J. Pharm. Sci. 55. 32 0966). V případě testcзt·ronu a loltislnacetátu byl stanoven i pravděpodobný stechicpetriclý poměr jednotlivých složek. Zvětšenou rozpustností se zvyšovala naděje na lepší vstřebávání farmaceutických účinných látek. Až dosud však nebyly cyklodextriny nikdy použity k zintenzivnšní reakce mikrobiologické přeměny steroidních substrátů. Bylo prokázáno, že komplex steroidního substrátu s cyklodextrinep podléhá ve vodném prostředí rychle disociaci a v pystému pro biologickou přeměnu je v dynamické rovnováze s volnými molekulami steroidu a s molekulami cyklodextrinu. V systému pro biologickou přeměnu, který obsahuje pevný steroid v suspenzi závisí okamžitá koncentrace rozpuštěného podílu, na který může působit enzym, vždy na rychlosti rozpouštění substrátu a na rychlosti enzymatické reakce. / případě, že rozpouštění je pomelé, zůstává v průběhu reakce koncentrace steroidního roztoku daleko pod nasycením a reekce trvá podle základních pravidel enzymatických reakcí podstatně déle.

ИааюИ tomu z inkL-uzního komípexu s cyklodeχtrjnep se subbtrát uvolňuje prakticky ok^íži^ě. Moosteí rozpuštěného substrátu zůstává orotl v tomto případě stálé v průběhu celého lottulu až do jeho konce a dosahuje nasycení, takže je možno zajjstit p^j^íí^PIl^zÍ rychlost přeměny pro danou enzyppaickou reakci.

Při jiném typu reakcí pro přeměnu steroidů může doo^t k tomu, že výsledný produkt při své tvorbě zpo^pti^ije nebo zastavuje reakci v případě, že se váže na enzym nebo na povrch buňky. Vzhledem k odlišné struktuře substrátu a potekuly výsledného produktu k tomuto jevu při pouHtí komplexu s cylkLodextrnnep nedochází. Podle nejnovёjšdch sledování je možno zvoHt tak příznivé reakční podmínky, při nichž se výsledný steroid převádí na komplex s cyklodextrinep, aniž by tip byla zhoršena dostupnost původního ttercidrího substrátu. V případě, že stálost komplexu substrátu s cyklodextrnnep překročí stálost komplexu výsledného produktu s cyktedextrineí, je možno postupovat tak, že se cyklodextrin přidává do reakční směsi pouze v top případě, že se v systému nachází přebytek reálního produktu.

Bylo také prokázáno, že je možno příznivě ovlivnit enzypítickou hydrolýzu esteriHované sterčidní potekuly tvorbou ldpoc·íddjícíhl komplexu s alfa- a/nebo betj-cykLcdeettinem. Je možno to vysvěttit katalytckýp účinkem, který .vyplývá ze struktury cyklodextrinu.

V případě různých biologických přeměn bylo možno také pozorovat, že tvorba komplexu s cyklodextrneeí má za následek další různé změ^ny, které mohou vést v případě komplexu s cdpolídající stálostí například k tomu, že se zmínkuje rychlost reakce pro některou konfiguraci nebo dojde k téměř úplnému vyloučení jednoho typu reakce.

Tvorba innuzních komplexů t účinek na zintenzivněni biologické přeměny platí obecně zejména pro sloučeniny steránového typu. S určitými úpravtí je možno příznivě ovlivnit také přeměny, při nichž docbázX k tvorbě estrirnových, androst trnových, pregntnov^ch, cholest uniových, stigmas! trnových sloučenin t tak jak je uvedeno v následujících příkladech, které však nemají sloužit k ovlivnění rozsahu vynálezu.

Přikladl

Substrát: hydrokortison

Mikroorganismus Arthrobacter simplex (ATCC 6 946) alfe-cyklodextrin, zvýšení rychlosti

Přidávání substrátu: 1· varianta

Agarová kultura Arthrobacter simplex (ATCC,6 946) se promyje fyziologický· roztokem soli a 5 ml této suspenze se naočkuje následující živná půd·: glukóze 0,3 %, enzymaticky hydrolyzovaný kasein 0,5 %, extrakt z kvasnic 0,1 %, ph 6,7. Roztek se doplní vodou na 100 ml a sterilizuje v Erlexmeyerově bance o obsahu 500 ml. Kultivace se provádí při teplotě 32 °C na třepačce při 230 výkyvech po dobu 18 hodin, pak se přidá 5 mg hydrokortisonu v 0,5 ml metanolu a přivádí se požadovaný enzym. Enzym se přivádí 3 hodiny za týchž podmínek, při nichž se provádí kultivace. Kultura, obsahující 50 ml delta-1-dehydrogenázy jako enzymu se vloží do Erlenmeyerovy baňky o obsahu 3 litry s obsahem 950 ml sterilizované vody přeměna se provádí э dvacetinásobně zředěnou aktivní kulturou. Substrát obsahuje 2 g hydrokortisonu, reakce probíhá následujícím způsobem:

g alfa-cyklodextrinu se přidá ke kultuře, po jeho rozpuštění se rozpustí hydrokortison ve 20 ml metanolu s obsahem 10 % hmot, chloridu vápenatého. Získaný roztok . se přidá ke kultuře s obsahem alfa-cyklodextrinu. Přeměna probíhá při teplotě 32 °C na svrchu uvedeném zařízení 5 hodin. Přítomnost alfa-cyklodextrinu brání v průběhu přívodu substrátu do vodného prostředí jeho vysrážení, přeměna substrátu po jeho rozpuštění probíhá rychleji než v systému, v němž se substrát nachází jako suspenze. Doba přeměny substrátu bez cyklodextrinu je 8 hodin. Na konci přeměny je možno ve fermentačním prostředí prokázat 1 920 ^ug/ml prednisolonu, *40 _/ug/ml 20*-beta-hydroxyprednisolonu a 8 ^ug/ml hydrokortisonu.

Příklad 2

Substrát: 17alfa-metylteetosteron (androstanový derivát)

Mikroorganismus: Arthrobacter simplex (ATCC 6 946)

Beta-cyklodextrin, odstranění brzdicího účinku výsledného produktu

Přidávání substrátu: varianta 1.

Indukovaná kultura získaná způsobem podle příkladu 1 se pětkrát zředí а к delta-1-dei hydrogenaci metyltestosteronu se použije na začátku přeměny roztok 1,0 g metyltestosteronu v 10 ml metanolu, který se přivádí do systému. Přeměna se sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Substrát se ze systému vylučuje a v průběhu kontinuálního rozpouštěni dochází к jeho dehydrogenaci. Při dosažení koncentrace přibližně 400 jig/nl delta-1-metyl.testoeteronu se do systému přidá 6,0 g beta-cykledextrinu. Tato přísada vytváří komplex se vznikajícím produktem, což je velmi důležité, protože jinak dochází ke zpomalení enzymatické reakce, protože převaha výsledného produktu reakci zpomaluje. Tvorba komplexu s beta-cyklodextrinem probíhá přibližně pětkrát intenzivněji než tvorba komplexu se substrátem. Přidávání se provádí ve druhé hodině a inkubace se provádí až de 6. hodiny při sledování chromatografií na tenké vrstvě.

Obsah steroidů ve fermentačním prostředí na konci fermentace je 970 /Ug/ml delia-1-metyltestosteronu, 6 /Ug/ml metyltestosteronu. Bez přidání cyklodextrinu ее reakoe zastaví při zbývající koncentraci substrátu 100 až 120 ^g/ml.

Příklad 3

Substrát: 5-pregnen-3beta,17alfa,21-triol-20-on-21-acetát (acylovaný pregnenový derivát)

Mikroorganismus: Flavobacterium lucecoloratum (NIB 9 324)

Gama-cyklodextrin se přidává podle varianty 3«

Kulturou Flavobacterium lucecoloratum (NCIB 9 324) ze šikmého agaru se naočkuje 200 ml živného prostředí v Erlenmeyarových baňkách o obsahu 750 ml. Kultivace se provádí 20 hodin při teplotě 30 °C na třepačce s 230 výkyvy. Touto kulturou se naočkuje 5 litrů sterilního vodného prostředí téhož složení v laboratorním fermentoru. Prostředí obsahuje 1,0 % hmot, extraktu z kvasnic 0,1 % hmot, di/hydrogenfosforečnanu draselného a 0,4 % hmot, hydrogenfosforečnanu draselného. К naočkovanému živnému prostředí se přidá 250 mg substrátu v roztoku v 1,5 ml dimetylformamidu. Roztok se sterilizuje filtrací. Přítomnost substrátu umožňuje tvorbu potřebných enzymů' při růstu kultury. Po 12 hodinách kultivace jo počet bakterií a enzymatická účinnost vhodná к počátku biologické přeměny a přidá se tedy 100 g pregnen-3beta-17alfa,21-trihydroxy-20,21-acetátu ke kultuře, к níž se předem přidá gama-cyklodextrin;

Postupuje se následujícím způsobem:

100 g substrátu se homogenizuje se stejným množstvím gama-cyklodextrinu a 200 ml vody 20 minut, v průběhu této doby vytvoří určitý podíl substrátu s cyklodextrinem snadno rozpustný komplex. Suspenze se míchá ve fermentoru a inkubuje dalších 11 hodin tak dlouho, až se substrát spotřebuje. V laboratorním fermentoru se udržuje teplota 30 °C. Prostředí se míchá při 420 otáčkách za minutu a provzdušňuje rychlostí 0,5 litru za minutu. Přeměna se sleduje chromatografií na tenké vrstvě. Obsah steroidů ve fermentačním prostředí po ukončení přeměny ja 9 020 pg/ml 4-pregnen-17alfa,21-dihydroxy-3,20-dionu a 30 jUg/ml substrátu. Bez cyklodextrinu by bylo možno biologickou přeměnu provádět až při množství 10 g substrátu v 1 litru.

Příklad 4

Substrát: 4-pregnen-17alfa,21-dihydroxy-3,20-dion-17-acetát (acylovaný kortikosteroid)

Mikroorganismus: Curvularia prasadii (IMI 71 475)

Beta-cyklodextrin, katalýza hydrolýzy esteru

Přívod substrátu podle varianty 1.

Suspenzí spor, získaných omytím kultury Culvularia prasadii (IMI 71 475) na šikmém agaru se naočkuje 100 ml živného prostředí v Erlenmeyarových baňkách o objemu 500 ml. živné prostředí obsahuje 1,0 % hmot, sojové mouky, 0,3 % hmot, kukuřičného výluhu, 0,3 % hmot, kukuřičného škrobu a 0,5 % hmot, sladového extraktu při pH 6,2. Kultura ее inkubuje 24 hodin při teplotě 25 °C, 10 ml této kultury se pak použije к naočkování 100 ml živného prostředí v baňkách stejné velikosti, živné prostředí v tomto případě neobsahuje sladový extrakt, jinak má stejné složení jako svrchu. Mikroorganismus se inkubuje při teplotě 26 °C na třepačce*’, v průběhu jeho růstu se po 16 hodinách přidá substrát, a to 4-pregnen-17al£a,21-dihydroxy-3,20-dionacetát. .

Přidává se 0,12 g substrátu v roztoku ve 3 ml metanolu. Pak se kultura dále inkubuje přičemž dochází к hydroxylaci v poloze 11 beta, čímž vzniká hydrokortison-17-acetát. Ve 20. hodině přeměny, sledované chromatografií na tenké vrstvě, zbývá ještě 10 % hmot, substrátu.

Pak se přidá 0,96 g beta-cyklodextrinu. Cyklodextrin působ:! katalyticky na enzymatickou hydralýzu acetylové skupiny steroidní modekily, takže ve zlývající době biologické přeměny se kromě zpommlující se hydroxylace odštěpuje acetyloaá skupina. Po dalších 3 hodinách je možno postup přerušit.

Fermwitační prostředí na konci biologické přeměny obsahuje hydrokOTtison (4-pregnen-Hbeta, 177Дfa,21-trilkedroty-3,20-dion) a mnoství 0,730 /ug/m., 0,185 ^ug/ril hydrokootison-17acetátu, 0,005/ug/ml 4-prxgten-177lfl_l2l-dihydroχr-3,20-dion-17-acetátu a 0,040/Ug/ml ^preginen^lf a, 21-dihydroty-3,20-dion.

Příklad 5

Suussrát: hydrokot^,tison

Mikroorganismus: Arthrobacter simplex (ATCC 6 946)

Betl-cyklddextгit, zvýšení rychlosti reakce

Přidání substrátu: varianta 2.

Katura Athrobacter simplex (ATCC 6 946) získaná na pevné živné půdě se omyje a 30 ml suspenze této kultury se použije k naočkování 5 litrů sterilního živného prostředí v laboratorním fermentoru.

Živné prostředí obsahuje 0,3 % hmot, glukózy, 0,3 % hmoo. peptonu, 0,1 % hmoo. extraktu z kvasnic při pH 6,8. K^utiura se pěstuje při teplotě 35 °C a při 240 otáčkách za minutu při provzdušnování 0,5 litry vzduchu na 1 litr živného prostředí za minutu 20 hodin.

Pak se použije 1 litr kuLtury k naočkování 9 litrů sterilního živného prostředí v laboratorním fermentonu. Prostředí obsahuje 0,5 % hmot· glukózy, 0,5 % hmoo, peptonu, 0,4 % hmoo, extraktu z kvasnic při pH 6,8.

&u.tura se pěstuje při teplotě 35 °C a 600 otáčkách za minutu při provzduěňování 0,3 litry vzduchu na 1 litr prostředí za minutu celkem 18 hodin a pak se k indukci tvorby enzymu přidá roztok 0,5 g hydrokootisonu’v 50 ml metanolu. Směs se inkubuje ještě 4 hodiny, načež se aktivní kultura uloží do zařízení, odolného proti kyselinám a prostředí se dále zpracovává.

V uvedeném zOřísení bylo předem připraveno prostředí pro biologickou přeměnu tak, že se 90 litrů vody z vodovodu a 1 200 g beta-cykLodextrinu zaseje na 100 °C a prostředí se při této teplotě sterilizuje 20 minut a pak zchladí na 35 °C. Pak se rozpuutí 1,0 g 2-mej^]^-1,4-nafi^c^c^h^j^r^o^nu a 400 g hydrokortisonu ve 4 litrech metanolu s obsahem 400 g chloridu vápenatého, roztok se sterilizuje filtrací a přidá se do zařízení. Pak se do září' zení přidá ještě svrchu uvedená kiltura, čímž počne probíhat biologická přeměna. V průběhu přeměny se nachází steroidní substrát prakticky v roztoku, což je důležité z toho důvodu, že se tímto způsobem vylučuje lrystllizlce při počátku vylučování výsledného produktu z prostředí. Jinak se totiž mohou tvořit smíšené krystaly substrátu a výsledného produktu.

Při biologické přeměně se udržuje teplota na 35 °C při 180 otáčkách za minutu a provzduěnování 0,6 litry vzduchu na 1 litr prostředí za minutu. Podle výsledků chromatografie na tenké vrstvě se reakce přeruší při obsahu sibesrátu 2 % hmot, a fermantační prostředí, se pak dvakrát extrahuje etylacetáeem v protiproudu v zařízení, které dovoluje ořítomnost pevného podílu. Extrakt se odpaří ve vakuu při teplotě nepřevyšující 40 °C na konceenraci 8 g/litr, čímž se získá přibližně 50 litrů prvního konnceinrátu, přidá se směs 40 g aktivního uhlí a 100 g celitu a směs se dále koncentrujx až na přibližně 2 litry, přičemž dojde ke 1^;^é^s^i^].ízi(^í. Suspenze se zchladí na 5 až 10 °C a po několika hodinách se zfiltruje.

Matečný louh se sráží ^pěti násobkem diisopropyleteru, načež se zchladí a zflltruje.

Získá se 375 g výsledného produktu β následuuícími vlastnostmi:

Čistota ztráta při sušení sulfátový popel zbytek hydrokortisonu d^l.S:í steroidy teplota tání % hmot.

% hmot

0,1 % hmot 1,2 % hmot 0,35 % hmot

234 až 236 °C = +98° ^(dioxan, c = ¹ % ^h^oo).

Ke zpětnému získání beta-cyklodaxtrinu se extrakt míchá s 1 lirrem cyklohexanu hodinu ^při te^plot^ě.18 až ²⁰ °^Q. Vzniklý pevný podíl se odděH flitraci, uvede se v suspenzi v 1 Litru vody a cyklohexan.se odstraní ze směsi varem deettlací s vodní parou. Vodná suspenze beta-cykl^extrinu·. se ud^uje přes noc na tepteta 5 a^{ž 10} °C krystaly se oddMi filtrací a suší ve vakuu. Tímto způsobem se získá 700 g beta-cylklodextrlnu, který je možno znovu poouít.

Příklady 6 až 11

Násseduuící mikrobiologické přeměny se prováděl analogickým způsobem jako v příkladech 1 až 5 za podmínek, uvedených v těchto příkladech, cyk^cete^^ po užije ke zintensivnění jednotlivých reakcí.

Příklad . 6

Suussrát: sitosterol

Mikroorganismus: Mysobscterium sp. (NRRL B 3 805)

Beta-cyklddíχtrin: zvýšení koncentrace

Přidávání subssrátu: varianta 1

Výsledný prodat: anddOdSa-14~dinn-4,17-Uidt

Odboouáváií postranního řetězce ze subssrátu se provádí způsobem podle publikace W. J. Miurscheck, S. Kraychi a R. D. Mdr (1972) Appl. MicrobSo! £3, 72. při pouuití steroidu a cyldcdextrinu v moládním poměru 1:0,2.

živné prostředí obsahuje 0,5 % NagHPOo*7 HgO. V případě, že se bez cyklodextrinu získá koncentrace 1 g/litr sit-oste^lu, je možno při stejné době přeměny 170 hodin působením cyklodextrinu zvýšit koncentraci 8itdsterdlu na 2 g/Utr.

Příklad 7

Subssrát: progesteron

Mikroorganismus: Ophlobolus herpotrichus

Beta-eyklodíntrit: úplná přeměna

Subssrát se přidává podle varianty 1

Výsledný produkt: 21-dihydroxyprogesteron

Reakce se provádí způsobem podle publikace Meyetre a daláí Hh1v. Chin. Acta 37. 1 548 (1954) při použití molárního poměru steroidu a cyklodextrinu 1:0,2· živným prostředím je pivovarský zákvas, v němi se pěstuje mikroorganismus 3 dny, pak se přidává acetonový roztok ' progesteronu jako substrátu ai do dosaženi koncentrace 0,25 g/litr. Bez použití сукШехХг!nu trvá přeměna dalSí 3 dny a zbytek substrátu je téměř 25 %. V případě, ie se 24 ai 30 hodin po začátku přeměny přidá cykloáextrin, je zbytek subbtrátu podstatně oíŽSÍ.

Příklad 8

Suussrát: 4-pregnen-17·lfa,21-dihyůrlχy·3,20-diln (Reichstein-S)

Mikroorganismus: Cuvvuaria lunata (IFO 49)

Beta-cyklldextrin: ovlivnění poměru reakčních produktů.

Přidáván;! substrátu? varianta i

H-awxí produkt: hydrokootison

Reakce se provádí způsobem podle publikace Rondo E. a Mtsugl T, J. Agic. Chem. Soc. Japan .35, 521 (1961). Pouuije se moHární poměr steroidu a 1:0,3. Bez přidání cyklodextrinu se v průběhu biologické přeměny získá 35 ai 40 % hmoo. 6-beta-hydrlχy 4-pregnen-17aafa, 21-diiydrlχy-3,20-dionu, 15 ai 20 % hmot. 11 alfa-lydroxy-4-pregnen-17alfa,21-dily^rdrlxy-3,20-dionu a přibliině 5 % hmoo. 7,14alfa-dihydroxy- a 15 % hmoo. 6-beta-14alfa-diУ/droзy—4-pregnen-17alfa^’21-diiydroχy-3,20-dilnu. V případě, ie se v hodině 0 biologické přeměny přidá ke smmsi beta-cyOlldextrinuve svrchu uvedeném pnimru, je možno z^ěSt imožitví 11 alfa-iydroχy4-pregaen-177afa,21-diiydroχy3,20-dionu (epi-iydrl0ortiзlnu) na dvojnásobek.

Příklad 9

Substrát: 76alfa-eetyl-4-pregnen-17alfa,21-diiydroχy-3,20-dion

Mikroorganismus: Curvu^ia lunata (ATCC 12 017)

Beta-cyklodeetrin: zvýěení efektivnosti přeměny

Přidávání substrátu: varianta 1

Výsledný produkt: 11beta,17alfa,21-trihyrltyi6alfa-meryl-4-pregoeo-3,20-dilo (l6alfa- mey^a^^^^)

Reakce se provádí způsobem podle publikace Canonica L. a dalSí Oass. Chia. Ital. 93. 368 (1963). Použije se ^c^olá^i^zí poměr steroidu a cyklodextrinu 1:1. Bez poulit! cyklodextrinu vzniká hlavní výsledný produkt v иоШу! přibliině 55 % . hmoo. V případě, ie se v hodině 0 biologické přeměny přidá k reakční směji beta-cykl^e/trin ve svrchu uvedeném poměru, stoupne mmnoisví hlavního výsledného produktu o 5 ai 10%.

Příklad 10

Substrát: 3tota,17alfa,21-trlhydro3ypragn-5-®n-20-on-21-acatát

MLkrojorganiaaus: Flavobacteriua dtlydrogtnant (ATCC 13 930)

Bta-cyldodettrin: zvýšení koncentrace

Přidávání ^Ьь^г^^: varianta 1

Výsledný produkt: 4-prtgnen-11alfa,21-dilydroχУ3_l20-dion

Reakce at provádí podle US patentu í. 3 009 936. MoOární poměr tttroidb a cylk.odeetrinu je 1:0,3· Při poožiií cyklodextrinu je možno získat dvojnásobek výsledného produktu.

Příklad 11

Subbsrát: balato sid-A (digitaisoový glukosid)

Mikroorganismus: Streptomyces purpurascens

Beta-cylk.odettrin: zvýšení koncentrace

Přidávání substrátu: varianta 1.

Reakce se provádí podle maďarského patentu S. 176 250. Poobije se lanatosid-A a cyklodextrin v mooárním poměru 1:1. Bez použití cylk-odextrinu se přidává k dvoudenní kultuře Streptomyces purpurascens roztok lanatutldb-A v organickém rozpouštědle v koncentraci 0,5 g/litr. V případě, že se po dvou dnech kultivace přidá k reakční směsi v hodině 0 biologické přeměny beta-cyklodextrin ve svrchu uvedeném poměru, je možno z výšt konccntraci ^hbi^tu na 2 glitr. ’

Příklad 12

Subesrát: Hylrokoutitut.

Mkroorganimus: Ap^obacte? simplex (ATTC 6 946).

Směs оуМ^елХг!!!: zvýšení rychlost.

Přidávání ^Ьв^гё^: varianta 2.

Mikrobiologická přeměna se provádí obdobným způsobem jako v příkladu 5 s tím rozdílem, že se místo beta-cykludtxtritb pobije sněsi OLfa-, beta- a gai^^cck^^is^^^ v poměru 6:75:19. Minožsví a kvaita výsledného produktu stejně jako reakění rychlost byly stejné jako v příkladu 5.

Claims

1. Způsob zintenzivnění mikrobiologické přeměny steroidů s použitím vyznačující se tím, že se mikrobiologická přeměna provádí za přítomnosti nebo gama-cyklodextrinu nebo za přítomnosti libovolné směsi těchto látek 0,2 až 3 moly ne 1 mol steroidního substrátu a po skončení přeměny se cyklodextrin popřípadě ze systému regeneruje a vrací zpět k mikrobiologické přeměně.

pomocných látek, alfa-, beta-, v množství

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se cyklodextrin přivádí do systému před počátkem mikrobiologické přeměny, při jejím začátku nebo v jejím orůběhu

3.

přivádí

Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se do systému pro mikrobiologickou přeměnu tím, před že se odpovídající cyklodextrin přidáním substrátu.

tím, je inkluzního komplexu substrátu s cyklodextrinern, s inkluzního komplexu substrátu

4.

Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se že se k mikrobiologické přeměně použivýhodou roztoku nebo suspenze s oyklodextrinem.

5.

systému

Způsob podle bodu po ukončení 35 až

2, vyznačující se tím, mikrobiologické přeměny že se cyklodextrin přivádí do

2, vyznačující se tím, že se komplex cyklodextrinu se steroidním substrátem nebo roztok přívodem do prostředí pro mikrobiologickou přeměnu.

Způsob podle bodu cyklodextrin těphto látek nebo inkluzní sterilizuje před

7. Způsob podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že se cyklodextrin, přidaný do prostředí pro mikrobiologickou přeměnu sterilizuje spolu s tímto prostředím.

8. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se steroid extrahuje z vodného prostředí pro mikrobiologickou přeměnu organickým rozpouštědlem a cyklodextrin se vysráží přidáním rozpouštědla, snižujícího jeho rozpustnost, s výhodou hexanu, načež se z rafinátu izoluje filtrací a po případném sušení se vrací zpět k mikrobiologické přeměně.