JPS5867194A - ステロイドの微生物学的変換の増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシクロデキストリン添加剤を用いて、ステロイ
ドの微生物学的変換の増強方法に関する。

ステロイド化合物の合成に於いて、幾つかの合成工程が
しばしば微生物を用いて行われる。微生物細胞、それか
ら抽出した酵素又は固定化細胞又は酵素を用いた微生物
学的変換が水性媒体中で行なわれていた。このことは酵
素反応の速度を加速するけれども、同時にステロイドの
水に対する溶解性が悪いので欠点である。水に著しく不
溶であるステロイドの数は多く従りて、それ等の微生物
学的変換は水性媒体中では経済的に行うことは出来ない
。

公知の方法に於いては、基質及び生成物ステロイドの一
部は一般に反応中で固体状態である。このような場合に
於いて、反応速度は基質の溶解性に依って決定されそし
てもしも粒形が不均質であるならば、即ち平均粒形が反
応の過程に於いて除徐に増加するならば、速度は連続的
に減少する。

このような問題及び同様の問題が原因で、反応はしばし
ば所望の転換率に到る前に終了する。

業界に於いてはステロイド基質の水溶解性を改善する為
に又はそれ等の溶解速度を加速する為に多くの方法が知
られている。英国特許１２１１３５６に依れば、変換に
委ねられるステロイドは、均質な粒土分布及び小さな平
均粒形を確保する為にあらかじめ機械的に分散せられる
。

米国特許４１２４６０７に依れば、微粉細基質が、ステ
ロイドの有機溶液を水に乳化することに依り続いて引き
続き有機溶剤を蒸発することに依る分離した工程に於い
て得られる。他の研究者はステロイドを有機溶剤に溶解
することを提案しており、又有機溶液を微生物学的変換
の水性媒体中に添加することを提案し、ここに於いて基
質は微粉細した形で沈殿する。

ハンガリー特許１４９６７８に依れば、基質を導入する
為に用いられる有機溶剤（例えば、ピリジン、酢酸）は
、微生物学的変換に委ねる前に中性化せられる。アルコ
ール類の場合にけ、アルカリ土類金属塩化物を添加する
ことに依り溶解性を増大させる。

米国特許１０８３２０４に依れば、水性媒体中に於ける
基質の溶解性は、有機溶剤、特にジメチルスルホキシド
に依り増大する。有機補助溶剤が基質の添加と同時に又
はそれに引き続き添加され得る。別に、得られるエマル
シ嘗ンの高界面が速やかな物質移動を確保する場合、基
質の水溶解性は水と混和しない溶剤に依り増加され得る
［Ｂ１ｏｔ＠ｃｈｎ、Ｂｉｏｓｎｇ、２１．３９（１９
７９）］。可溶化溶剤はしばしば製薬産業に於いて用い
られる。例えば、４−ブレステン−３−オンカラのアン
ドロステン−ジオンの製造に於けるドイツ特許１５４３
４３］に依れば、収率は安定化剤を用いることに依り相
当に増加された。

公知の方法は、基質の水溶解性が悪いことによる欠点を
減少しているけれど本、それ等はシステムに対する他の
不利な効果を有するが、又は非経済的で為る。例えばも
し本基質が微結晶質の形態で得られるならば、これは福
の操作を必要としそして原料の損失を招く。更に次の事
実が観察されている・即ちステロイドの溶解性を充分に
増加する為に必要な量の有機溶剤は、微生物に有害であ
る（：５ｔｓｒｏ１４ｓ、１２．５２５’（１９６８）
）。可溶化剤は一般に発泡を加速し、この発泡は微生物
学的システムのエアレージ、ンを困難なものにする。

本発明ぽステロイドの微生物学的変換が、有効に増強さ
れ一方で従来技術の欠点を解消出来るか若しくは少くと
も減少する方法を提供する。

本発明者等は驚くべきことに次の事実を見い出した。即
ち、ステロイド分子の水溶解性を増加する為、固体残留
分の場合には溶解速度を増加する為、反応の進展を妨げ
る「生産抑制」を避ける為及びある場合には副反応を抑
制する為に、微生物学的変換系に於いてシクロデキスト
リンが成功裡に用いることが出来る、ということである
。加えて、α−及びβ−シクロデキストリン及び所望の
これ等の混合物はエステル加水分解に灯し触媒的作用を
有する。もしも微生物が二種若しくはそれ以上の機能を
有するならば、選択的作用が、反応生成物の割合に影響
を与える為に好都合に用いることが出来る。

本明細書及び特許請求の範囲の全体に亘って用いられて
いる語句「増強」は、上に述べた複合体の効果を意味す
るものとする。

本発明に依れば、ステロイド基質はα−１β−１若しく
はγ−シクロデキストリン又はこれ等の所望の混合物の
存在下に於いて微生物と反応しそして所望に依り反応終
了後、シクロデキストリンを系から分離する。以下に於
いて、特に言及しない限り、語句［シクロデキストリン
」は、α−１β−若しくはγ−シクロデキストリン又は
これ等の所望の混合物を武味するものとする。

シフロブキス）　ＩＪンは、微生物の反応の前に微生物
反応の出発若しくは任意の工程で、基質１モルに対しシ
クロデキストリン０．２〜３モル量を添加することが出
来る。

本発明の好ましい態様に依れば、シクロデキストリンは
基質を添加する前に微生物学的変換の媒体に添加される
。

又は別に、シクロデキストリンは基質と反応しそして得
られた包接複合体又はそれ等の水性溶液若しくは懸濁液
が微生物学的変換媒体に添加され得る。

別の態様に依れば、シクロデキストリンは反応のある段
階で、好ましくは３０〜５０チの変換後、そのままステ
ロイド基質との包接複合体の形で又はそれ等の水溶液若
しくは懸濁液の形で添加される。所望に依り、シクロデ
キストリン若しくはシクロデキストリン−基質包接複合
体の溶液は、微生物学的変換の媒体に添加される前に殺
菌されるか、又は微生物学的変換の媒体と共に殺菌は行
われ得る。

シクロデキストリンは、有機溶剤を用いてステロイドか
ら抽出することに依り次いで引き続きその溶解性を有効
に減少させる溶剤を用いることに依りラフィネートから
シクロデキストリンを沈殿させることに依って、彼生物
学的変換の水性媒体かＧ回収され得る。次いでシクロデ
キスト−リンを濾過することに依り単離し次いで所望に
依り乾燥する。

ステロイドの微生物学的変換の増強は基本的に重要であ
る。何故ならば反応速度が増加した結果、変換に要する
時間は減少し、基質の濃度は媒体中で増加し、生成物抑
制が避けられそして所望の反応が選択的に触媒化され得
るからであり、即ち微生物学的選択が増加するからであ
る。

シクロデキストリンとステロイド基質との包接複合体は
、更に別の方法で製造出来る。第一の変形に依れば、適
当なシクロデキストリン濃度を有する所望のシクロデキ
ストリンの水溶液が、微生物学的変換に対する媒体とし
て使用され、そして基質ステロイドがこの溶液に添加さ
れ、ここに於いて包接複合体が平衡状態に対応して形成
される（変形１）。

別に、基質−７クロデキス）　ＩＪン包接複合体の水溶
液が別にｖ１４ｇされそして引き続き濾過に依る殺菌後
微生物学的変換の媒体に添加される（変形少量の水の存
在下で、シクロデキストリンとステロイドの混合物が、
再結晶されステロイド−シクロデキストリン複合体を与
え。これは殺菌が必要とされない微生物学的変換に対し
て固体として添加され得る（変形３）。

シクロデキストリン若、α−１，４−グルコース単位を
形成する６、７又は８グルコビラノースから成る環状分
子である。構造的にはシクロデキストリンは水酸基の特
別な配列に依って特徴づけられる。

全ての水酸基はリングの一方端に位置し、−１全ての第
一級水酸基はリングの他方端に位置する。

従ってリングの外側表面は本質的に親水性であり、これ
はシクロデキストリンが水溶性であることを保障する。

一方、リングの内側表面は疎水性である。何故ならば分
子のその部分に於いて水素原子とグルコシドの酸′素橋
のみが見い出されるからである。従って、シクロデキス
トリンの内側空洞部に分子を侵入せしめることの出来る
形状及び大きさを有する分子が、シクロデキストリンと
包接複春ｆｋ−ｇＰ刑ｆナス− ６個のグルコピラノウス単位から成るリングはα−シク
ロデキストリンと呼ばれ、７個単位から成るリングはβ
−シクロデキストリンと呼ばれそして８個のグルコピラ
ノウス単位から成るリングはｒ−シクロデキストリンと
呼ばれる。シクロデキストリンは、同じく時としてシフ
四アミロースと呼ばれる。

シクロデキストリンと種々の薬理活性を有するステロイ
ド化合物との複合体が、Ｌ＠ｅｈ及びＰｍｕｌｉＫ依っ
て試験された（Ｊ、Ｐｈａｒｍ、５ｅｉ−５５゜３２／
１９６６１）テストステロン及びコルチゾンアセテート
の複合体に対して、可能な化学量論的割合が決定された
。実験に依り、活性物質の吸着は可溶化を経由して影響
を受けることが分った。然し乍らステロイド基質の微生
物変換の増強に関してこれまで開示も示唆も存在しない
。

本発明者等は、シクロデキストリンとステロイド基質の
複合体が水性媒体中で直ちに解離しそして微生物学的変
換系に於いて複合体は遊離のステロイドとシクロデキス
トリン分子との動的平衡状態にあることを見い出した。

個体懸濁ステロイドを含有する微生物学的変換系に於い
て、解離したステロイド、即ち酵素に対し有効なステロ
イドの実際の濃度は、酵素反応及び基質の解離速度に依
存する。もしも基質の解離がより遅いプロセスであるな
らば、溶液中のステロイドの濃度は、飽和値よりも相当
に低いま壕であり、従って酵素反応の速度は相当に低下
するであろう。水溶液中に於けるシクロデキストリン包
接複合体からの基質の分離はこのような環境の元で速や
かに起るので、溶解した基質の濃度は全プロセス中飽和
値であり、従って酵素反応の最大速度が達成できる。

他の場合に於いて、酵素反応の生成は低下するか又は出
発ステロイド化合物の変換を完全に停止する。何故なら
ばそれが基質又は酵素の表面に付着するからである。こ
の効果は一般に「最終生成物抑制」と呼ばれている。シ
クロデキストリンと基質及びシクロデキストリンと最終
生成物ステロイドとのそれぞれの複合体は基質と最終生
成物との間に於ける構造上の際に依り、異なった安定性
を有する。適貫に選択された反応条件の元で、最終生成
物抑制の原因であるステロイド最終生成物は基質への接
近が減少されることなく比較的安定なシクロデキストリ
ン複合体に変換され得る。基質が最終生成物よりも依り
安定なシクロデキストリン七の複合体を形成する場合、
最終生成物抑制は、反応の一定段階で系にのみシクロデ
キストリンを添加することに依り避けることが出来、こ
の場合最終生成物の過剰量が反応媒体で既に検出出来る
。

更に実験を重ね、エステル化ステロイド分子ノ酵素加水
分解は相当するα−及び／又はβ−シクロデキストリン
複合体を調製することに依シ加速され得ることが分った
。これはおそらくシフロブキス）　ＩＪン分子の触媒作
用に最も帰因する為である。

種々の微生物学的変換系で、シフロブキス）　ＩＪ／複
合体の形成は他の用途にも又利用出来ることが判明した
。かくして例えば与えられたステロイド化合物の充分に
安定な１合体を形成することにより、与えられた異性体
の形成速度が減少され得るか又は構造異性体の形成が完
全に避けることが出来る◎何故ならば与えられた出発分
子の接近が減少するからである。

上記の結果は、ステラン構造を有する所望化合物のシク
ロデキストリン複合体に依り達成出来る。

本発明に係るプロセスは、エステラン、アントロスタン
、プレグナン、コレスタン又はスチグマスタン骨格を有
する化合物に関連して次の実施例に依９説明されるが本
発明はこれ等の化合物に対して適用されるものに限定す
るものでは無い。以下の実施例に於いて、特に言及しな
い限りノ９−セントは重量単位である。

来車１」 基質：ヒドロコルチゾン ａ生物：アルスロパクターシンデレックス（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｓｒ　ｇｉｍｐｌ＠ｘＸＡＴｃｃ６９４６）
α−シクロデキストリン：反応の促進 基質の導入：変形１ アルスロバクタニシンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）
の寒天培地を生理食塩水で洗浄することに依り、懸濁液
を試製する。懸濁液５＊／を、次の組成の培地に注入す
る。グルコース０．３１酵素的に加水分解したカゼイン
Ｏ，ＳＳ、酵母抽出物０．１’Ｚ。

ｐｌ（＝６．７゜次いで培地を１００ゴまでＫし、次い
テ５００　ｍｌのエルレンマイヤースラスコ中テ殺菌す
る。培養は、ストローク数２３０を有する振盪機を用い
３２℃で１８時間継続し、然る後メタノール０．５　ｊ
ｌｔ　Ｋ溶解したヒドロコルチゾン５ＩＩｉ９の溶液を
添加することに依り、必要な酵素を誘導する。

誘導は、培養と同じ条件の元で３時間行われる。

ゾルター−１−デヒドロダナーゼ酵素を含有するプイヨ
７培地５０ｍ１を、滅菌水９５０１１Ｌｔを有する３１
のエルレンマイヤーフラスコに添加し、次いで得られた
２０倍希釈の活性培養菌を用いて賛生物学的変換を行う
。基質としてヒドロコルチゾン２ｇを次の方法で冷加す
る： 培養物にα−７クロデキストリン２０！ｉを添加する。

ヒドロコルチゾンを、Ｃ畠Ｃ／２３０重量係を含有する
メタノール２０ｍｔにヒドロコルチゾンを浴解し、次い
で得られだ溶絨をα−シクロデキストリンを含有する培
養物に添加する。微生物学的変換は、上記機械を用い振
盪させ乍ら３２℃で５時間行う。α−シクロデキストリ
ンの存在は、水性媒体中の基質の沈殿を抑制し、且つ溶
解した基質の変換は酵素の活性に依り決定される・換言
すれば、反応速にはシフロブキス）　ＩＪンが存在しな
い場合よりもより高くこの場合所望の変換を得る為に約
８時間が必要される。

反応の終了時に１発酵媒体は、プレドニゾロン１９２０
μＩ／ｋｌ、　２０β−ヒドロキシイープレドニゾロン
４０μ９．ＡＩ及びヒドロコルチゾン８μ〜値ヲ含有す
る。

実施例２ 微生物：アルスロパ２ターシンプレックス（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｓｌｍｐｌｅｘ）（ＡＴＣＣ６９４６
）β−シクロデキストリン；最終生成物抑制の除去 基質の導入：変形１ 実施例１で説明した如く調製し且つ誘導した培養物を、
Ｍ°初の容積の５倍に希釈しそしてメタノール１０ｄに
溶解した１７α−メチル−テストステロン１．ＯＩＩの
溶液を添加する。１７α−メチル−テストステロンのゾ
ルター−１−脱水素を開始する。

反応過程は薄層クロマトグラフィーに依り監視する。基
質は媒体中で沈殿しそして脱水素は、基質が徐々に溶解
するのと平衡して起る。ゾルター−１−メチル−テスト
ステロン約４００μＩ／１が検出されたら、β−シクロ
デキストリンを系に添加する。生成物はシクロデキスト
、リンと包接複合体を形成し、そしてこのようＫして反
応の終了の除虫じる「生成物抑制」作用が避けられる。

最終生成物のシクロデキストリン複合体の安定性は、基
質のシクロデキストリン複合体の安定性の約５倍である
。添加は変換の２時間以内で行われそして薄層クロマト
グラフィーに依りインキ、ページ。

ンを６時間以内に終了すべきである。

変換終了時に於いては、培養基はゾルター−１−メチル
−テストステロン９７０μｇ／ｌｎｌ及びメチル−テス
トステロン６μｆ／／ｍｌを含有する。

シフロブキス）　ＩＪンが存在しない場合反応は培地カ
メチル−テストステロン基質的１００〜１２０μｌ／／
ｒｌを含有する時点で終了する。

実施例３ α−シクロデキストリン；濃度の増加 基質の導入：変形３ ７５０＋／のエルシンマイヤーフラスコ中の培地２００
ｉ／に、フラゲパクテリウムリュウコロラタム（ＮＣＩ
Ｂ　　９３２４辺斜面寒天培地を注入する。

培養は、ストローク数２３０を有する振盪機上で３０℃
で２０時間行い、然る後同じ組成を有する滅菌培地５１
を培養物と共に実験用・母−メンタ−に注入する。培地
は次の組成を有している：酵母抽出物１，０９６．燐酸
二水素カリウム０．１％、燐酸水素二カリウム０４壬。

注入後、ジメチルホルムアミド１．５　ｍｌに溶解した
基質２５０ダの溶液を、濾過滅菌後培地に添加する。基
質の存在に依り、培養菌の増植中必要な酵素の形成が確
保される。

１２時間培誓阪、バクテリヤの数及び酵素活性は微生物
変換を行うのに充分であ抄、従りて５−プレグネン−３
β、１７α、２１−）ジヒドロキシー−２０−オン−２
１−アセテート１００１１を、シクロデキストリンに依
る予備処理後培養物に添加する。

予備処理は次のようにして行われる： 基質１００．９を、γ−シクロデキシトリｙ　１ｒｉｌ
量及び水２００ｍ／！を用いて２０分間均質にし、シフ
ロブキシ）　ＩＪンと基質との急速な溶解性複合体を形
成する。得られた懸濁液を、フチ−メンタ−に添加し、
次いで基質の全量が消費されるまでインキュペションを
継続する（約１１時間）。インキ）ベージ、ンは、４２
０ｒｐｍで攪拌し乍ら且つｏ、５１／ｌ／分の速度でエ
アレージ、ンし乍ら行う。反応の経過は薄層りシマトゲ
ラフイーで監視する。

反応の終了時に於いて、培養液は、アイヒスティア（ｅ
％ｃｈｓｔｅｉｎ）−８化合物（４−プレグネムー１７
α。

２１−ジヒドロキジー−３，２０−ジオン９０２０μｇ
汐ｌ及び基質３０μｍ１／ｌｎｌを含有する。シクロデ
キストリンが存在しない場合には、基質１０１１／ｌが
所望の結果を得る為には必要とされるであろう。

実施例４ β−シクロデキストリン：外的加水分解の触媒化基質の
導入：変形１ ５０（１／のエルレンマイヤーフラスコ内テ、カルパラ
リア　プラサディー（ＩＭＩ　７１４７５）の斜面寒天
培地から洗浄された胞子の懸濁液を、培地１００１Ｒ１
に注入する。培地は次の組成を有する：大豆粉１，０９
６、とうもろこし浸漬液０．３チ、とうもろこし澱粉０
．３％、麦芽エキス０．５チ、−＝６．２゜培養は２６
−℃で２４時間行い、然る徒麦芽エキス無しで調製した
培地１００ｍ／でしかし上聞した同じ＃ｑ成を有する培
地を５００ｍ／のエルシンマイヤーフラスコ中で得られ
た培養物１０ｇ＋／を注入する。培養物を２６℃で振盪
しそしてメタノール３づに溶解した４−プレグネン−１
７α、２１−ヒドロキシー−３，２０−ジオン−１７−
アセテート基質０．１２ｇを、壕だ繁殖している１６時
間培養物に添加する。更に培養する間に、基質は１１β
−位でヒドロキシル化されヒドロコルチゾ／−１７−ア
セテートを与える。薄層クロマトグラフィーに依れば、
２０時間の変換で培養物は未反応の基質１０％を含有す
る。この段階でβ−シクロデキストリン０．９６！ｊを
形に加える。シクロデキストリンはステロイド分子のア
セチル基の酵素加水分解に対し触媒的作用を有する。従
ってヒドロキシル化、これは原則されるであろうがそれ
に加えて微生物学的変換の連続した段階に於いて、アセ
チル基が分離する。約３時間後反応は終了する。

変換終了時には、発酵媒体は、ヒドロコルチゾン（４−
プレグネン−１１β、１７α、２１−）ジヒドロキシー
−３，２０−ゾオン’）０．７３０μｉ／ｍｌ、ヒドロ
コルチゾン−１７−アセテート０．１８５　ｐｇ　／ｍ
ｌ。

ライヒスティン（ＲｅＳｃｈｓｔｅｉｎ）−８−１７−
アセテ−）０．００５μｆ１７ｆｎｌ叉びライヒスティ
ン−８化合物００４０μｐ／ｌｎｌを含有する。

実施例５ 基質：ヒドロコルチゾン ａ生物：アルスロパクターシングレックス（Ａｒｔｈｒ
ｏｈａｅ’ｔｅｒ　ｓｌｍｐｌｅｘ）（ＡＴＣＣ６９４
６）β−シクロデキストリン；反応促進 基質の導入：変形２ 固形培地上で増殖したアルスロパクターシ／ｆレックス
の培養物を洗浄して得られた懸濁液３０ｍ１を実験室用
ファーメンテーシ、ン内の滅菌した培地５１に注入する
。培地は次の組成を有するニゲルコース０３チ、ペプト
ン０３チ、酵母エキス０．１９６、ｄｉ＝６．８゜培養
は２４　Ｏｒｐｍで攪拌し乍ら０．５１／ｌ／分でエア
レージ、ンし、３５℃で２０時間行う。培養物１１に依
り、殺菌培地９１が実験室用７アーメンター内に注入さ
れる。後者の培地は次の組成を有するニゲルコース０５
優、イブトン０５チ、ｇ母エキス０．４チ、ｐｌ（＝６
．８゜培養は、６００　ｒｐｍで攪拌し且つ０．３１！
／ｌ／分でエアレーゾヨンし乍ら３５℃で１８時間行わ
れる。然る後メタノール５０１に溶解したヒドロコルチ
ゾン０．５９の溶液を添加し酵母形成を酵発する。４時
間培養した彼、活性培養物を耐酸性の装置に２．−人し
、この装置に於いては微生物学的変換の媒体があらかじ
め設けられている。

媒体：装置内に水道水９０１及びβ−シクロデキシトリ
ン１２００．９を添加し、装置を１００℃までに加熱し
次いで培地を該温度で２０分滅菌し、然る後３５℃に冷
却する。２−メチル−１，４−ナフトキノン１．０．？
及びヒドロコルチゾン４００．９を、ＣａＣｌ２４００
１を含有するメタノール４１に溶解する。溶液を濾過滅
菌し、次いでそれを装置に装入する。添力１１と同時に
微生物学的変換が始まる。

変換中に於いて・′４°実際は全量のステロイド基質が
溶解され、従って生成物が沈澱する際混合した結晶が形
成する危険はない。

微生物学的変換媒体は、１８０　ｒｐｍで攪拌し乍ら且
つ０６１／ｌ／分でエアレージ、ンし乍ら３５℃でイン
キュページ、ンされる。反応の経過は薄ｒ−クロマトグ
ラフィ〜に依り監視されそして反応は基質の濃度は２０
重量％になるやいなや終了する０次いで発酵媒体を酢酸
エチルで二回対流せしめ乍ら抽出する。抽出物を４０℃
までの温度で減圧下で濃度ｓｏ／ｌ（１＆初の濃度の約
５０１）までに濃縮し、活性炭４０Ｉ及びセライ）１０
０．９の混合物を用いて脱色し次いで結晶化が生起する
まで蒸発を続ける（約２６’）。懸濁液を５〜１０℃壕
で冷−却し、次いで数時間放置した後濾過する。母液ヲ
、・クメンぼロペルエーテルの５倍量で処理し、冷却し
次いで沈澱した生成物を炉別する。

次の特性を有する生成物を３７５１を得る：純度　　　
　　　　　　　　９８　　重量％乾燥損失　　　　　　
　　　１　　重Ｊｔ＃チ硫酸塩灰　　　　　　　　０．
１　　重ｔチヒドロコルチゾン残留物　　　　１．２　
　ｉｔ％他のステロイド　　　　　　０．３５重量係融
点　　　　　　　２３４〜２３６℃ 〔α〕２０−＋（＋８°（ノオキサン、　ｃ＝ｌ　）β
−ンクＣ−１−＞−キストリンを回収する為に、シクロ
エキサン１１と川に１８〜２０℃で１時間抽出物を攪拌
する。得られた沈旅物を炉別し約】ｔの水に懸濁上せ、
コンζいでシクロエキサンを、煮沸し乍ら水蒸気蒸留Ｉ
、ｔ（（〜り除去する。水性β−シクロデキストリノ啼
ｆ創液を一昼夜５〜１０℃で放１ｉｊ’　Ｌ、結晶を炉
別しそＩ、て真空乾燥する。約７ｏｏｙのβ−シクロデ
キストリンを回収し、これは別の操作に使用することが
出来る。

実施例６〜１１ 以下の微生物学的変換を先の実施例で記載した手順に従
って、みえられた反応の条件の元反応を増強させる為に
７クロデキストリンを用いて行う。

実施例６ に賀ニーシトステリン β−シクロ：″キストリン：濃度の増加基質の導入：変
形１ 基質の側鎖は、Ｍａｒｓｃｈｅｃｋ、Ｗ、　Ｊ　、Ｋｒ
ａｙｃｈｉ及びＭｕｉｒ　Ｒ，ＤＪＣ従りて分解式れる
（　（］　９７２　）Ａｐａｌ　。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２３．７２　’　ｏシクロデキス
トリンに対するステロイドのモル比は１対０．２でちる
。培地は、０．５チのＮ３□）ＩＰＯ，，７Ｈ２０，を
含有する。シクロデキストリンの存在下で、シトマチリ
ン濃度／ｄ２１！／ｌ普で増加出来、一方シクロデキス
トリンが存在しない場合は僅かにＩ　Ｅｌ／ｌの濃度が
得られるだけである（変換時間二両方の場合に於いて１
７０時間）。

実施例７ 基質：デログステロン β−シクロデキストリン：変換の完了 基質の導入：変形１ 最終生成物：２１−ジヒドロキジー−プロｒステロンプ
ロセスを、ｈ！ｅｙｓｔｒｅ等の方法に従って行う（）
ｌｅｌｙ、Ｃｈｌｍ、Ａｃｔａ３７．１５４８（１９５
４））。シクロデキストＩＪ　ｙに対−ｔ−るステロイ
ドのモル比は１対０．２である。微生物を、ビールマツ
シー培地上で３日間培饗シ、然る後デロダステロン基質
のア七トン溶液を発酵液の濃度０．２５１／ｌに成るま
で、添加する。−シフロブキストリ／を用い逢い場合微
生物学的変換Ｆｉ、３日以ヒ続きそして基質残留物の量
は約２５％である。微生物学的変換を行う約２４〜３０
時ｔＳｆｉ前に、β−シクロデキストリンを反応混合物
に添加するならば、基質残留物の量は相当に減少する。

実施例８ β−シクロデキストリン；反応生成物の割合の影響基質
の導入：変形１ 主生成物：ヒドロコルチゾン 反応を、Ｋ　ｏ　ｎ　ｄ　ｏ　＋　Ｅ−及びＭｉｔｓｕ
ｇｌ、Ｔ’の方法に従って行う（Ｊ４ｇｒｅ、Ｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、Ｊａｐａｎ　３５＋５２１（１（１１））。

シクロデキストリンに対するステロイドのモル比は１対
０３である。シクロデキストリンを用いない場合変換の
結果として、６β−ヒドロキシーーライヒシ、ナイン（
Ｒ＠１ｅｈｓｔｅｉｎ）−８３５〜４０重１％、１４α
−ヒドロキシー−ライ上シュティン−８１５〜２０重ｉ
ｌｌ、１１α−ヒドロキ２シーーライヒシュテインー８
３〜５重量係及び７．１４α−ジヒドロキシー−約５重
量％及び６β。

１４α−ジヒドロキシ−−ライ上シュティン−８５重量
％を得る。もしも微生物学的変換の出発時にβ−シクロ
デキストリンを上記割合で混合物に添加するならば、１
１α−ヒドロキシーーライヒシュテインーＳ（エビ−ヒ
ドロコルチゾン）の割合は上記量の約２倍に増加され得
る。

実施例９ 基質；１６α−メチルーライヒシ、ティンー６β−シク
ロデキストリン；変換率の増加基質・の導入：変形１ 反応は、Ｃａｎｏｎｉｃａ、Ｌ、等の方法に従って行う
（Ｇｍｍｓ、Ｃｈ％ｍ、Ｔｔａｌ　、９３，３６８（１
９６３））−シクロデキストリンに対するステロイドの
モル比の割合は１対１である。シクロデキストリンが存
在しない場合、初期の最終生成物は約５５重量％で得ら
れる。もしも微生物学的変換の出発時にβ−シクロデキ
ストリンが上記割合で混合物に添加されるならば、反応
混合物に於ける最終生成物の割合は、約５〜１０チ増加
する。

実施例１０ β−シクロデキストリン：濃度の増加 基質の導入：変形１ 最終生成物：ライヒクユテインー６ 反応を米国特許３００９９３６に従って実質的に行う。

シクロデキストリンに対するステロイドのモル比は１対
０３である。シクロデキストリンを用いる場合濃度はシ
クロデキストリンを用いないで得られた量の２倍に増加
よしめることが出来る。

実施例１１ 基質ニラナトシト−Ａ（ジヒタリス　グルコシド）β−
シクロデキストリン：濃度の増加 基質の導入：変形】 反応をハンガリー特許１７６２５０に従りて行う。

シクロデキストリンに対するラナトシドーＡのモル比は
１対１である。比較の為シフロブキシ）　ＩＪンを用い
ないで、う→−トシドーｋｏ、５９／ｌを含有する有機
溶液をストレデトマイセスノ母ルビュラセンスの培地に
２日間添加する。もしも微生物の培養２日後に、微生物
学的変換の出発時にβ−シクロデキス）　ＩＪンを上記
割合で反応混合物に添加するならば、基質の濃＃、け２
．Ｏｌｉ／１１でに増加され得る。

特許出願人 リヒター　ｒデオン　ペゾエセティ 弁理士青木　朗 弁理士西舘和之 弁理士　内　１）幸　男 一７Ｔ３￥十　　山　　口　　昭　　２第１頁の続き ０発　明　者　ツサ・ビダ ハンガリー国ブダペスト２プス タセリ・ウツツア５４　　ニー ０発　明　者−ヨセフ・セイトリ ハンガリー国フタヘスト２エア ドロディ・ニス・ウツツア３８− ０ ０発　明　者　アグネス・ステイドラーハンガリー国ブ
ダペスト１４ネプ スタディオン・ウツツア１８ ０発　明　者　イロナ・ハボン ハンガリー国ブダペスト７０す ・ウツツア３ ０発　明　者　マルタ・ハラス ハンガリー国ブダペスト１２モン ダ・ウッツア４ ■出　願　人　チノイン・ジョジセルーエス・ベジエセ
テイ・テルメケク・ジ ャーラ・アール・チー ハンガリー国ブダペスト４ト・ ウトカ１−５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　α−９β−もしくはｒ−シクロデキストリン又は
   これらの所望の混合物中で、ステロイド基質の微生物学
   的変換を行ない、次いで所望により反応終了後反応混合
   物からシクロデキストリンを回収することを含んでなる
   、ステロイドの微生物学的変換の増強方法。 ２、微生物学的反応の開始前又は開始時に、前記シクロ
   デキストリンを反応混合物に添加することを含んでなる
   、特許請求の範囲第１項記載の方法０ ３、前記基質１モルに対しシフロブキスリン０．２〜３
   モルを用いる、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
   方法。 ４、前記基質の添加前にシクロデキストリンを反応混合
   物に添加する、特許請求の範囲第１項から第３項までの
   いずれかに記載の方法。 ５゜反応混合物に、シクロデキストリンと前記基質との
   包接複合体を特徴する特許請求の範囲第１項から第３項
   までのいずれかに記載の方法。 ６、　シクロデキストリンと基質の包接複合体の溶液又
   は懸濁液を用いる、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、変換率３５〜５０チで反応混合物にシクロデキスト
   リンを特徴する特許請求の範囲第１項から第３項までの
   いずれかに記載の方法。 ８、微生物学的変換媒体に添加する前に、シクロデキス
   トリン、ステロイド基質との包接複合体を特徴する特許
   請求の範囲第１項から第３項までのいずれかに記載の方
   法。 ９、微生物学的変換媒体に添加されたシクロデキストリ
   ンを培地と共に殺菌する、特許請求の範囲第１項から第
   ３項までのいずれかに記載の方法０１０、有機溶剤を用
   いて、ステロイドを水性の微生物学的変換媒体から抽出
   し次いでその溶解性を有効に減少させる溶剤、好ましく
   はへキサンを添加することによりラフィネートからシク
   ロデキストリノを沈殿させ、引き続き濾過し次いで乾燥
   する、特許請求の範囲ｖｇ１項記載の方法。