HU190784B

HU190784B - Process for the intensification of the microbiological transformation of steroid compounds

Info

Publication number: HU190784B
Application number: HU812785A
Authority: HU
Inventors: Nagy Istvanne Udvardy; Istvan Bertho; Gabor Hantos; Maria Trinn; Zsuzsanna Vida; Jozsef Szejtli; Istvanne Sadler; Ilona Hablon; Akosne Balazs
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt,Hu; Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszeti Termekek Gyara Rt,Hu
Priority date: 1981-09-28
Filing date: 1981-09-28
Publication date: 1986-11-28
Also published as: IT8223453A0; FR2513656B1; ES516007A0; DK422182A; DE3235884C2; DE3235884A1; SE452777B; BE894501A; ES8400146A1; IT1157322B; GB2108965A; US4528271A; FR2513656A1; JPS5867194A; CS239932B2; CH656642A5; GB2108965B; ATA357182A; JPH047197B2; SE8205506L

Description

(57) KIVONAT

A találmány tárgya új eljárás androsztán-, pregnán-, kolesztán- illetőleg sztigmasztán-vázas vagy kardenolid-típusú szteroidok mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására, amelynek során a szteroid mikrobiológiai reakcióját a szteroidra számítva 1-10-szeres tömegű alfa-, béta- vagy gammaciklodesztrin jelenlétében folytatják le és kívánt esetben az átalakítás után a ciklodextrint visszanyerik. A találmány szerinti eljárásnak a mikrobiológiai átalakítást intenzifikáló hatása a reakciósebesség növelésében, az átalakítandó szteroid oldékonyságának növelésében, a terméknek a reakcióközegben való jelenléte miatti reakciógátlás kiküszöbölésében, az alkalmazható szteroid-koncentráció növelésében vagy a reakció szelektivitásának fokozásában nyilvánul meg.

190 784

A találmány tárgya eljárás szteroidok mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására ciklodextrin adalékanyag alkalmazásával.

Szteroidvegyületek előállítása során gyakran előfordul, hogy a többlépéses szintézis egyik lépését valamilyen mikroorganizmus specifikus funkciójának felhasználásával oldják meg. A mikroorganizmus-sejteket, az abból kivont enzimeket, esetleg a rögzített sejteket vagy a rögzített enzimeket felhasználó biokonverziós folyamatok vizes közegben mennek végbe. Ez biztosítja az enzimes reakció lezajlását, ugyanakkor a szerves oldószerben lefolytatott kémiai reakcióhoz képest hátrányos körülményt jelent a szteroidok rossz vízoldhatósága miatt. Számos szteroidvegyület vízoldhatósági értéke alacsony, vagyis alatta marad annak a koncentrációnak, amely mellett a biokonverziós folyamatok még gazdaságosan kivitelezhetŐk. Az ismert eljárásokban általában a szubsztrát illetve a termék szteroid bizonyos részaránya a reakció folyamán szilárd alakban van jelen. A szubsztrát beoldódása a szilárd fázisból ilyenkor a reakciósebességet meghatározó tényező lehet, heterogén szemcseméret esetén a beoldódás sebessége a be nem oldódott szemcsék átlagos méretének növekedésével egyre romlik. Előfordulhat, hogy beoldódási problémák miatt a reakció jóval a megkívánt átalakulási hatásfok elérése előtt leáll.

Több eljárás vált ismeretessé a szubsztrát-szteroid vízoldhatóságának vagy beoldódási sebességének növelésére. Az 1 211 356. számú angol szabadalmi leírás szerint egyenletes és apró szubsztrát biztosítására a reakcióba bevitt szteroidot előzetesen mechanikusan diszpergáljuk. A 4 124 607. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint a finom szemcseméretű szubsztrátot külön műveletben állítják elő, oly módon, hogy szerves oldószerben készült szteroidoldatot vízben emulgeálnak,majd az oldó közeget lepárolják. Több eljárásban a szteroidot szerves oldószerben feloldják, a biokonverziós folyamatba továbbítják, ahol közvetlenül történik meg a megfelelő kiválás. A 149 678. számú magyar szabadalom szerint ilyen esetben gondoskodnak arról, hogy a bevitt szerves oldószer a biokonverziós folyamatot ne zavarja.

Az 1 083 204. számú brit szabadalmi leírás szerint az átalakító közegben a szteroid szubsztrát oldhatósági értékét szerves oldószerrel, főként dimetilszulfoxiddal növelik, amelyet már a beadagolásnál vagy a beadagolás után alkalmaznak. Más megoldás szerint a szubsztrát szteroid vízoldhatóságának növelésére vízzel nem elegyedő oldószert alkalmaznak, ilyen esetben a képződő emulzió nagy határfelülete biztosítja a gyors anyagátadást (vő. Biotechn. Bioeng. 21. 39, 1979). A gyógyszeripari gyakorlatban gyakran használnak szolubilizáló szereket, amelyeket a 153 173. számú magyar szabadalmi leírás szerint a rendszerhez adagolnak.

Az ismert megoldások csökkentik ugyan a szteroid szubsztrátok gyenge vízoldhatósága miatti hátrányokat, ugyanakkor kedvezőtlen hatást gyakorolhatnak más formában a rendszerre, vagy gazdaságtalanok. Ha például a szubsztrátot mikrokristályos formában állítják elő, akkor ez a technológiai sorban többletműveletet jelent és anyagveszteségeket is okoz. A szteroidok vízoldhatóságát jelentősen növelő oldószer-koncentráció más megfigyelések szerint hosszabb idő alatt káros a mikroorganizmusra (Steroids, 12, 525, 1968). Szolubilizáló szerek alkalmazása esetén a gyakorlati tapasztalat szerint fokozódik a habzás, ez pedig a biokonverziós rendszer megfelelő levegőztetését megnehezíti.

A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása, amely egyrészt lehetővé teszi a fenti - technika állását képező - eljárások hátrányainak csökkentését, ugyanakkor biztosítja a szteroidok mikrobiológiai átalakításánál a reakció intenzifikálását.

Felismertük, hogy a ciklodextrinek előnyösen alkalmazhatók biokonverziós rendszerekben a szteroidmolekulák vízoldhatóságának növelésére, szilárd maradék esetében a beoldódási sebesség növelésére, ezzel a biokonverziós reakció sebességének lényeges emelésére, továbbá adott rendszerben a további reakciót akadályozó termékgátlás kiküszöbölésére, észter-hidrolízis esetében katalitikus hatás kifejtésére, bizonyos esetben a szteroidmolekula egyes térbeli csoportjainak fedésével adott reakciók visszaszorítására. Két vagy több funkcióval rendelkező mikroorganizmusok esetében a szelektív hatások előnyösen alkalmazhatók a reakciótermékek arányának befolyásolására.

A szteroidok mikrobiológiai átalakításánál a reakció intenzifikálására irányuló találmány szerinti eljárást oly módon végezzük, hogy a szteroid szubsztrátot alfa- vagy béta- vagy gamma-ciklodextrin jelenlétében reagáltatjuk, adott esetben pedig az átalakulás lezajlása után a ciklodextrint a rendszerből kinyerjük. A mikrobiológiai átalakítást megelőzően vagy annak kezdetekor vagy a mikrobiológiai reakció bizonyos szakaszában adagoljuk a szubsztrát tömegéhez képest 1-10-szeres tömegű ciklodextrint. Egyik foganatosítási mód szerint a megfelelő ciklodextrint a szubsztrát adagolása előtt adagoljuk a biokonverziós közegbe. Más foganatosítási mód szerint a szubsztráttal előre reagáltatjuk a ciklodextrint, és a kapott szubsztrát-zárvány komplexet, illetve ennek oldatát vagy szuszpenzióját adagoljuk a biokonverziós közeghez. További lehetséges foganatosítási mód szerint a mikrobiológiai reakció előrehaladása során, rendszerint 30-50% konverzió elérése után, adagoljuk a ciklodextrint önmagában, esetleg a ciklodextrin és a szubsztrát-zárvány komplexét, kívánt esetben a zárvány komplex oldatát vagy szuszpenzióját. A ciklodextrin vagy a ciklodextrin és a szubsztrát-zárvány komplex oldatát tetszés szerint a biokonverziós közegbe való adagolás előtt sterilezhetjük, illetve ezeket a biokonverziós közeggel együtt is sterilezhetjük. A ciklodextrin visszanyerése a vizes biokonverziós közegből oly módon végezhető, hogy miután a szteroidot szerves oldószerrel extraháltuk, a ciklodextrint valamely, annak oldékonyságát erősen csökkentő oldószer, előnyösen hexán hozzákeverésével kicsapjuk a visszamaradt közegből, majd szűréssel izoláljuk és a ciklodextrint kívánt esetben szárítjuk.

A szteroidok mikrobiológiai átalakítása során a reakció ilyen módon való intenzifikálása igen elő-21

190 784 nyös hatás, mivel ez a reakciósebesség növekedésében, az átalakítási idő csökkenésében nyilvánul meg, növelhető a szubsztrát koncentrációja a közegben, kiküszöbölhető a termékgátlás és a lehetséges reakciók közül a kívánt reakciót katalizálhatjuk, vagyis a mikrobiológiai reakció szelektivitását növelhetjük.

A ciklodextrín szteroid-szubsztrát zárványkomplexek előállítása több változat szerint végezhető. Egyik változat szerint a biokonverzió közege a kívánt ciklodextrín megfelelő %-os koncentrációjú vizes oldata, ehhez adagoljuk a szubsztrát szteroidot, amikor a zárványkomplex az egyensúlyi helyzetnek megfelelő mértékben képződik. Más megoldás szerint a szteroid rendszerbe adagolásának kiiktatására külön elkészítik adagolótartályban a szubsztrátciklodextrin zárványkomplex vizes oldatát, amelyet szűréssel sterilezve adagolunk a biokonverziós közeghez. Kis mennyiségű víz jelenlétében a tapasztalat szerint a szteroid és a ciklodextrín keveréke átkristályositható, szteroid-ciklodextrin komplex képződik, ami sterilezést nem igénylő biokonverziós folyamathoz szilárd formában adagolható.

A ciklodextrinek természetes eredetű glukózpolimerek és az egyes ciklodextrín típusok 6, 7 illetve 8 glukózegységből felépülő zárt makrogyűrűk. A kötésjellegnek megfelelően nevezik a ciklodextrineket ciklo-amilózoknak is. Szteroidmolekulák ciklodextrinnel képzett komplexeit többféle gyógyszerhatóanyag és többféle szolubilizáló anyag tanulmányozása során Lech és Pauli szerzők (J. Pharm. Sci. 55, 32,1966.) vizsgálták. Tesztoszteron és kortizonacetát esetében megállapították az összetevők valószínűsíthető sztöchiometrikus arányait. A szolubilizálásokkal a gyógyszerhatóanyagok felszívódását kívánták befolyásolni. Nem alkalmazták azonban a ciklodextrineket szteroidszubsztrátumok mikrobiológiai átalakításánál a reakciók intenzifikálására.

Megállapítottuk, hogy a szteroid-szubsztrát ciklodextrinnel képzett komplexe vizes közegben pillanatszerűen disszociál és a biokonverziós rendszerben a komplex dinamikus egyensúlyban van a szabad szteroid és a szabad ciklodextrín molekulákkal. Szilárd, szuszpendált szteroidot tartalmazó biokonverziós rendszerben az enzim számára hozzáférhető oldott hányad mindenkori koncentrációja a felhasználó enzimes reakció sebességétől és az utánpótlást biztosító szubsztrát beoldódási sebességétől függ. Ha a beoldódás a lassúbb folyamat, akkor a szteroid oldat koncentrációja a reakció folyamán jóval a telítettségi érték alatt marad, ez a körülmény pedig - az enzimes reakció ismert alaptörvénye értelmében - a reakciót lényegesen lassítja. A ciklodextrinnel képzett zárványkomplexből a szubsztrát felszabadulása gyakorlatilag pillanatszerűen megy végbe, ezért ebben az esetben az oldott szubsztrát értéke a teljes folyamat során egészen a folyamat befejezéséig telítettségi értéken marad és ezzel biztosítja az adott enzimes reakcióra vonatkozó maximális átalakulási sebességet.

Más szteroid átalakítási folyamatoknál a reakciótermék, az ún. végtermékgátlási mechanizmus szerint lassíthatja vagy leállíthatja a reakciót az enzim vagy a sejt felületéhez kötődve. Ugyanakkor a szubsztrát és a végtermékmolekulák szerkezeti eltéréseik miatt kisebb vagy nagyobb mértékben különböző stabilitású komplexet képeznek a ciklodextrinnel. Vizsgálataink szerint sikerült olyan kedvező reakciókörülményeket kialakítani, amelyben az egyébként végtermékgátlást okozó szteroidot viszonylag stabil ciklodextrin-komplex-szé alakítottuk át anélkül, hogy a szubsztrát szteroid hozzáférhetőségét rontottuk volna. Amikor a szubsztrátciklodextrin komplex stabilitása nagyobb mint a végtermék-ciklodextrin komplexé, akkor a komplexképződés kihasználásával a végtermékgátlás úgy függeszthető fel, hogy a ciklodextrín beadagolását csak a reakció bizonyos előrehaladása után végezzük, amikor a termékfelesleg a rendszerben kimutatható.

További vizsgálatok során megállapítottuk azt is, hogy észterezett szteroidmolekulák enzimes hidrolízise meggyorsítható a megfelelő ciklodextrinkomplex előállításával. Ennek magyarázata feltehetően a ciklodextrín szerkezetéből adódó katalitikus hatás.

Különböző biokonverziós átalakítások során megfigyeltük azt is, hogy a ciklodextrin-komplexek képzése más jellegű arányeltolódást is okozhat, így megfelelően stabil komplex esetében - a molekula hozzáférhetőségének csökkentésével - adott térhelyzetű reakció sebességét csökkenthetjük vagy azt ki is zárhatjuk.

A ciklodextrinek zárványkomplexképzö tulajdonsága és az így képzett zárványkomplexeknek a bíokonverzíós reakciókat intenzifikáló hatása különféle szteroidok széles körében érvényesül. Az alábbi példákban, amelyek a találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait szemléltetik közelebbről, androsztán, pregnán, kolesztán, sztígmasztán és kardenolid típusú szteroidok esetében szemléltetjük a ciklodextránnal történő zárványkomplex-képzésnek a szteroid különféle mikrobiológiai átalakítása során mutatott hatását. Megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre semmilyen szempontból sincs e konkrét példákra vagy az azokban szereplő szteroidokra, illetőleg a bemutatott reakciókra korlátozva.

I. példa

Hidrokortízon átalakítása prednizolonná

Arthrobacter simplex (ATCC 6946) agar-tenyészetéről fiziológiás nátrium klorid-oldattal lemossuk a sejteket és az így kapott sejtszuszpenzió 5 cm³-ével beoltjuk a következő összetételű, előzetesen 500 cm³-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett tápközeget:

0,3% glükóz

0,1% élesztőkivonat (szárazanyagra számítva, porlasztással szárított poralakú készítmény),

0,5% enzimesen hidrolizált kazein (porlasztással szárított poralakú készítmény) vízzel 100 cm³-re kiegészítve, pH = 6,7.

A tenyésztést 32 °C-on, percenként 230/perc löketszámú sík rázógépen 18 órán át folytatjuk, majd 5 mg hidrokortízon 0,5 cm³ metanollal készített

190 784 oldatát adjuk a tenyészethez a szükséges enzim indukálása céljából. Az indukálást 3 óra hosszat, a tenyésztéssel azonos körülmények között végezzük. Az így kapott, A'-dehidrogenáz enzimet tartalmazó tenyészet 50 cm³-ét egy 950 cm³ steril vizet tartalmazó 3 literes Erlenmeyer-lombikba adagoljuk és az így 20-szorosára hígított aktív tenyészettel folytatjuk le a biokonverziót. A tenyészethez 20 g alfa-ciklodextrint adunk, majd ennek oldódása után adjuk hozzá átalakítandó szubsztrátként a 10% kalcium-kloridot tartalmazó 20 cm³ metanolban oldott 2 g hidrokortizont. Az átalakítási reakciót a fentebb említett rázógépen 5 óra hosszat folytatjuk 32 °C hőmérsékleten. Az alfa-ciklodextrin jelenléte megakadályozza a vizes közegbe beadagolt hidrokortizonnak az oldatból kiválását; az oldott hidrokortizon átalakulása az enzim aktivitása által megengedett legnagyobb sebességgel megy végbe, tehát gyorsabban, mint ha a hidrokortizon a szokásos eljárás szerint, szuszpenzió alakjában lenne jelen a biokonverziós rendszerben, amelyben az átalakítás - ciklodextrin nélkül - csak 8 óra alatt menne végbe. Az átalakítási folyamat végén a fermentlé szteroidtartalma: 1920 pg/cm³ prednizolon, 40 pg/cm³ 20p-hidroxi-prednizolon és 8 pg/cm³(átalakulatlan) hidrokortizon.

2. példa

I7a-MetiI-tesztoszteronA^l-dehidrogénezése

Az 1. példa szerint előállított és indukált tenyészetet ötszörös térfogatra hígítjuk és metil-tesztoszteron A'-dehidrogénezésére használjuk oly módon, hogy a biokonverzió megindításához 1,0 g metiltesztoszteront adagolunk 10 cm³ metanollal készített oldat alakjában a ciklodextrint tartalmazó tenyészethez. Az átalakulást vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizzük. A beadagolt metil-tesztoszteron először kiválik a közegből, majd fokozatos oldódás közben dehidrogéneződik. Körülbelül 400 pg/cm³ A’-metil-tesztoszteron szint elérésekor 6,0 g béta-ciklodextrint adunk a rendszerhez. Ez az adalék a keletkező dehidrogénezett terméket komplexkötésbe viszi; erre azért van szükség, mert az enzimes reakció a képződött termék mennyiségének túlsúlyra jutásakor az ismert termékgátlási mechanizmus folytán az átalakulási reakció lelassulna, majd teljesen leállna. A béta-ciklodextrin komplexképző hajlama a termékkel szemben körülbelül ötszörösen nagyobb, mint a kiindulási metil-tesztoszteronnal szemben. A ciklodextrin beadagolása az átalakulás 2. órájában történik; a biokonverziós reakciót a rétegkromatográfiás vizsgálat alapján a

6. órában fejezzük be.

Az átalakítás végén a fermentlé szteroidtartalma: 970 pg/cm³ A’-metil-tesztoszteron, 6 pg/cm³(átalakulatlan) metil-tesztoszteron.

Ha a biokonverziós reakciót a fent leírt módon, de ciklodextrin hozzáadása nélkül folytatjuk le, akkor a reakció már 100-120 pg/cm³ átalakulatlan szubsztrát-koncentrációnál leáll.

3. példa

5-Pregnén-3fi,17a.,21 -trihidroxi-20-on-21-acetát átalakítása Reichstein-S vegyületté

Flavobacterium lucecoloratum (N.C.I. B. 9324) ferde agar-tenyészetével egy 750 cm³-es Erlenmeyer-lombikban beoltunk 200 cm³ steril tápközeget, amelynek összetétele: 1,0 súly% élesztőkivonat (porlasztással szárított, poralakú készítmény), 0,1 súly% kálium-dihidrogén-foszfát és 0,4 süly% dikálium-hidrogén-foszfát. A tenyésztést percenként 230/perc löketszámú síkrázógépen, 30 °C hőmérsékleten 20 óra hosszat folytatjuk, majd az így kapott tenyészettel egy laboratóriumi fermentorba beoltunk 5 liter fentivel azonos összetételű steril tápközeget.

A beoltott tápközeghez hozzáadjuk 250 mg 5pregnén-3p, 17a,21 -trihidroxi-di-on-21 -acetát 1,5 cm³ dimetil-formamiddal készített és sterilre szűrt oldatát. Az átalakítandó szteroidnak a közegben való jelenléte biztosítja, hogy a tenyészet szaporodása közben a szükséges enzimek is képződjenek. 12 órai inkubálás után az elért baktériumszám és enzim-aktivitás már elegendő a biokonverziós reakció megindításához. Ekkor adjuk hozzá a gamma-ciklodextrinnel előkezelt szubsztrátot a következő módon:

100 g 5-pregnén-3p,17a,21-trihidroxi-20-on-21acetátot azonos mennyiségű gamma-ciklodextrinnel 200 cm³ vízben 20 percig homogenizálunk, ezalatt az átalakítandó szubsztrát arányos része gyorsan oldódó komplexet képez a ciklodextránnal. Az így kapott szuszpenziót betápláljuk a fermentorba, majd az inkubálást a kiindulási szteroid elfogyásáig folytatjuk, ami körülbelül 11 órát vesz igénybe. A laboratóriumi fermentorban az inkubálást 20 °C hőmérsékleten végezzük, percenként 420 fordulattal történő keverés és 0,5 liter/liter/perc levegőztetés mellett, miközben az átalakulást rétegkromatográfiai vizsgálattal ellenőrizzük.

Az átalakítás végén a fermentlé szteroidtartalma: 9020 pg/cm³ 4-pregnén-17a,21-dihidroxi-3,20dion (Reichstein S), 30 pg/cm³ átalakulatlan kiindulási szteroid. Ciklodextrin hozzáadása nélkül ez a biokonverzió ugyanilyen körülmények között csak 10 g/liter kiindulási szteroid-koncentrációval lett volna lefolytatható.

4. példa

Reichstein-S-17-acetát átalakítása hidrokortizonná

Egy 500 cm³-es Erlenmeyer-lombikban 100 cm³tápközeget, amelynek összetétele:

1,0 súly% szójaliszt

0,3 súly% kukoricalekvár (50% szárazanyagtartalmú készítmény, szárazanyagra számítva)

0,3 súly% kukoricakeményítő

0,5 súly% malátakivonat (30% szárazanyagtartalmú folyékony készítmény, szárazanyagtartalomra számítva) pH = 6,2 beoltunk Curvularia prasadii (I.M.I. 71475) ferde agar-tenyészetéről lemosott spórák szuszpenziójával. A tenyésztést 26 °C hőmérsékleten 24 óra hosz-41

190 784 szat folytatjuk, majd a tenyészet 10 cm³-ével a fentivel azonos méretű lombikban beoltunk 100 cm³tápközeget, amely malátakivonatot nem tartalmaz, egyébként a fentivel egyező összetételű. A mikroorganizmust 26 °C hőmérsékleten történő rázatás közben felszaporítjuk és a még növekedésben levő, 16 órás tenyészethez hozzáadjuk 0,12 g ReichsteinS-17-acetát (pregn-4-én-17a,21 -dihidroxi-3,20dion-17-acetát) 3 cm³ metanollal készített oldatát.

A további inkubálás során a tenyészet a szteroidot a 11 β-helyzetben hidroxilezi hidrokortizon-17acetáttá. A biokonverzió előrehaladását rétegkromatográfiával követjük; a biokonverzió 20. órájában, amikor az átalakulatlan kiindulási szteroid mennyisége körülbelül 10 súly%, 0,96 g béta-ciklodextrint adunk a biokonverziós elegyhez. A még tovább folyó és vége felé lelassuló hidroxilezés mellett felgyorsulva megy végbe a szteroid acetilcsoportjának lehasítása. 3 óra után a biokonverziót befejezzük; ekkor a fermentációs elegyben a következő anyagokat találjuk: 0,730 mg/cm³ hidrokortizon (1 ip,17a,21-trihidroxi-4-pregnén-3,20-dion), 0,185 mg/cm³ hidrokortizon-17-acetát, 0,040 mg/ cm³ Reichstein-S, 0,005 mg/cm³ Reichstein-S-17acetát.

A kontrollként azonos körülmények között, ugyanannyi ideig, de béta-ciklodextrin hozzáadása nélkül lefolytatott biokonverzió után a fermentációs elegyben a fenti anyagok koncentrációja a következő: 0,210 mg/cm³ hidrokortizon, 0,766 mg/ cm³ hidrokortizon-17-acetát, 0,020 mg/cm³ Reichstein-S, 0,027 mg/cm³ Reichstein-S-17-acetát.

A biokonverzió már előrehaladott szakaszában hozzáadott béta-ciklodextrin tehá't elsősorban az észtercsoport lehasítási reakcióját gyorsítja; ugyanakkor azonban elősegíti a hidroxilezési reakció befejeződését is.

5. példa

Hidrokortizon átalakítása prednizolonná

Laboratóriumi fermentorban 5 liter steril tápközeget, amelynek összetétele:

0,3 súly% glükóz

0,3 súly% pép tón

0,1 súly% élesztőkivonat (porlasztással szárított, poralakú készítmény) pH = 6,8 beoltunk Arthrobacter simplex (ATCC 6946) szilárd táptalajon nőtt tenyészetéről lemosott 30 cm³sejtszuszpenzióval. A tenyésztést 35 °C hőmérsékleten, 240 fordulat/perc kevertetéssel, 0,5 liter/liter/ perc levegőztetés mellett 20 óra hosszat folytatjuk. Az így kapott tenyészet 1 literjével beoltunk egy laboratóriumi fermentorban sterilezett 9 liter tápközeget, amelynek összetétele:

0,5 súly% glükóz

0,5 súly% pepton

0,4 súly% élesztőkivonat (száraz, por alakú) pH = 6,8.

A tenyésztést 0,3 liter/liter/perc levegőztetés és 600 fordulat/perc keverés mellett, 35 °C hőmérsékleten 18 óra hosszat folytatjuk; ekkor az enzim kialakulásának indukálására 0,5 g hidrokortizon 50 cm³ metanollal készített oldatát adjuk hozzá.

További 4 órai inkubálás után az így aktivált tenyészetet a biokonverzió előre elkészített közegét tartalmazó saválló készülékbe nyomatjuk.

A közeg elkészítése: a készülékbe 90 liter csapvizet töltünk, 1200 g béta-ciklodextrint adunk hozzá, majd a készüléket 100 ’C hőmérsékletre fűtjük és a közeget ezen a hőmérsékleten 20 percig sterilezzük, majd 35 °C-ra hűtjük le. 4 liter metanolban 400 g kalcium-kloridot, majd 1,0 g 2-metil-l,4-naftokinont és 400 g hidrokortizont oldunk, az oldatot sterilre szűrjük és bevisszük a saválló készülékbe. Ezután vezetjük hozzá a fenti módon elkészített tenyészetet, amikoris a biokonverziós folyamat megindul. Ekkor az átalakítandó szteroid már gyakorlatilag oldott állapotban van, ami azért fontos, mert kiküszöböli azt a veszélyt, hogy a termék kiválásának megújulásakor elegykristály képződjék a kiindulási szteroidból és a termékből.

A biokonverziót 35 °C hőmérsékleten, 180 fordulat/perc keverés és 0,6 liter/liter/perc levegőztetés mellett folytatjuk és vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal ellenőrizzük. Amikor az átalakulatlan hidrokortizon mennyisége már 2,0 súly%-ra csökken, a biokonverziós reakciót leállítjuk, a fermentlevet ellenáramú extrakcióval - szilárd anyag jelenlétét megengedő berendezés, például forgótárcsás extraktor alkalmazásával - etil-acetáttal kétszer ismételve extraháljuk. Az egyesített szerves oldószeres kivonatot vákuumban, 40 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten 8 g/liter szárazanyag-koncentrációig (körülbelül 50 liter térfogatig) bepároljuk, 40 g aktívszén és 100 g Celite keverékével derítjük, leszűrjük és a bepárlást a kristályosodásig - körülbelül 2 liter térfogatig - folytatjuk. A kapott szuszpenziót 5-10 ’C hőmérsékletre hütjük, néhány órai állás után leszűrjük; az anyalúgot ötszörös mennyiségű diizopropil-éterrel elegyítjük, az így leválasztott további terméket szűréssel elkülönítjük.

A termék összemennyisége 375 g, minőségi jellemzői :

tartalom 98 súly% szárítási veszteség 1 súly% szulfáthamu 0,1 súly% maradék hidrokortizon 1,2 súly% egyéb szteroid 0,35 súly% [a]p = +98° (dioxán, c = 1 súly%)

A béta-ciklodextrin visszanyerése céljából a fentiek során extrahált fermentlevet 1 liter ciklohexánnal 1 óra hosszat keverjük 18-20 ’C hőmérsékleten. A keletkező csapadékot szűréssel elkülönítjük, 1 liter vízben szuszpendáljuk és a ciklohexánt vízgőzdesztillációval kihajtjuk. A visszamaradó vizes béta-ciklodextrin-szuszpenziót éjjelen át 5-10 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a kivált kristályokat szűréssel elkülönítjük és vákuumban megszárítjuk. így körülbelül 700 g újból felhasználható bétaciklodextrint nyerünk vissza.

6. példa

Szitoszterin átalakítása androszta-1,4-dién-3,l 7-dionná

Mycobacterium sp. (NRRL B-3683) ferde agar táptalajon nőtt tenyészetét fiziológiás sóoldattal

190 784 lemossuk és az így kapott, 15-20 mg/cm³ sejt-szárazanyagot tartalmazó sejtszuszpenzió 1 ml-jével beoltunk 100 ml alábbi összetételű tápközeget:

0,1 súly% élesztőkivonat (szilárd por)

0,1 súly% ammónium-klorid

0,05 súly% kálium-dihidrogén-foszfát

0,2 súly % kazein-hidrolizátum (szilárd por)

0,5 súly% glicerin.

A tenyészetet 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 32 °C hőmérsékleten 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon 2 napig inkubáljuk, majd az így kapott oltótenyészet 10-10 cm³-ével indítjuk meg a biokonverziót, 4 párhuzamos kísérletben, 100-100 cm³ térfogatú tápközegben. A tápközeg összetétele:

súly% kukoricalekvár (50% szárazanyag-tartalommal, szárazanyagra számítva)

0,1 súly% élesztőkivonat (szilárd készítmény) 0,2 súly% szójaliszt

0,15 súly% kálium-dihidrogén-foszfát.

Az egyes biokonverziós kísérletekben a kiindulási szteroidként alkalmazott β-szitoszterint és a βει klodextrint az alábbi koncentrációban adtuk a 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilezett, majd 32 °C-on a fenti oldótenyészettel beoltott tápközeghez:

Kísérlet	β-szitoszterin	β-ciklodextrin
A	0,2%	0,1%
B	0,4%	0,2%
C	0,2%	-
D	0,4%	-

A biokonverzióstenyészetet 500 cm³-es Erlenmeyer-lombikban, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon 32 °C hőmérsékleten 168 óra hosszat inkubáljuk. Az átalakítás végén a fermentlében változatlanul maradt kiindulási szteroid mellett főként androszta-l,4-dién-3,17-dion található az alábbi mennyiségekben:

Kísérlet A B C D androszta-1,4-dién-3,17-dion mg/cm³ 0,70 1,20 0,50 0,60

Amint a fenti eredmények mutatják, ciklodextrin jelenlétében nemcsak a tennék hozama növekszik lényeges mértékben, hanem a kiindulási szteroid koncentrációja is növelhető, a termékhozam lényeges mértékű csökkenése nélkül.

7. példa

Progeszteron átalakítása 21-hidroxi-progeszteronná

121 °C-on 30 percig sterilezett sörcefrét (szárazanyagtartalom 5 súly%, pH = 5,9) két 500 cm³-es Erlenmeyer-lombikban, 100-100 ml mennyiségben beoltunk egy ferde agar-táptalajról lemosott Ophiobolus herpotrichus (ATCC 12279) sejtszuszpenzióval. A tenyészetet 28 °C hőmérsékleten, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon 3 napig rázatjuk, majd 25-25 mg progeszteron 0,6 cm³ acetonnal készített és sterilre szűrt oldatát adjuk mindkét tenyészethez. Az inkubálást további 3 napig folytatjuk a fenti körülmények között. A progeszteron hozzáadása után 1 nappal az egyik lombik tartalmához 75 mg béta-ciklodextrin 2 ml vízzel készített és 121°C hőmérsékleten 20 percig sterilizált oldatát adjuk, míg a másik lombik tartalmához csupán 2 cm³ steril vizet adunk.

A biokonverzió befejezésekor a ciklodextránnal kezelt fermentlében 0,170 mg/cm³ 21-hidroxiprogeszteront és 0,015 mg/cm³ átalakulatlan progeszteront, míg a ciklodextrin nélküli fermentlében 0,150 mg/cm³ 21-hidroxi-progeszteront és 0,036 mg/cm³ átalakulatlan progeszteront találunk.

8. példa

16a-Metil-Reichstein-S átalakítása 16a-metil-hidrokortizonná.

Curvularia lunata (ATCC 12017) mikroorganizmus ferde agar-tenyészetéről lemosott spórák szuszpenziójával a 4. példában leírt módon, két párhuzamos kísérletben beoltunk 100-100 cm³ tápközeget (a 4. példában megadottal azonos összetételben). A még növekedésben levő, 16 órás tenyészetekhez 60-60 mg 16a-metil-Reichstein-S 3 ml metanollal készített és sterilre szűrt oldatát adjuk. Ezután az egyik lombikba 180 mg ciklodextrin (béta- és gamma-ciklodextrin elegye) 3 ml vízzel készített és 121 °C-on 20 percig sterilezett oldatát adagoljuk, míg a másik lombikhoz csupán 3 ml steril vizet adunk. Az inkubálást a 4. példában leírt módon 48 óra hosszat folytatjuk, majd a biokonverziós reakciót leállítjuk.

A biokonverzió termékeként keletkezett 16a-metil-hidrokortizon koncentrációja a ciklodextrinnel kezelt tenyészetben 0,42 mg/cm³, míg a ciklodextrin nélküli tenyészetben csupán 0,34 mg/cm³.

9. példa

3§,17a.,21-trihidroxi-5-pregnén-20-on-21-acetát átalakítása Reichstein-S vegyületté

Flavobacterium dehydrogenans (ATCC 13930) mikroorganizmusnak a 3. példában leírt módon elkészített és az átalakításhoz szükséges enzimek termelésére indukált tenyészetéhez a szükséges 3βhidroxi-szteroid-oxidoreduktáz és acil-szteroidészteráz enzimaktivitás ellenőrzése után (amihez körülbelül 12 órai tenyésztés szükséges) négy 500 cm³-es, egyenként 100 ml tenyészetet tartalmazó rázólombikban az alábbi anyagokat adjuk:

A: 1 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 8 g vízzel készített oldata;

B: 2 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 8 g vízzel készített oldata;

C: 1 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 5 g vízzel és 1 g ciklodextrin (alfa- és béta-ciklodextrin elegye) 3 g vízzel készített oldata;

D: 2 g átalakítandó szteroid 0,05 g Tween 80-at tartalmazó 5 g vízzel és 1 g ciklodextrin (alfa- és béta-ciklodextrin elegye) 3 g vízzel készített oldata.

A fenti, steril állapotban hozzáadott oldatok beadagolása után az inkubálást 30 °C hőmérsékleten, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon további 12 óra hosszat folytatjuk. A biokonverzió befejezése után az egyes lombikokban a termékként kapott Reichstein-S vegyület koncentrációja: A lombik:

190 784

7,5 mg/cm³, B lombik: 8,5 mg/cm³, C lombik: 7,8 mg/cm³, D lombik: 15,1 mg/cm³.

A fenti példa mutatja, hogy ciklodextrin jelenlétében végzett biokonverzió esetén a kiindulási szteroid koncentrációja kétszeresére növelhető a hozam számottevő csökkenése nélkül.

10. példa

Lanatozid-A átalakítása digoxinná ¹¹

Streptomyces purpurascens (MNG 178) mikroorganizmus Czapek-Dox ferde agar-táptalajon nőtt tenyészetét steril vízzel lemossuk és az így kapott spóraszuszpenzióval beoltunk 100 ml alábbi ¹összetételű, és a beoltás előtt 121 °C hőmérsékleten 45 percig sterilezett, majd lehűtött tápközeget:

súly % szójaliszt súly% glükóz pH (nátrium-hidroxid-oldattal beállítva): 7,8 ²

Az így beoltott tenyészetet 32 °C hőmérsékleten, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon, 500 mles rázólombikban 3 napig inkubáljuk.

Az így kapott oltótenyészet 5-5 ml-jével két párhuzamos kísérletben (A és B) 100-100 ml alábbi ²összetételű, 121 °C hőmérsékleten 60 percig sterilezett tápközeget oltunk be:

súly% szójaliszt súly% kukoricakeményítő pH (nátrium-hidroxid-oldattal beállítva): 7,0 3

A két („A” és „B” jelű) lombikban levő tenyészetet 32 °C hőmérsékleten, 230 percenkénti löketszámú rázóasztalon 2 napig inkubáljuk, majd mindkét lombik tartalmához 100-100 mg lanatozid-A 1 ml dimetil-szulfoxiddal készített és sterilre szűrt olda- 3 tát adjuk. Ezután az „A” jelű lombik tartalmához 200 mg béta-ciklodextrin 5 ml vízzel készített és 121 °C hőmérsékleten 10 percig sterilezett oldatát adjuk, a „B” jelű lombik tartalmához pedig csupán 5 ml steril vizet adunk. Mindkét lombik tartalmá- 4 nak inkubálását változatlan körülmények között további 3 napig folytatjuk.

Az igy kapott ferment leveket 10-10 ml kloroformmal extraháljuk és kvantitatív vékonyrétegkromatográfiás meghatározással vizsgáljuk a kló- t roformos kivonatban jelenlevő termékeket. Az

alábbi eredményeket kaptuk a leírt kísérletben:
	„A” lombik	„B” lombik
Lanatozid-A maradék	-	5 mg
dezacetil-lanatozid-A	5 mg
digoxin	50 mg	50 mg
digitoxin	30 mg	20 mg
acetil-digitoxin	1 mg	10 mg

Szabadalmi igénypontok

Claims

1. Eljárás androsztán-, pregnán-, kolesztán- illetőleg sztigmasztán-vázas vagy kardenolid típusú szteroidok mikrobiológiai átalakításának intenzifikálására, azzal jellemezve, hogy a szteroid mikrobiológiai reakcióját az átalakítandó szteroidra számítva 1-10-szeres tömegű alfa-, béta- vagy gammaciklodextrin jelenlétében folytatjuk le és kívánt esetben az átalakulás végbemenetele és a reakciótermék elkülönítése után a ciklodextrint a rendszerből visszanyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzaljellemezve, hogy a ciklodextrint a mikrobiológiai reakció előtt, vagy annak kezdetekor vagy előrehaladása során adagoljuk a rendszerhez.

3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő ciklodextrint a szubsztrát beadagolása előtt adagoljuk a biokonverziós közegbe.

4. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szubsztrát-ciklodextrin zárványkomplexét adagoljuk a mikrobiológiai átalakításhoz.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szubsztrát ciklodextrinnal képzett zárványkomplexének oldatát vagy szuszpenzióját adagoljuk.

6. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ciklodextrint a mikrobiológiai konverzió 35-50%-ának végbemenetele után adagoljuk a rendszerbe.

7. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ciklodextrint, illetve a szteroidszubsztráttal képzett zárványkomplexét, esetleg ezek oldatát a biokonverziós közegbe történő beadagolás előtt sterilezzük.

8. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biokonverziós közegbe adagolt ciklodextrint a közeggel együtt sterilezzük.

9. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja a ciklodextrin visszanyerésére, azzal jellemezve, hogy a vizes biokonverziós közegből, a termékként kapott szteroid szerves oldószerrel történő extrahálása után a ciklodextrint valamely a ciklodextrin oldékonyságát erősen csökkentő oldószer, célszerűen hexán hozzákeverésével kicsapjuk, majd szűréssel elkülönítjük és kívánt esetben megszáritjuk.