KR100422161B1

KR100422161B1 - 4-안드로스텐-3,17-디온 및안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온의 제조 방법

Info

Publication number: KR100422161B1
Application number: KR10-2001-0025704A
Authority: KR
Inventors: 노승권; 김명국; 윤원태; 박경문; 박상옥
Original assignee: (주)유진사이언스
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2004-03-10
Also published as: WO2002092830A1; US20040152153A1; US7241589B2; KR20020086051A

Abstract

본 발명은 4-안드로스텐-3,17-디온(Androst-4-ene-3,17-dione) 및 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온(Androsta-1,4-diene-3,17-dione)의 제조 방법에 관한 것으로, 좀 더 자세하게는 스테롤(sterol) 류와 유화제를 각각 가열하여 완전히 녹인 다음 혼합하여 혼합액을 제조하고, 상기 혼합액을 70∼90℃의 물에 넣어 교반하는 과정을 통해 유화된 스테롤 또는 우유에서 추출한 사이클로덱스트린-스테롤 (cyclodextrin- sterol) 복합체를 미생물 배양 배지 성분으로 사용하는 AD/ADD의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 유화된 스테롤 및 사이클로덱스트린-스테롤 복합체는 제조 방법이 용이할 뿐 아니라, 본 발명의 방법을 사용할 경우 AD/ADD를 높은 수율로 얻을 수 있으므로 효과적이다.

Description

4-안드로스텐-3,17-디온 및 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온의 제조 방법{A method for preparation of Androst-4-ene-3,17-dione and Androsta-1,4-diene-3,17-dione}

본 발명은 신규한 4-안드로스텐-3,17-디온(Androst-4-ene-3,17-dione; 이하 'AD'로 약칭함), 및 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온(Androsta-1,4-diene-3,17-dione; 이하 'ADD'로 약칭함)의 제조 방법에 관한 것으로, 좀 더 자세하게는 유화된 스테롤 또는 사이클로덱스트린-스테롤(cyclodextrin-sterol) 복합체를 미생물 배양 배지 성분으로 사용함으로써 AD/ADD를 높은 수율로 얻을 수 있는 AD/ADD의 제조 방법에 관한 것이다.

스테로이드 호르몬은 인간의 부신피질·정소·난소·태반·황체에서 분비되는 호르몬으로써, 인체 내에서 콜레스테롤로부터 합성되며, 생리적 작용에 따라 남성의 2차 성징을 유지하는 안드로겐(안드로스테론·테스토스테론 등), 여포에서 생성되며 여성의 2차 성징을 유지하는 에스트로겐(에스트라디올 등), 난소의 황체에서 분비되며, 자궁에서 임신이 되도록 하고 임신을 유지시켜주는 게스토겐(프로게스테론 등), 단백질을 포도당과 간의 글리코겐으로 전환시키는 당질 코르티코이드 (코르티손·하이드로코르티손 등), 생체내 전해질과 수분의 균형 유지에 매우 중요한 역할을 하는 무기질코르티코이드(디옥시코르티코스테론·알도스테론 등)의 약 5종류로 구분된다.

현대 문명 발달에 따른 스트레스의 증가와 환경 호르몬 등의 영향으로 인해 인체 내에서 상기 호르몬의 균형이 깨지고 있으며 이에 따라 많은 질병들이 발생하고 있고, 상기 질병의 치료제 또는 보조 치료제로서 전술한 스테로이드 호르몬 제제가 광범위하게 사용되고 있는 실정이다. 특히, 합성된 에스트로겐은 인공 수정, 불임 환자의 시술 및 치료시 필수적으로 사용되며 또한, 당질 코르티코이드는 단백질을 소모하여 체내의 글리코겐 저장을 유지시키는데, 마취효과가 있어서 홍채염(虹彩炎)이나 관절염과 같은 여러 염증의 통증을 덜어주는 역할을 한다. 또한, 치명적이라 알려진 아디손병은 디옥시코르티코스테론과 하이드로코르티손을 투여함으로써 치료할 수 있게 되었다.

전술한 바와 같이 수요가 증대된 스테로이드 호르몬의 합성을 위해 다양한 연구가 시도되어 왔는데, 이중 스테로이드 호르몬 합성용 전구체인 AD/ADD를 제조하여 합성하는 방법이 일반적이다. 상기 AD/ADD는 미생물의 산화 효소에 의해 스테롤 류가 대사됨으로써 제조되며, 이때 기질 물질로는 콜레스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 기타 스테롤 산화물 등이 사용될 수 있는데, 상기 물질들은 소수성이기 때문에 미생물의 기질 이용성을 높이는 데에는 한계가 있다. 따라서, 상기 문제점을 극복하고 기질인 스테롤 류의 미생물 이용가능성을 증대시킴으로써 AD/ADD의 수득율을 높이기 위한 여러 가지 방법이 연구되어 왔다.

헤세링크(Paul G. M. Hesselink 등, Enzyme Microbiology and Technology 1989, 11, 398-404) 등은 불용성인 스테롤류를 수용성 배지에 수용화하기 위해 배지에 스테롤류의 포집체로서 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 첨가함으로써 미코박테리움(Mycobacterium sp.)에 의한 스테로이드 측쇄 분해를 촉진시켰으며, 그 결과 스테롤로부터 AD/ADD로의 전환율이 2배 이상 증가하는 것을 관찰하였다.

청위(Chung-Yi Lee 등, Applied microbiology and biotechnology, 1993, 38, 447-452) 등은 스테롤 류의 배지 내 분산율을 증가시키기 위해 유기 용매(acetone)를 2% 첨가하였고, 뿐만 아니라, 스테롤 류의 AD/ADD로의 전환 수율을 높이기 위해 두 종류의 미생물을 이용하는 두 단계의 전환 공정을 사용하였다. 결과적으로 유기 용매를 사용한 경우가 사용하지 않은 경우보다 AD/ADD의 수득율이 증가하였으나, 아세톤 2%의 첨가시 1% 이상의 농도를 가지는 스테롤 용액을 제조하기가 어려운 단점이 있다.

이강민(한국생물공학회지 제7권 3호 161-165) 등은 기질인 스테롤 류의 이용 효율을 높이기 위해서 마이크로에멀젼(microemulsion)을 이용한 방법을 사용하였다. 구체적으로 스테롤의 일종인 시토스테롤을 글루탈데하이드(glutaldehyde)로 교차결합시킨 후 계면활성제로 마이크로이멀젼을 제조하여 배지에 첨가하였다. 그 결과 시토스테롤 3 g을 사용하였을때 세포 g 당 최대 120 ㎎의 AD/ADD을 얻을 수 있음을 확인하였다.

세드락젝(L. Sedlaczek 등, Applied microbiology and biotechnology, 1999, 52권, 563-571) 등은 배지 중에 세포벽 합성 저해제인 글라이신(glycine)을 첨가하여 세포벽 펩타이드 사이의 가교결합을 감소시키고 펩티도글라이칸(peptidoglycan) 결합을 파괴하여 스테롤 류의 이용성을 증대시키고자 하였다. 그 결과 세포 성장은 감소하였지만, AD/ADD의 생성량은 10% 정도 증가하는 결과를 보였다.

고에첼(Ruth Goetschel 등, Enzyme Microbiology and Technology, 1992, 14권, 390-395)등은 콜레스테롤의 산화 작용을 증대시키기 위해 리포조멀 배지에 로도코코스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis)를 배양하였다.

또한, 상기 연구 외에도 린다 왕(Linda Wang 등, The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275권, 10호, 7224-7229) 등은 마이코박테리움 세포벽 주성분인 미콜릭산(mycolic acid)의 생합성을 못하는 돌연변이주를 이용하여 스테롤 류의 호르몬 중간체 전환 실험을 하였고, 에이미(Aimee E. Belanger 등, Journal of bacteriology, 2000, 182권 23호 6854-6856)등은 스테롤 류의 이용성 증대를 위해서 마이코박테리움 스메그매티스(mycobacterium smegmatis)의 펩티도글라이칸 생합성에 관련된 유전자인 ddlA를 제거한 돌연변이주를 사용하였다.

전술한 방법들이 스테롤로부터 AD/ADD로의 전환율을 증대시킨 것은 사실이나, 그 증가율은 미미한 것으로서 미생물의 스테롤 이용성을 크게 증가시키기 위한 신규한 방법이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들이 광범위한 연구를 수행한 결과, 신규한 방법으로 유화된스테롤 또는 사이클로덱스트린과 결합된 스테롤을 배지내 첨가하고 미생물을 배양할 경우 AD/ADD의 수율이 크게 상승함을 확인하였고, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 미생물의 스테롤 이용성을 높임으로써 AD/ADD의 수율을 높일 수 있는 신규한 AD/ADD 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 AD/ADD 제조 방법은 스테롤 류와 유화제를 각각 가열하여 완전히 녹인 다음 혼합하여 혼합액을 제조하고, 상기 혼합액을 70∼90℃의 물에 넣어 교반하는 과정을 통해 유화된 스테롤을 미생물의 배양 배지 성분으로 사용하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 AD/ADD 제조 방법은 우유에서 추출한 사이클로덱스트린-스테롤 복합체를 미생물의 배양 배지 성분으로 사용하는 것이다.

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 신규한 AD/ADD의 제조 방법은 신규한 유화 방법으로 유화된 스테롤 용액을 미생물 배양 배지에 첨가하는 방법과 사이클로덱스트린-스테롤 복합체를 미생물 배양 배지에 첨가하는 방법이 있다.

상기 유화된 스테롤 용액은 스테롤 류와 유화제를 각각 가열하여 완전히 녹인 다음 혼합하여 혼합액을 제조하고, 상기 혼합액을 70∼90℃의 물에 넣어 교반하는 과정을 통해 얻는데, 전술한 방법을 사용하는 이유는 스테롤 류가 난용성 물질이기 때문에 유화제가 미리 첨가된 물에 넣어 유화시키게 되면 유화의 효과가 떨어지는 반면, 스테롤류와 유화제가 균질하게 섞여있는 상태에서 유화시킬 경우에는 유화의 효율이 극대화될 수 있기 때문이다. 따라서 두 물질이 액체로 된 상태에서 혼합하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용가능한 유화제는 수크로오즈 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester), 소르비탄 지방산 에스테르(sorbitan fatty acid ester), 폴리소르베이트 (polysorbate), 폴리글리세롤 지방산(polyglycerol fatty acid), 프로필렌 글리세롤 지방산(propylene glycerol fatty acid), 및 폴리글리세린 지방산 에스테르(poly glycerine fatty acid ester)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 특히, 수크로오즈 지방산 에스테르가 바람직하고, 상기 스테롤과 유화제의 혼합비는 무게비로 1 : 0.2∼2.0 (w/w), 바람직하게는 1 : 0.1∼1.0 이다. 상기 유화된 스테롤 용액에서 스테롤의 농도는 무게비로 0.1∼20%(w/v), 바람직하게는 1∼10%(w/v)이다.

상기 유화된 스테롤 용액은 배양배지 100 ㎖당 스테롤 무게로 0.01∼10 g, 바람직하게는 0.1∼5 g으로 사용된다.

본 발명에서 AD/ADD 제조를 위해 미생물의 기질로 사용되는 또 다른 물질은 사이클로덱스트린-스테롤 복합체이다. 상기 사이클로덱스트린은 우유로부터 콜레스테롤을 제거하여 저콜레스테롤 우유를 제조하기 위해 많이 사용되는 것으로서, 이 때 제거되는 콜레스테롤은 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체의 형태로 남게 된다. 따라서 비용면에서 매우 효율적이고, 수용액인 미생물 배지 중에 용해와 분산이 용이하여 미생물 전환용 기질로서는 우수한 조건을 갖추고 있다.

상기 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는데, β-사이클로덱스트린이 스테롤에 대한 결합 구조면에서 가장 강하기 때문에 특히 바람직하다.

상기 사이클로덱스트린-스테롤 복합체를 미생물 배지에 첨가할 경우 배양배지 100 ㎖당 0.07∼70 g, 바람직하게는 0.7∼35 g로 사용한다.

본 발명에서 사용되는 미생물은 탄소원으로 스테롤을 사용하는 미생물은 모두 사용가능하며, 구체적으로는 아스로박터속(Arthrobacter), 노카디아속 (Nocardia), 푸사리움속(Fusarium), 미코박테리움속(Mycobacterium), 마이크로박테리움속(Microbacterium), 프로타미노박터속(Protaminobacter), 브레비박테리움속 (Brevibacterium), 코리네박테리움속(Corynebacterium), 바실러스속(Bacillus), 세라티아속(Serratia), 아조토박터속(Azptobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 알칼리게네스속(Alkaligenes), 및 슈도모나스속(Pseudomonas) 등이 있다. 상기의 미생물 속에 속하는 대표적인 균주로는 아스로박터 심플렉스(Arthrobacter simplex IAM 1660), 노카디아 에리스로폴리스(Norcardia erythropolis ATCC 4277), 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis IFO 3083), 미코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei IFO 3158), 및 미코박테리움 포튜이텀(Mycobacterium fortuitum), 프로타미노박터 알보플라버스(Protaminobacter alboflavus ATCC 8458), 브레비박테리움 리폴리티컴(Brevibacterium liplyticum IAM 1398), 및 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi IAM 1038) 등이 있으며, 이들의 돌연변이균주도 본 발명의 방법에 사용이 가능하다. 상기 미생물중 아스로박터 심플렉스, 브레비 박테리움 리폴리티컴 및 미코박테리움속이 바람직하고, 특히 본 발명자들이 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum; ATCC 29472)을 돌연변이화시켜 제작한 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119(기탁번호: KCCM-10259, 기탁일자: 2001년 4월 14일)는 스테롤로부터 AD/ADD로의 전환능이 매우 뛰어나므로 더욱 바람직하다.

본 발명의 스테롤은 콜레스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는데 특히 콜레스테롤이 바람직하다.

본 발명의 실시예에서는 본 발명의 방법과 기존의 방법에 따른 AD/ADD의 수율을 비교 분석하였는데, 먼저 공지의 기술인 계면활성제 및 믹서를 이용한 균질화, 초음파 분쇄, 유기용매 첨가 후 균질화, 유기용매 첨가의 방법을 이용하여 처리한 콜레스테롤을 첨가한 후 미생물을 배양한 경우에는 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 수율이 40.6∼51.7 ㎎/100 ㎖에 그친 반면, 본 발명의 유화된 콜레스테롤 용액을 사용하여 미생물을 배양한 경우에는 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 AD/ADD의 수율이 130 ㎎/100 ㎖, 그리고 우유에서 제거한 사이클로덱스트린-콜레스테롤을 첨가하여 미생물을 배양한 경우에는 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 92.2 ㎎/100 ㎖의 AD/ADD가 생성된 것으로 확인되었는데, 상기 수치는 공지 방법을 통해 제조된 AD/ADD 양보다 약 2∼3배 높은 것이다.

결과적으로, 본 발명의 방법은 AD/ADD를 높은 수율로 얻기 위한 목적으로 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

미생물의 배양

하기의 모든 실시예 및 비교예에서 수행된 미생물의 배양은 본배양시 첨가된 콜레스테롤의 종류 및 첨가량을 제외하고는 실시예 1의 방법을 따랐다.

하기 표 1의 조성으로 배양 배지를 만든 다음 pH를 7.0으로 조정하고, 준비된 배지중 5 ㎖을 시험관에 붓고, 120℃에서 15분 고압살균한 다음 냉각하여 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum ATCC 29472)를 백금이로 접종하였다. 접종 후 30℃, 200rpm으로 4일간 배양하여 종자 배양액을 제조하였다.

종자배양 배지 조성

성분	중량%
효모 추출물	0.1%
영양성분	0.8%
글리세롤	0.5%
트윈 80	0.01%
물	100 ㎖이 되도록 첨가

본 배양의 경우는 먼저, 포도당을 제외한 하기 표 2의 조성으로 제조된 주발효배지의 pH를 7.0으로 조정하고, 500 ㎖ 교반 플라스크에 준비된 주발효배지 85 ㎖을 넣은 다음 고압 멸균을 실시하였다. 포도당은 10배 농도의 용액을 별도로 제조하고 멸균한 다음 상기에 준비된 주발효 배지에 10 ㎖를 첨가하였다. 콜레스테롤은 배지내 최종 농도가 5 g/ℓ가 되도록 조절하여 첨가하였다.

준비가 완료된 주발효 배지 95 ㎖에 상기에서 준비된 종자 배양액 5 ㎖을 접종하여 최종 부피를 100 ㎖이 되도록 한 다음 왕복 교반기 하에서 30℃, 200rpm 의 조건으로 5일간 배양하였다.

본 배양 배지 조성

성분	중량(W%)
포도당	1%
효모 추출물	0.5%
인산 칼륨(dibasic)	0.04%
인산 칼륨(monobasic)	0.08%
황산마그네슘	0.02%
황산 철(II)	0.0005%
초산 암모늄	0.15%
황산 아연	0.0002%
염화 망간(manganese chloride)	0.00005%
트윈 80	0.05%
물	1ℓ가 되도록 첨가

실시예 2

우유에서 추출한 사이클로덱스트린-콜레스테롤 복합체를 이용하였을 때 ADD 생성량의 변화를 확인하기 위하여 하기의 방법을 수행하였다.

우유 500ℓ에 베타 사이클로덱스트린 5 ㎏을 부가한 다음 호모-믹서(homo-mixer)를 이용하여 500 rpm, 4℃에서 10분간 균질화를 실시하였다. 균질화된 우유 용액을 6000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리함으로써 생성된 콜레스테롤-사이클로덱스트린 복합체를 분리하였다. 분리된 콜레스테롤-사이클로덱스트린 복합체를 콜레스테롤 농도가 50 g/ℓ이 되도록 물로 희석한 후 다시 한번 호모-믹서를 이용한 균질화를 수행하였다. 상기의 과정으로 최종적으로 준비된 콜레스테롤-사이클로덱스트린 복합체 용액 10 ㎖(콜레스테롤 50 g/ℓ) 및 종자배양액 5 ㎖을 주발효배지에 첨가하고 상기 실시예 1의 방법으로 배양하였다.

AD/ADD 생성량은 배양 배지 1 ㎖을 에틸에테르와 석유에테르가 1:1로 혼합된 혼합 용매 4 ㎖로 2회 추출한 후 감압 증발하여 2-프로판올(2-propanol)에 녹여 고압 액체 크로마토그래피로 분석하였다.

그 결과 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 AD/ADD가 92.2 ㎎/100 ㎖ 생성되었음을 확인하였다.

실시예 3

콜레스테롤을 본 발명의 새로운 방법으로 유화시킨 다음 사용하였다.

콜레스테롤과 유화제를 각각 녹는점까지 가열하여 완전히 녹인 후 1 : 0.5 (w/w; 콜레스테롤:유화제)의 비율로 혼합하여 80℃의 물에 넣고 교반하여 유화된 콜레스테롤을 제조하였다.

상기 과정으로 준비된 유화된 콜레스테롤 용액 10 ㎖(콜레스테롤 50 g/ℓ)과 종자배양액 5 ㎖을 주발효배지에 첨가하고 상기 실시예 1의 방법으로 배양하였고, 실시예 2와 동일한 방법으로 AD/ADD 생성량을 측정하였다.

그 결과 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 130 ㎎/100 ㎖의 AD/ADD가 생성되었음을 확인하였다.

비교예 1

계면 활성제와 혼합 균질화한 콜레스테롤을 사용하여 미생물을 배양하였다. 먼저, 콜레스테롤 5 g에 계면활성제인 트윈 80(Tween 80) 0.05중량%를 넣고 총부피가 100 ㎖이 되도록 물을 첨가하여 혼합 용액을 제조하고, 호모-믹서를 이용하여 상기 혼합 용액을 5000rpm에서 20분간 균질화시켰다. 균질화된 콜레스테롤 용액 10 ㎖(콜레스테롤 50 g/ℓ) 및 종자배양액 5 ㎖을 주발효배지에 첨가한 다음 배양하였고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 AD/ADD양을 측정하였다.

그 결과 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 44.3 ㎎/100 ㎖의 AD/ADD가 생성되었음을 확인하였다.

비교예 2

계면활성제 및 초음파 분쇄 처리된 콜레스테롤을 사용하였다.

콜레스테롤 5 g에 트윈 80 0.05중량%를 넣고 총부피가 100 ㎖이 되도록 물을 첨가하여 혼합 용액을 제조한 다음 상기 혼합 용액을 초음파 분쇄기로 20분간 분쇄하였다. 준비된 콜레스테롤 분쇄 용액 10 ㎖(콜레스테롤 50 g/ℓ) 및 종자배양액 5 ㎖을 주발효배지에 첨가한 다음 배양하였고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 AD/ADD양을 측정하였다.

그 결과 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 44.3 ㎎/100 ㎖의 AD/ADD가 생성되었음을 확인하였다. 상기 결과는 비교예 1과 동일한 수율로서 호모 믹서나 초음파 분쇄기로 처리한 콜레스테롤의 경우 미생물의 이용성이 크지 않음을 확인할 수 있었다.

비교예 3

계면활성제 및 유기용매를 첨가하여 균질화한 콜레스테롤을 사용하였다. 콜레스테롤 5 g에 트윈 80 0.05중량% 및 아세톤 20 ㎖을 넣은 다음 총 부피가 100 ㎖이 되도록 물을 첨가하여 혼합 용액을 제조하였다. 준비된 혼합 용액을 호머 믹서를 이용하여 500 rpm에서 20분간 균질화시켰다. 준비된 콜레스테롤 균질 용액 10 ㎖(콜레스테롤 50 g/ℓ) 및 종자배양액 5 ㎖을 주발효배지에 첨가한 다음 배양하였고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 AD/ADD양을 측정하였다.

그 결과 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 51.7 ㎎/100 ㎖의 AD/ADD가 생성되었음을 확인하였다.

비교예 4

계면활성제를 가한 후 유기용매에 분산시킨 콜레스테롤을 사용하였다. 콜레스테롤 5 g에 트윈 80 0.05중량% 및 아세톤 20 ㎖를 넣고 총부피가 100 ㎖이 되도록 물을 첨가하였다. 준비된 콜레스테롤 분산 용액 10 ㎖(콜레스테롤 50 g/ℓ) 및 종자배양액 5 ㎖을 주발효배지에 첨가한 다음 배양하였고, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 AD/ADD양을 측정하였다.

그 결과 첨가해준 콜레스테롤 0.5 g/100 ㎖당 40.6 ㎎/100 ㎖의 AD/ADD가 생성되었음을 확인하였다.

상기 실시예 및 비교예에 나타난 결과를 하기 표 3에 종합하여 나타내었다.

구분	방법	제조량 (㎎/ℓ)	전환률(몰%)
실시예 2	콜레스테롤-사이클로덱스트린 복합체	922	25
실시예 3	본 발명의 유화된 콜레스테롤	1,300	35
비교예 1	균질화	443	12
비교예 2	초음파 분쇄	443	12
비교예 3	균질화-유기용매	517	14
비교예 4	유기용매	406	11

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 공지의 방법과 비교하여 콜레스테롤-사이클로덱스트린 복합체 및 본 발명의 유화된 콜레스테롤을 사용한 경우 AD/ADD의 수율이 약 3배 이상 높음을 확인하였다.

본 발명의 방법에 사용되는 유화된 스테롤 및 사이클로덱스트린-스테롤 복합체는 제조 방법이 용이할 뿐 아니라, 상기 실시예에서 본 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용할 경우 AD/ADD를 높은 수율로 얻을 수 있으므로 효과적이다.

Claims

스테롤 류와 유화제를 각각 가열하여 완전히 녹인 다음 상기 스테롤과 유화제를 1:0.2~2.0(w/w)의 비율로 혼합하여 혼합액을 제조하고, 상기 혼합액을 70∼90℃의 물에 넣어 교반하여 얻어진 유화된 스테롤을 미생물의 배양 배지에 첨가하여 AD(Androst-4-ene-3,17-dione)/ADD(Androsta-1,4-diene-3,17-dione)를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유화제는 수크로오즈 지방산 에스테르(sucrose fatty acid ester), 소르비탄 지방산 에스테르(sorbitan fatty acid ester), 폴리소르베이트 (polysorbate), 폴리글리세롤 지방산(polyglycerol fatty acid), 프로필렌 글리세롤 지방산(propylene glycerol fatty acid), 및 폴리글리세린 지방산 에스테르(poly glycerine fatty acid ester)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서, 상기 유화된 스테롤은 배양배지 100 ㎖당 스테롤 무게로 0.01∼10 g으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
우유에서 추출한 사이클로덱스트린-스테롤 복합체를 미생물의 배양 배지에 첨가하여 AD(Androst-4-ene-3,17-dione)/ADD(Androsta-1,4-diene-3,17-dione)를 제조하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린-스테롤 복합체는 배양배지 100 ㎖당 0.07∼70 g으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 미생물은 아스로박터속(Arthrobacter), 노카디아속(Nocardia), 푸사리움속(Fusarium), 미코박테리움속(Mycobacterium), 마이크로박테리움속(Microbacterium), 프로타미노박터속(Protaminobacter), 브레비박테리움속(Brevibacterium), 코리네박테리움속(Corynebacterium), 바실러스속 (Bacillus), 세라티아속(Serratia), 아조토박터속(Azptobacter), 스트렙토미세스 (Streptomyces), 알칼리게네스속(Alkaligenes), 슈도모나스속(Pseudomonas) 및 이들의 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 미생물은 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119(Mycobacterium fortuitumEUG-119, 기탁번호: KCCM-10259)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제5항에 있어서, 상기 스테롤류는 콜레스테롤, 시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 및 에르고스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.