KR100432054B1

KR100432054B1 - 스테롤로부터 4-안드로스텐-3,17-디온/안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온으로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100432054B1
Application number: KR10-2001-0025702A
Authority: KR
Inventors: 노승권; 김명국; 윤원태; 박경문; 박상옥
Original assignee: (주)유진사이언스
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2004-05-17
Also published as: WO2002092789A1; CN1250709C; KR20020087510A; JP2004524858A; US20040137555A1; US7259005B2; CN1507489A

Abstract

본 발명은 스테롤로부터 AD(Androst-4-ene-3,17-dione)/ADD(Androsta-1,4-diene-3,17-dione)로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 좀 더 자세하게는 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum; ATCC 29472)의 돌연변이주 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119, 이의 제조 방법 및 이를 AD/ADD 제조시 사용하는 방법에 관한 것이다.본 발명의 미생물은 공지의 미생물과 비교하여 스테롤로부터 스테로이드 호르몬의 전구체인 AD/ADD로의 전환능이 월등히 뛰어나므로 스테로이드 호르몬의 대량 제조시 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

스테롤로부터 4-안드로스텐-3,17-디온/안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온으로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물 및 이의 제조 방법{Microorganism having ability to convert sterol into Androst-4-ene-3,17-dione/Androsta-1,4-diene-3,17-dione and preparation method thereof}

본 발명은 콜레스테롤로부터 4-안드로스텐-3,17-디온 (Androst-4-ene-3,17-dione; 이하 'AD'라 약칭함)/안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온(Androsta-1,4-diene-3,17-dione; 이하 'ADD'라 약칭함)로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum) EUG-119, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것으로, 좀 더 자세하게는 공지의 미생물보다 AD/ADD로의 전환율이 4배 이상 높은 미생물, 상기 미생물의 제조 방법 및 상기 미생물을 AD/ADD제조시 사용하는 방법에 관한 것이다.

스테로이드 호르몬은 인간의 부신피질·정소·난소·태반·황체에서 분비되는 호르몬으로써, 인체 내에서 콜레스테롤로부터 합성되며, 생리적 작용에 따라 남성의 2차 성징을 유지하는 안드로겐(안드로스테론·테스토스테론 등), 여포에서 생성되며 여성의 2차 성징을 유지하는 에스트로겐(에스트라디올 등), 난소의 황체에서 분비되며, 자궁에서 임신이 되도록 하고 임신을 유지시켜주는 게스토겐(프로게스테론 등), 단백질을 포도당과 간의 글리코겐으로 전환시키는 당질 코르티코이드(코르티손·하이드로코르티손 등), 생체내 전해질과 수분의 균형 유지에 매우 중요한 역할을 하는 무기질코르티코이드(디옥시코르티코스테론·알도스테론 등)의 약 5종류로 구분된다.

현대 문명 발달에 따른 스트레스의 증가와 환경 호르몬 등의 영향으로 인해 인체 내에서 상기 호르몬의 균형이 깨지고 있으며 이에 따라 많은 질병들이 발생하고 있고, 상기 질병의 치료제 또는 보조 치료제로서 전술한 스테로이드 호르몬 제제가 광범위하게 사용되고 있는 실정이다. 특히, 합성된 에스트로겐은 인공 수정, 불임 환자의 시술 및 치료시 필수적으로 사용되며, 또한 당질 코르티코이드는 단백질을 소모하여 체내의 글리코겐 저장을 유지시키는데, 마취효과가 있어서 홍채염(虹彩炎)이나 관절염과 같은 여러 염증의 통증을 덜어주는 역할을 한다. 또한, 치명적이라 알려진 아디손병은 디옥시코르티코스테론과 하이드로코르티손을 투여함으로써 치료할 수 있게 되었다.

전술한 바와 같이 수요가 증대된 스테로이드 호르몬의 합성을 위해 다양한 연구가 시도되어 왔는데, 이 중 한가지 방법이 미생물을 사용하여 스테로이드 호르몬 전구체를 생산하는 방법이다. 마모리 및 베르세론(Mamoli 및 Vercellone, Ber. 70470, Ber. 702079, 1937년)은 효모발효를 통해 17-케토스테로이드(17-ketosteroids)가 17-베타-히드록시(17-beta-hydroxy)로 전환됨을 보고하였다. 또한, 미국특허 제2,602,769호에서는 피터슨 및 머레이(1952년)가 라이조푸스 (Rhizopus)를 이용하여 호르몬을 생산하는 방법에 대하여 기술하였으며, 크레이치(Kraychy; 1972년)등은 미국특허 제3,684,657호에서 미코박테리움을 이용한 방법에 대하여 기술하였다.

또한, 상기 스테로이드 호르몬의 대량 생산을 위해 스테롤을 유일 탄소원으로 사용하는 미생물의 탐색과 기질로 사용되는 스테롤을 변형시키는 연구가 진행되었으며, 스테롤의 핵 분해를 막는 금속 흡착제, 금속, 금속 환원제와 같은 화학적 첨가물을 사용하여 수득율을 높이기 위한 연구도 상당 부분 진행이 되었다(Marsheck등, Applied microbiology, 23(1), 72-77, 1972년). 또한, 생산성 증대를 위해 토양에서 분리된 미생물들을 물리 화학적으로 처리하여 돌연변이주를 유도하는 연구도 진행되었는데, 미국특허 제4,293,644호에서 Upjohn(1981년)은 미코박테리움(ATCC 29472)의 돌연변이 균주를 제조하여 다양한 스테롤로부터 AD로 생물전환을 유도하는 방법에 관하여 기술하고 있다.

전술한 스테로이드 호르몬의 전구체 중 AD/ADD는 스테로이드 의약품의 출발이 되는 중요한 물질로서, 스테로이드 호르몬 의약품 시장의 증가에 따라 상기 물질의 대량 생산을 위한 방법이 요구되고 있는 실정이다. 이에 따라 스테롤로부터 AD/ADD로의 전환능이 높은 미생물의 필요성이 증대되고 있으나, 현재까지 일정 수준 이상의 AD/ADD로의 전환능을 갖는 미생물은 알려져 있지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들이 광범위한 연구를 수행한 결과, 미코박테리움 포르튜이툼(ATCC 29472)의 돌연변이주인 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119이 기존의 미생물과 비교하여 스테롤로부터 AD/ADD로의 뛰어난 전환능을 가짐을 확인하였고, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 스테롤로부터 AD/ADD로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 스테롤로부터 AD/ADD로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 스테롤로부터 AD/ADD로의 뛰어난 전환능을 가지는 미생물을 사용한 AD/ADD의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미생물은 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119 (기탁번호: KCCM-10259)이다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 미생물 제조 방법은 미코박테리움 포르튜이툼(ATCC 29472)을 스테롤이 포함된 배양 배지 내에서 배양하는 단계; 배양된 상기 미코박테리움 포르튜이툼을 NTG로 처리하는 단계; 및 상기 NTG 처리된 균주들을 스테롤 또는 AD/ADD 0.1∼2 g/ℓ가 첨가된 배지에 각각 배양시켜 스테롤 첨가 배양 배지에서 성장 속도가 빠르고 AD/ADD 첨가 배지에서는 성장속도가 느린 균주를 선별하는 단계로 이루어진다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 AD/ADD의 제조방법은 스테롤을 포함하는 액상 배지 하에서 상기 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119를 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지내 AD/ADD를 회수하는 단계로 이루어진다.

도 1은 본 발명의 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum) EUG-119 배양 배지내 AD, ADD의 농도를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 미생물 제조를 위해 사용된 미코박테리움 포르튜이툼(ATCC 29472) 균주는 콜레스테롤 자화능과 스테로이드 전환능을 갖고 있다.

본 발명의 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119를 제조하기 위하여 먼저, 상기 미코박테리움 포르튜이툼(ATCC 29472) 균주를 사멸율 99.9% 범위의 NTG (Nitrosoguanidine)로 처리한다. 상기 NTG는 미생물의 돌연변이주 제조시 주로 사용되는 물질로서 구아닌(guanine)의 6번째 탄소를 메틸화하여 DNA 복제시에 GC 염기쌍을 AT 염기쌍으로 치환함으로써 돌연변이를 유발하며, 사용량은 O.D. 0.6∼0.8의 배양 배지 5㎖당 300∼400 ㎍/㎖, 바람직하게는 330 ㎍/㎖이다. 돌연변이를 위해서 본 발명에서 사용된 NTG 처리 방법이외에도 자외선 조사, INH(Isoniazid) 및 기타의 화학물질을 처리하는 등의 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다.

상기 NTG 처리된 균주 중 스테롤이 함유된 고체 배지 상에서 성장이 우수하고 ADD/AD가 첨가된 고체 배지에서는 상대적으로 성장이 느린 균주를 2차 선별한 다음 최종적으로 플라스크에서 배양하여 가장 전환율이 높은 균주를 선별함으로써 본 발명의 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119를 얻는다.

상기 균주 선별을 위해 사용한 고체 배지내 각각의 스테롤 및 ADD, AD의 첨가량은 0.1∼2 g/ℓ, 바람직하게는 0.4∼0.6g/ℓ이다. 또한 상기 스테롤은 시토스테롤(sitosterol), 콜레스테롤 (cholesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 및 캄페스테롤(campesterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 가능하나, 콜레스테롤이 바람직하다.

전술한 방법으로 제조된 본 발명의 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119는 2001년 4월 14일자로 한국 종균협회 부설 한국 미생물 보존 센터에 기탁번호 KCCM 10259로 기탁되었다.

본 발명의 일 실시예에서는 제조된 돌연변이 균주 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119를 배양하여 콜레스테롤의 AD/ADD로의 전환능을 측정한 결과 돌연변이주가 모균주에 비해 소규모 배양시에는 약 2.3배, 대규모 배양시에는 약 4.2배 정도 높은 AD/ADD로의 전환율을 나타냄을 확인하였다. 또한, 본 발명의 돌연변이 균주 배양액 2 ℓ로부터 AD/ADD의 분리정제를 시도한 결과 약 80%정도의 정제 수율을 나타냄을 확인하였으며, 배양 기간 동안 AD/ADD의 농도 변화를 살펴본 결과 배양 후 2일 정도부터 배지에서 표준시료와는 다르게 고농도로 AD/ADD가 형성됨을 확인할 수 있었다.

따라서 상기 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119는 AD/ADD의 대량 생산시 사용될 수 있는데, 그 구체적인 방법은 스테롤을 포함하는 액상 배지 하에서 상기 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119를 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지내 AD/ADD를 회수하는 단계로 이루어진다.

결과적으로 본 발명의 돌연변이주 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119를 스테로이드 호르몬 합성의 전구체로 사용되고 있는 AD/ADD의 제조를 목적으로 사용할 경우 AD/ADD를 고수율로 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

돌연변이 균주의 제조

돌연변이를 유발시키기 위해 YNG 배지에 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum; ATCC 29472) 균주를 접종하고 OD 0.6∼0.8될 때까지 배양한 후 5 ㎖을 취하고 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 얻어진 펠렛을 0.5% 트윈 80(Tween 80)이 함유된 멸균 0.1 M 구연산 나트륨(sodium citrate) 완충용액(pH 5.6)으로 2회 세척한 후 다시 5 ㎖의 완충용액에 현탁시킨 후 NTG 최종농도가 330 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. NTG 처리된 균주 현탁액을 37℃ 배양기에서 90분 동안 회전시키면서 반응시킨 후 다시 원심분리 하고 멸균된 0.1M 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)으로 3회 세척한 후 적당량의 완충 용액에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 SM1 고체 배지에 도말하고 3∼4일간 배양한 다음 생성된 콜로니를 선별작업에 사용하였다.

실시예 2

돌연변이 균주의 선별

상기 실시예 1의 SM1 배지에 형성된 콜로니를 MS1, MS1+chol,MS1+ADD(AD), YNG 고체 배지에 각각 접종한 다음 30℃에서 3일간 배양하여 콜레스테롤이 함유된 배지(MS1+chol)에서 성장이 우수한 반면 ADD나 AD가 함유된 배지에서는 성장속도가 느린 균주를 선별하였고, 상기 선별된 균주는 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum) EUG-119라 명명하였다. 상기에서 MS1 배지는 최소 무기물 배지로서 대조구로 사용되었으며, 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 사용한 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.

성 분	배 지 (%)
성 분	YNG	SM1	MS1	SM4(발효배지)
효모 추출물	0.1			0.5
영양 성분	0.8
글리세롤	0.5	1
트윈 80	0.1			0.01
NaCl			0.0005
K₂HPO₄		0.05	0.02	0.04
KH₂PO₄				0.08
NH₄Cl		0.1
MgSO₄7H₂O		0.05	0.25	0.2
FeCl₃6H₂O		0.005
NH₄NO₃			0.1
FeSO₄7H₂O			0.0001	0.0005
초산암모늄(Ammo-nium acetate)				0.15
ZnSO₄7H₂O				0.0002
MnCl₄4H₂O				0.00005
글루코오즈				1
아가		1.5	1.5
pH	7.0			7.5

실시예 3

돌연변이 균주의 AD/ADD로의 전환능 확인

상기 실시예 2에서 선별된 돌연변이 균주 미코박테리움 포르튜이툼 EUG- 119를 YNG 배지 5 ㎖에 전배양하였고, 100 ㎖ 플라스크 배양을 위해 포도당 10 g/ℓ, 질소원 5 g/ℓ, 각종 무기염, 트윈 80 0.1g/ℓ의 조성으로 조제된 SM4 발효배지(표1 참조)를 사용하였으며 30℃, 200 rpm의 조건으로 120 시간 동안 배양하였다. 콜레스테롤은 배지 중에 분산이 용이하지 않으므로 아세톤 분산용액을 만들어 1 g/ℓ의 농도가 되도록 첨가하여 사용하였고, AD/ADD 생성량은 배양 배지를 에틸에테르와 석유에테르로 추출한 후 2-프로판올(2-propanol)에 녹여 고압 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 또한, 대조군으로 사용한 미코박테리움 포르튜이툼 및 돌연변이 주의 AD/ADD로의 전환율은 생산된 AD/ADD의 몰농도와 첨가된 콜레스테롤 몰농도의 비율로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	정상형	돌연변이
수득율(Molar %)	27	64
최대 생산율(㎎/ℓ)	199	472

*상기 전환율= 생성된 호르몬 중간체 몰비/첨가해준 콜레스테롤 몰비

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 돌연변이주가 모균주에 비해 약 2.3배 정도 높은 AD/ADD로의 전환율을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4

실시예 3과 동일한 방법으로 100 ㎖ 플라스크에 전배양된 균주를 5 ℓ 발효기내에 멸균 준비된 2.5 ℓ 배지에 접종하여 30℃, 600 rpm, pH 8, 1 vvm의 조건으로 120 시간 동안 배양하였다. 콜레스테롤은 아세톤 분산용액을 만들어 최종농도가 5 g/ℓ가 되도록 첨가하여 사용하였고, AD/ADD로의 전환율은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 측정하였으며 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

	정상형	돌연변이
수득율(Molar %)	14	59
최대 생산율(㎎/ℓ)	510	2,177

상기 표 3에 나타난 바와 같이 돌연변이주의 경우가 모균주에 비해 약 4.2배 정도의 높은 전환율을 나타냄을 확인하였다.

실시예 5

상기 실시예 4에서 얻은 배양액 중에 존재하는 호르몬 중간체인 AD/ADD를 정제하기 위해 발효 배양액 2.5 ℓ를 pH 3으로 맞추고 5000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 생물질(biomass)만을 회수한 후 70% 아세톤으로 추출하고 여과, 증발시킨후 5∼10℃에서 방치하여 호르몬의 침전을 유도하였다. 침전된 호르몬을 여과하여 55℃에서 건조시키고, 건조된 호르몬 혼합물에 헥산을 처리하여 잔존하는 콜레스테롤을 제거하고 여과, 증발하여 조정제된 호르몬을 회수하였고, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

	양 (g)	수득율 (%)
배양액	5.2	100
아세톤 추출후	4.6	88
조정제된 호르몬	4.2	81

상기 표4에 나타난 바와 같이, 배양액 2.5 ℓ로부터 분리정제를 시도한 결과 약 80%정도의 정제 수율을 나타내었다.

실시예 6

미생물에 의해 생성되는 호르몬 중간체의 농도는 HPLC를 이용하여 측정하였다. 세포와 배양액 혼합물을 4배 부피의 디에틸 에테르(diethyl ether):페트롤리움 에테르(petroleum ether)=1:1 혼합 용매로 1차 추출한 후 같은 4배 부피의 용매로 2차 추출을 수행하고 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 추출된 호르몬을 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)로 현탁시킨 후 호르몬 정량을 위한 시료로 사용하였다. 호르몬 측정을 위한 컬럼은 Pegasil ODS(4.6 × 250), 5 μm, 120Å (Senshu Pak, Japan)을 사용하였으며, 유속(flow rate) 1.0 ㎖/min, 2,700 psi, 250 ㎚의 조건에서 수행하였으며 이때 이동상(mobile phase)은 50%-THF를 사용하여 HPLC에서 분석하였다(도 1 참조).

그 결과 배양 후 2일 정도부터 배지에서 AD, ADD 표준시료와 비교하여 고농도로 AD/ADD가 형성됨을 확인할 수 있었다.

실시예 7

상기 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119의 균학적 성질을 공지의 방법으로 확인하였다.

상기 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119는 30∼35℃ 범위에서 생장가능하며 탄소원으로 포도당, 글리세롤 등 다양한 다당류와 오일, 지방산 및 스테롤 등을 이용한다. 그람 양성이고 세포벽 성분에 지방질을 다량함유하고 있어 군집을 형성하면서 생장하고 군집은 노란색을 띤다.

결과적으로 공지의 미코박테리움 포르튜이툼 ATCC 29472와 형태학적·생리학적인 큰 차이는 보이지 않지만 스테롤 자화능과 AD/ADD의 생산능이 우수하다는 장점을 지니고 있다.

상기 실시예에서 본 바와 같이, 본 발명의 미생물은 공지의 미생물과 비교하여 스테롤로부터 스테로이드 호르몬의 전구체인 AD/ADD로의 전환능이 월등히 뛰어나므로 스테로이드 호르몬의 대량 제조시 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

시토스테롤(sitosterol), 콜레스테롤 (cholesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 및 캄페스테롤(campesterol)로 이루어진 군으로부터 선택된 스테롤로부터 AD(Androst-4-ene-3,17-dione)/ADD(Androsta-1,4-diene-3,17-dione)로의 전환능을 갖는 미코박테리움 포르튜이툼(Mycobacterium fortuitum; ATCC 29472)의 돌연변이주 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119(기탁번호: KCCM-10259).
삭제
미코박테리움 포르튜이툼(ATCC 29472)을 스테롤이 포함된 배양 배지 내에서 배양하는 단계; 배양된 상기 미코박테리움 포르튜이툼을 NTG(Nitrosoguanidine)로 처리하는 단계; 및 상기 NTG 처리된 균주들을 스테롤 또는 AD/ADD 0.1∼2 g/ℓ가 첨가된 배지에 각각 배양시켜 스테롤 첨가 배양 배지에서 성장 속도가 빠르고 AD/ADD 첨가 배지에서는 성장속도가 느린 균주를 선별하는 단계를 포함하는 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119(기탁번호: KCCM-10259)의 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 스테롤은 시토스테롤(sitosterol), 콜레스테롤 (cholesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 및 캄페스테롤(campesterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
스테롤을 포함하는 액상 배지 하에서 상기 미코박테리움 포르튜이툼 EUG-119(기탁번호: KCCM-10259)를 배양하는 단계; 및 상기 배양 배지내 AD/ADD를 회수하는 단계를 포함하는 AD/ADD의 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 스테롤은 시토스테롤(sitosterol), 콜레스테롤 (cholesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 및 캄페스테롤(campesterol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.