JPH0117678B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ペニシリウム・オキザリカム
（Penicillium oxalicum）種またはアスペルギル
ス・テレウス（Aspergillus terreus）種に属す
る微生物によつて、デヒドロエピアンドロステロ
ンまたはその誘導体を1α−ヒドロキシル化する
ことにより1α−ヒドロキシデヒドロエピアンド
ロステロンを製造する方法に関するものである。

従来より、リゾクトニア属、カロネクトリア
属、グロメレラ属、アスペルギルス属、コルチシ
ウム属、セプトミキサ属、ムコール属、イサリア
属、イルペツクス属またはフサリウム属に属する
微生物によつて、17β−ヒドロキシ−17α−置換
または未置換−４−エストレン−３−オンを、
1α−ヒドロキシル化することによつて、1α，17β
−ジヒドロキシステロイド類を製造する方法が知
られていた（参照：特開昭51−63990号公報明細
書）。しかしながら、これらすべての微生物は、
アスペルギルス・テレウス種を除き、デヒドロエ
ピアンドロステロンを1α−ヒドロキシル化する
ことができない。この事実は、ステロイド類の
1α−ヒドロキシル化は、本質的に使用する微生
物および基質の組み合わせを最適に選択しなけれ
ば行なうことができないことを示している。実際
に実施可能な組み合わせを見い出すことは極めて
困難である。

前記明細書によれば、アスペルギルス・クラバ
ツスATCC9598、アスペルギルス・フミガツス・
ムート・ヘルボラCBS110.46およびアスペルギル
ス・コニクスIFO−4047は、３−位にオキソ基を
有し、４−位および５−位間に二重結合を有し、
更に17β−位にヒドロキシ基を有するステロイド
類の1α−ヒドロキシル化を行なうことができる。
しかしながら、これらの微生物は、３−位にヒド
ロキシ基を有し、５−位および６−位間に二重結
合を有し、更に17−位にオキソ基を有するデヒド
ロエピアンドロステロンまたはその誘導体の1α
−ヒドロキシル化を行なうことができない。

本発明方法は、ペニシリウム・オキザリカム種
またはアスペルギルス・テレウス種に属する微生
物によつてデヒドロエピアンドロステロンまたは
その誘導体を1α−ヒドロキシル化することを特
徴とするものであり、本発明方法により1α−ヒ
ドロキシデヒドロエピアンドロステロンを得るこ
とができる。

本発明方法において使用する基質は、デヒドロ
エピアンドロステロンまたは、その３−位にたと
えばアセトキシのようなアシル基を有する誘導体
である。

本発明においては、デヒドロエピアンドロステ
ロンまたはその誘導体を1α−ヒドロキシル化し
得る、ペニシリウム・オキザリカム種またはアス
ペルギルス・テレウス種に属するすべての菌株を
使用することができる。好ましい菌株は、ペニシ
リウム・オキザリカムIFO−5748「微工研菌寄第
4727号」、ペニシリウム・オキザリカムIFO−
6579「微工研菌寄第4728号」、ペニシリウム・オキ
ザリカムIFO−7000「微工研菌寄第4729号」、ペニ
シリウム・オキザリカムIFO−7085「微工研菌寄
第4730号」、アスペルギルス・テレウスIFO−
6123「微工研菌寄第4726号」およびそれらの変異
株などである。

以下の菌株は、ペニシリウム属およびアスペル
ギルス属に属するが、デヒドロエピアンドロステ
ロンまたはその誘導体の1α−ヒドロキシル化を
行なわない：ペニシリウム・ベルキユロサム、ペ
ニシリウム・ノタータム、ペニシリウム・クリソ
ゲナム、ペニシリウム・デカンベンス、ペニシリ
ウム・フエルタナム、ペニシリウム・フリクエン
タンス、ペニシリウム・パープレセンス、ペニシ
リウム・ターリコウスキー、ペニシリウム・リラ
キノ−エキニユラータム、ペニシリウム・マルチ
カラー、ペニシリウム・シンプリシシマム、ペニ
シリウム・ハ−クエイ、ペニシリウム・インプリ
カータム、ペニシリウム・ジヤンチネラム、ペニ
シリウム・チヤールシー、ペニシリウム・シトレ
オ・ビリデ、ペニシリウム・コリロフイロイデ
ス、ペニシリウム・シアネアム、ペニシリウム・
アダメチ、ペニシリウム・アエネアム、ペニシリ
ウム・トーミイおよびペニシリウム・スクレロチ
オーラム：アスペルギルス・フラバス、アスペル
ギルス・ウスツス、アスペルギルス・クラバツ
ス、アスペルギルス・パラシチクス、アスペルギ
ルス・コニクス、アスペルギルス・カルネウスお
よびアスペルギルス・フミガツス。従つて、本発
明方法において使用される微生物はペニシリウ
ム・オキザリカムまたはアスペルギルス・テレウ
スであることが肝要である。

微生物は、培養液、菌体またはそれらの処理物
の状態で使用することができる。培養液は、好適
な培地に上記微生物を接種することによつて調整
することができる。培地は、炭素源、窒素源、無
機塩および微生物の生育に好適な他の栄養物を含
むことができる。炭素源としては、例えばブドウ
糖、蔗糖、デキストリン、マンノース、殿粉、乳
糖およびグリセリンであり、また；窒素源として
は、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コ
ーンスチープリカーおよびカゼインなどの窒素含
有有機物質、または例えば硝酸塩および無機アン
モニウム塩などの窒素含有無機物質などである。
無機塩の例としては、リン酸塩またはナトリウ
ム、カリウム、マンガン、マグネシウム、鉄もし
くは銅の塩類である。

微生物の培養は、深部培養法、振盪培養法また
は静置培養法によつて行なうことができる。好ま
しい実施態様においては、微生物の培養は好気的
条件下において行なわれる。

本発明方法は、デヒドロエピアンドロステロン
またはその誘導体を基質として培養液に添加する
ことによつて実施するのが好適である。基質の濃
度は、通常、１−15ｇ／であり、好ましくは１
−10ｇ／である。1α−ヒドロキシル化は、先
に述べた条件下において、微生物の培養を継続す
ることによつて行なうことができる。培養時間
は、使用する微生物、培地の組成、使用する基質
およびその濃度によつて異なるが、一般に、１−
10日間の培養時間で充分である。培養温度は一般
には20℃ないし30℃の範囲である。更に、培養は
PH４ないしPH９の範囲で行なうのが好適である。

培養中の培養液に基質を添加する時期の選択
は、1α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステ
ロンを高収率で得るために重要である。炭素源が
ほぼ完全に消費された時、基質を培養中の培養液
に添加した場合、高率転換を行なうことができ
る。

別法として、本発明による1α−ヒドロキシル
化は、微生物の培養液から単離した菌体または培
養液もしくは菌体からそれ自体公知の方法によつ
て調整した酵素抽出物によつても行なうことがで
きる。この場合、1α−ヒドロキシル化は、溶液
中、例えば緩衝液中、生理食塩水中、新鮮栄養液
中または水中で好適に行なうことができる。

基質としてのデヒドロエピアンドロステロンま
たはその誘導体は、微粉末状もしくはアセトン、
ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノー
ル、エチレングリコール、プロピレングリコール
またはジオキサンなどの親水性溶媒の溶液の状態
で添加することができる。また別法としては、界
面活性剤または分散剤の基質の懸濁水溶液に添加
することができ、あるいは基質を、超音波処理す
ることによつて乳濁させることもできる。

前述のデヒドロエピアンドロステロンの誘導体
例えばデヒドロエピアンドロステロン−３−アセ
テートを本発明方法における基質として使用した
場合でも、1α−ヒドロキシデヒドロエピアンド
ロステロンを得ることができる。

このようにして得られた1α−ヒドロキシデヒ
ドロエピアンドロステロンは、それ自体公知の方
法；例えばクロロホルム、メチレンクロライド、
および酢酸エチル等の水に混和しない有機溶媒に
よる溶媒抽出法、または酸化アルミニウム、シリ
カゲルもしくはセルロースなどの担体上でのクロ
マトグラフイー法によつて、培養混合物または反
応混合物から単離することができる。

このようにして単離された生成物は、例えばメ
タノール、エタノール、酢酸エチル、ベンゼン、
およびアセトンなどで再結晶することによつて精
製することができる。

本発明方法によつて得られた1α−ヒドロキシ
デヒドロエピアンドロステロンは、ビタミンD₃
誘導体類およびその他の医薬品の合成と中間体と
して有用である。

本発明を以下の実施例によつて説明する。

実施例 １ ブドウ糖１％およびコーンスチープリカー１％
から成る培地100mlを含有する500mlフラスコを、
120℃で20分間オートクレーブにかけた。オート
クレーブにかける前、培地のPHを6.5に調整した。
冷却後、フラスコにペニシリウム・オキザリカム
IFO−7000「微工研菌寄第4729号」の寒天斜面培
養の胞子を植菌した。

その後、フラスコを振盪撹拌機上、26.5℃で２
日間培養した。0.1％トウイーン80溶液に懸濁し
超音波処理したデヒドロエピアンドロステロンを
最終濃度が１当り５ｇになるようにフラスコに
添加し、前記と同様の条件下、培養を３日間継続
した。

それらのサンプル10mlを分取し、その３倍量の
酢酸エチルと撹拌することによつて抽出した。抽
出物の一部を、シリカゲルおよびクロロホルム−
アセトン（２：１）から成る溶液およびシクロヘ
キサン−トルエン−エタノール（８：２：2.5）
から成る溶液を使用する薄層クロマトグラフイー
およガスクロマトグラフイーで分析した。

1α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロ
ンの収率は、45.0％であつた。

実施例 ２ 実施例１に述べたと同様の方法で、粉末状の基
質（５ｇ／の濃度）を使用し、30.2％の収率で
1α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロン
を得た。

実施例 ３ 実施例１に述べたと同様の方法で、３ｇ／お
よび７ｇ／の基質濃度で、それぞれ36.3％およ
び26.5％の収率で1α−ヒドロキシデヒドロエピア
ンドロステロンを得た。

実施例 ４ 実施例１に述べたと同様の方法で、１当り３
ｇのデヒドロエピアンドロステロン−３−アセテ
ートを使用し、32％の収率で1α−ヒドロキシデ
ヒドロエピアンドロステロンを得た。

実施例 ５ 実施例１に述べたと同様の方法で、ペニシリウ
ム・オキザリカムIFO−5748「微工研菌寄第4727
号」、ペニシリウム・オキザリカムIFO−6579「微
工研菌寄第4728号」およびペニシリウム・オキザ
リカムIFO−7085「微工研菌寄第4730号」を使用
し、それぞれ24.0％、23.2％および32.0％の収率
で1α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロ
ンを得た。

実施例 ６ ブドウ糖１％およびコーンスチープリカー１％
から成る培地100mlを含有する500mlフラスコにア
スペルギルス・テレウスIFO−6123「微工研菌寄
第4726号」の胞子を植菌し、26.5℃で２日間振盪
した。0.1％トウイーン80の２ml溶液に懸濁し超
音波処理したデヒドロエピアンドロステロン100
mgをフラスコに添加し、培養を継続した。培養２
日後、培地中に1α−ヒドロキシデヒドロエピア
ンドロステロンを検出し、その単離および同定を
行なつた。

実施例 ７ ブドウ糖１％およびコーンスチープリカー１％
から成り滅菌前のPHを6.5に調整した培地100mlを
含有する500mlフラスコにペニシリウム・オキザ
リカムIFO−7000「微工研菌寄第4729号」の斜面
培養を植菌し、26.5℃で２日間振盪した。滅菌前
の培地容量、３を含有する５ジヤーフアーメ
ンターに前記方法で得られた培養液を植菌した。
300rpmで撹拌しがら、1vvmの通気下、26.5℃で
37時間培養した。

0.1％トウイーン80溶液300ml中にデヒドロエピ
アンドロステロン15ｇを含有し10分間超音波処理
した懸濁液をフアーメンターに添加した。前記と
同様の条件下、培養を更に79時間継続した。培地
中1α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロ
ンの生産量は、5.36ｇに達した。

取り出した培養液を酢酸エチル３で抽出し、
菌体をろ過によつて分離した。菌体の含水アセト
ン抽出液を濃縮してアセトンを除去し、再び酢酸
エチルで抽出した。第１回目の抽出の水層を酢酸
エチルで再抽出した。集めた抽出物を減圧下、濃
縮して少容量にした。3.82ｇの固体生成物をフイ
ルター上に採取した。該固体生成物をメタノール
および酢酸エチルの混合液から結晶させることに
よつて、融点約279℃の精製された1α−ヒドロキ
シデヒドロエピアンドロステロン2.56ｇを得た。

一方、前述のろ過および結晶中に集めた母液を
濃縮して乾燥し、シリカゲル上でカラムクロマト
グラフイーを行つたカラムをアセトンおよびクロ
ロホルムの混合液で溶出した。溶出中、アセトン
の割合を徐々に増加せしめた。このようにして融
点278.5℃の1α−ヒドロキシデヒドロエピアンド
ロステロン1.5ｇを得た。

実施例 ８ 培地（ブドウ糖１％、コーンスチープリカー１
％、PH6.5）100mlをそれぞれ含有する10個の500
mlフラスコにペニシリウム・オキザリカムIFO−
7000「微工研菌寄第4729号」の斜面培養の胞子を
植菌し、26.5℃で２日間振盪培養した。培養をろ
過し菌体を集めた後、滅菌水で洗浄した。洗浄し
た菌体を、0.85％生理食塩水１と共にCaCO₃10
ｇおよびデヒドロエピアンドロステロン１ｇを含
有する５フラスコに添加した。フラスコを振盪
しながら26.5℃で20時間培養した。この時、添加
したデヒドロエピアンドロステロンの35％が相当
する1α−ヒドロキシ−化合物に変換した。反応
混合物を酢酸エチル１で抽出し、菌体をろ過に
よつて除去した。無水硫酸ナトリウムで脱水した
後、濃縮して固体とし、それをシリカゲルカラム
にかけた。カラムをアセトンおよびクロロホルム
の混合液で溶出した。溶出中、アセトンの割合を
徐々に増加せしめた。このようにして融点278.5
℃の純粋な1α−ヒドロキシデヒドロエピアンド
ロステロン230mgを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ デヒドロエピアンドロステロンまたはその誘
   導体を、ペニシリウム・オキザリカム種もしくは
   アスペルギルス・テレウス種に属する微生物、ま
   たはその微生物の培養液から分離した菌体によつ
   て、1α−ヒドロキシル化することを特徴とする
   1α−ヒドロキシデヒドロエピアンドロステロン
   の製造方法。 ２ 微生物がペニシリウム・オキザリカムIFO−
   5748「微工研菌寄第4727号」、ペニシリウム・オキ
   ザリカムIFO−6579「微工研菌寄第4728号」、ペニ
   シリウム・オキザリカムIFO−7000「微工研菌寄
   第4729号」、ペニシリウム・オキザリカムIFO−
   7085「微工研菌寄第4730号」またはアスペルギル
   ス・テレウスIFO−6123「微工研菌寄第4726号」
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ３ デヒドロエピアンドロステロン誘導体がデヒ
   ドロエピアンドロステロン−３−アセテートであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ４ 基質を該微生物で変換させることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５ 炭素源がほぼ完全に消費された時、基質を微
   生物の培養液に添加し、変換させることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ６ 基質の濃度が１−15ｇ／であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７ 炭素源がほぼ完全に消費された時、基質を１
   −15ｇ／の濃度で微生物の培養液に添加するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ８ 基質を溶液中において、菌体で処理すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。