NL8702758A

NL8702758A - Microbiologische werkwijze voor de bereiding van 9alfa-hydroxy-4-androsteen-3, 17-dion.

Info

Publication number: NL8702758A
Application number: NL8702758A
Authority: NL
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1986-11-18
Filing date: 1987-11-18
Publication date: 1988-06-16
Also published as: IT8767940A0; GB8726949D0; ATA304487A; HU196627B; US5004695A; GB2197869B; DE3739017C2; AT396480B; GB2197869A; DE3739017A1; HUT46077A; IT1218692B; JPS6485099A

Description

* NL 34633-Kp/dJ/ab *

Microbiologische werkwijze voor de bereiding van 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor de bereiding van 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion door de microbiologische zijketen-afbraak van sterolen van natuurlijke oorsprong.

5 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion is het belangrijk ste uitgangsmateriaal bij de synthese van corticosteroïde genees- middelen [ V. van Rheenen, K.P. Shepard: J. Grg. Chem., 44, 1582 (1979) J.

In de octrooiliteratuur zijn methoden beschreven voor 10 de bereiding van 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion via microbiologische hydroxylatie van steroïden met een androstaan-skelet. Door het hydroxyleren van 4-androsteen-3,17-dion met Nocardia spp., voorbeeld Nocardia corallina (Brits octrooi-schrift No. 862.701) en Nocardia canicruria (US-octrooischrift 15 No. 4.397.947) of met Corynebacterium equi (JP-octrooiaanvrage No. 79-147998) wordt 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion gevormd.

Een Corynespora cassiicola fungus van de Caliciales genus hydroxyleert 4-androsteen-3,17-dion in de 9a-positie (JP octrooiaanvrage No. 80-77897) terwijl Circinella muscae van de 20 Mucorales genus testosteron omzet in 9a-hydroxy-4-androsteen--3,17-dion [ P.G. Rao: Indian J. Chem., 3., 314 (1963) J.

Recentelijk wordt 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion bereid door de microbiologische transformatie van sterolen van dierlijke of plantaardige oorsprong. In de octrooiliteratuur 25 wordt deze transformatie uitgevoerd met behulp van de volgende micro-organismen: Mycobacterium fortuitum (ÜS octrooischriften No. 4.175.006 en 4.035.236), Mycobacterium parafortuitum (JP octrooiaanvrage No. 80-138395) en Mycobacterium vaccae (JP octrooiaanvrage No. 80-085397 en No. 82-0879).

30 Sterolen, in het bijzonder die van plantaardige ori gine (β-sitosterol, campesterol), zijn goedkope en gemakkelijk toegankelijke uitgangsmaterialen. Dienovereenkomstig kan de bereiding van 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion door de afbraak van sterolen in economisch opzicht zeer voordelig zijn.

35 Tijdens de industriële realisatie van de bovenge noemde sterolenafbraakmethoden hebben deze echter het nadeel, dat de methoden gepaard gaan met lange fermentatieperioden naast een relatief lage produktieopbrengst voor 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion.

. 6 ; ö 2 7 5 £

It - 2 -

Tijdens het onderzoek volgens de uitvinding werden sitosterol afbrekende micro-organismen geïsoleerd uit diverse grondmonsters volgens de procedure ontwikkeld door G.E.

Peterson et al. / J. Lipid Research 3, 275 (1962) /. Uit deze 5 sterol-benuttende micro-organismen werd een Mycobacterium stam gekozen, terwijl zijn mutanten werden bereid door de mutagene behandeling van de verkregen sferoplasten onder toepassing van een methode, die volgens de onderhavige uitvinders eerder werd ontwikkeld. In het verloop van deze methode werd de uitgekozen 10 stam gekweekt in een glycine en vancomycine bevattend medium, waarna de celwand van de micro-organismen werd afgebroken door een lisozym-behandeling, waarna de verkregen sferoplasten en/of protoplasten werden behandeld met N-methyl-N'-nitro-N-nitroso--guanidine in een medium, dat met saccharose osmolitisch werd 15 gestabiliseerd. Na mutagene behandeling werden de sferoplasten en/of protoplasten geïncubeerd in een osmotisch stabiel vast agarmedium bij een temperatuur, die optimaal was voor de groei van de bacterie voor het regenereren van de celwand.

Uit de geregenereerde bacterie-kolonies werden mutan-20 ten gekozen, die in staat waren de sterolzijketen te splitsen en tegelijkertijd steroïden met een androstaanskelet in een hoge opbrengst te vormen. De stammen werden gekozen door inocculeren van de bovengenoemde kolonies in minimale agarmedia met daarin natuurlijke sterolen (sitosterol, cholesterol) en 9 25 -hydroxy- -4-androsteen-3,17,dion, alsmede in agarmedia met daarin glycerol als koolstofbron. Stammen met een goede groei op media van respectievelijk glycerol en de sterolen, maar die niet groeiden op een 9 -hydroxy-4-androsteen-3,17-dion bevattend medium werden uitgekozen.

30 Van de langs deze methode verkregen isolaten werden 14.000 onderzocht op hun vermogen sterolen af te breken, waarbij die welke geen 1,2-steroïd-dehydrogenase-activiteit hadden en die in staat waren grote hoeveelheden 9 -hydroxy-4-andro-steen- -3,17-dion te vormen door transformeren van natuurlijke 35 sterolen werden geïsoleerd, terwijl de stam, die de hoogste opbrengst aan 9 -hydroxy-4-androsteen-3,17-dion gaf, daaruit werd gekozen. Als resultaat van het taxonomische analyse bleek deze stam te verschillen van elke bekende Mycobacterium spp., waarbij dus geconcludeerd werd, dat binnen 40 zijn genus een nieuwe species werd gevonden. De taxonomische . ε: c 2 7 5 8 % - 3 - eigenschappen van de nieuwe species werden vergeleken met die van de bekende sterol-afbrekende mycobacteria, zie in tabel A, waarin de nieuwe stam genoemd is als Mycobaterium roseum sp. no. 1108/1.

5 10 . P 7 "· ? 7 5 8 - 4 - ·=»

I ;; μ I I μ I I I

§ , I I I I I I I I I I

Φ I I [ I I I I I I I

8 I I I I I I I I I I

h ra I I I I I I [ I I I I

(D ΓΛ 0 fl -η 9 [ I I I i I i I I ! !

to Jj H

Η I i I i+i+l+l+l+l+l+l •Ö ω I '! '| '| +1 ΐ, il il il Jl il I I I I I I I I I i !

ffl w I I I I ] I 1 I I I

fi è I I I I I I I I I

Q> fi Q) S|gl I 1 I 1 I I I I I

Γ* Jj Sü I I ,1 |l ΐ I (V.. |! +1 ,1 ΐ· il C0rö φ ! o 8 Η I I I l+l , l+I l+l+l

- « I I I I I I I I I

. S a . ' ' ' ' Si , I I I I '

> » I § I I I i :¾ 1 . I I I I I

B 4J . Ü H I I +1 I Xjl I +1 I I I

ά g 3 I 1 I il 'I gl 1 'I il 'I 'I 'I

o 3 11111,11111

e h ^ I I I I I , I I ! I I

β Φ I

Φ I I I I 1 1 1 I 1 I

tn φ ^ 0 V fi I I I I I , I I I I 1 <3 M Ö <15

ω -hcd'^IIIII IIIII

rH g 0) · ill *Γ“1 O^1 4.4.4.1 4.4. 4.

8 3¾ s? § S i 1 '1 '1 11 i1 ί 1 ,1 :1 ίI , I ίI

•3 a S & ySo ί ί ί +1 +1 + ί +1 +1 ί +i φ H w υ to n -p Φ £111111111!

ο ω ϋ I

m Q) I I I [ I I I I I I

Λ tn I

0 I I I I 1 , I I i I I

ϋ cn

>10 I I I I i , I I I I I

a a)

o> > ί ί ί ί ί ί I r ί I

« o .38-, l+l l+l+l , ί +1 1 I I

> ^ . 8 I i I ' I il il 1 ' 1 I il 1 I 1 I 1 I

;3 ft ° n M I I I £ I I I I I I I I

β ra I I I 3 I I I I I I I I

m g 1 I I «Ί I I I I I I I

a) -Η 1 I I U| 1 1 I 1 I 1 1 ί ü SS 1 1 u' S' 1 S' Η I ® ι 3 Ιη 'h 1

•g S ï I ' -o' ' §< 11 §' S I S I S I

g -g 3 1 ' Λ 1 21 ι t1 '31 v ι S ι '51 3 1 nn O l l>il |(ϋ|ΐϋ|,-ι|β|Η|0|β| 5 P S 1 'ffi+i1 m'n'd'n'cd'ö’id) «3 g * ι (^ι-Η,^ι^ΐ'οι^ι^ι-Ηίει +) ni β β CD Η *Q f0 I I 0| 4J| O, Q, φ s > 'u'u'-h'm'o

rrj φ I Ο I Ο I Η I Ό I

Ö £ φ vd cd Ή >1 &> Φ S -Η I ι S| Λ| Λ| fi

i| R +) τι tö *H

Ή ί 1 8j' ω1 §[ a φ Η § 1 ·Η 1 -Η 1 g 1 β 1 >

6 0 & 1 8' 8' B' 8' S

φ -Ρ ·Η I ΜΙ Sil β| ^1 Ρ >01 ft 1 Ο* Ο* Μ* Β1 Ν

I I II I

Γ ' f. ? 7 Κ β m ° £ * V. ί W L. f ν - 5 - ; I ; ; ί I i ί

ffl , 1 I I

rl III

irt ί + + ί + ί + • g 1+,+1+1 + s ε ,+1+,+,+

1 I l I I

I '*< '

ί l <ϋ I I

A i: ί u 1: ί + S Ü I + I g I + I +

S I I I I

I I I I

till I lilt s-| * .1 ί1 .

S 5 I + I 1 + ί o III!

S ^ I I I I

ο I I 1 I

M III! > -a I + I + I + I + ~ s?® I + I + j + ! +

Cu I I I I

ω 1 I I I

3 I I I I

ε* ί ί I I

> [III

ε o i+i + s ® I + I I + I + to * I I I 1 Ο ÜI , , . i+l

MW I I l I

I I I I

I I I 0) I

1 ' 1 w 1

I 0) I Ο I Ο I

1 W 1 +> 1 tA 1 0) ί ο ί I ft) ί w 1 ö 1 Λ 1 Λ 1 ο

I β I Ml J) I H

1 id o' M 1 >i I ε [ ω I 4J I X in .6)02758 tr - 6 -

Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 is een nieuw taxon van de Mycobacterium genus die gedifferentieerd kan worden op het species niveau. Dit organisme, dat reeds bij 45°C geen proliferatie ondergaat kan duidelijk worden gedifferentieerd 5 van Mycobacterium phlei, zelfs bij 52°C actief, onder gebruikmaking van citraat en succinaat, onder vorming van een zuur op arabinose, galactose en mannitol, en onder oplevering van diep gele of oranje kolonies, en van Mycobacterium smegmatis, die wel kan groeien, evenzeer als Mycobacterium phlei, op succinaat, 10 citraat, zelfs op oxalaat en benzoaat, hetgeen Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 niet doet. Bovendien anders dan Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1, produceert Mycobacterium smegmatis een zuur op praktisch alle diagnostische koolstof-bronnen, zoals arabinose, galactose, sorbitol, mannitol, 15 inositol, en fructose. Mycobacterium smegmatisch kan hittebehandeling bij 60°C gedurende 4 uur niet doorstaan en produceert geen pigment. Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 kan ook worden gedifferentieerd van Mycobacterium fortuitum, die ook telkens kleurloze kolonies heeft en bij lage temperatuur 20 geen groei vertoont. Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 is een snel groeiend Mycobacterium met karakteristiek rode pigmentatie, het is psychrofiel (bestand tegen kou) en prolifereert zelfs bij 60°C in de vorm van rijpe rode kolonies, en terwijl typische Mycobacterium fortuitum stammen geremd 25 worden reeds bij 17°C. De 100 % helder rode endo-pigmentatie van kolonies en cultures van Mycobacterium roseum sp. nov.

1108/1 is van groot taxonomisch belang aangezien Good (1985) door onderzoek aan meer dan 500 Mycobacterium fortuitum stammen, geen enkele heeft gevonden met pigmentatie, waarbij 30 hij aannam, dat Mycobacterium fortuitum sp. geen pigmentatie en geen fotochromogenie vertoonden.

Het is een belangrijk aspect van verschil dat Mycobacterium fortuitum stammen op MacConkey agar een goede groei vertonen, terwijl Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 35 zelfs in sporen geen groei vertonen. Er is een belangrijk onderscheid tussen Mycobacterium fortuitum stammen en Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 met het oog op hittebestendigheid. Ofschoon Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 resistent is tegen koude temperaturen is dit ook hittebestendig. Behan-40 deling bij 60 °C gedurende 4 uur wordt door de gehele popula- Γ, ? ft fi 7 R ö . £· f v L / i) w \ - 7 - tie overleefd. Dezelfde hittebehandeling vernietigt volledig de celmassa van Mycobacterium fortuitum. Onder gebruikmaking van xylose als koolstofbron, dat geen substraat voor zuurproduktie door Mycobacterium fortuitum stammen is, blijkt Mycobacterium 5 roseum sp. nov. 1108/1 in staat te zijn zuur te produceren met tijdelijke variatie, d.w.z. dat de intensiteit van de zuurproduktie varieert tussen hoog en laag met perioden van diverse maanden. Tenslotte verschillen de gebruikelijke gele fotochro-mogene stammen van Mycobacterium vaccae en Mycobacterium para-10 fortuitum, die taxonomisch identiek zijn met de bronnen uit de literatuur, aanzienlijk van Mycobacterium roseum sp. nov, 1108/1, omdat zij in staat zijn citraat en succinaat te benutten, maar ze kunnen geen hittebehandeling van 60°C doorstaan en produceren zuur uit inositol en mannitol.

15 Op basis van de bovenaangegeven diagnotische patronen wordt aangenomen, dat de Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 de vertegenwoordiger is van een nieuwe snelgroeiende Mycobacterium species. Deze stam wordt aangegeven als "typische stam", terwijl de nieuwe species genoemd wordt als roseum 20 (d.w.z. Mycobacterium roseum sp. nov.). Het bijvoegelijke naamwoord "roseum" duidt op de karakteristieke rose tot heldere rode kleur van de species.

Tijdens de vergelijkende taxonomische studie van de nieuwe species en bekende Mycobacterium spp. werd de volgende 25 literatuur gebruikt: H.G. Good: Ann. Rev. Microbiol. _39/ 347-69 (1985) en Sergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, The Williams-Wilkins Company, Baltimore, 1975.

De taxonomische aspecten van Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 zijn weergegeven in Tabel B.

&; QL 75 8 f - 8 - *

Tabel B

Taxonomische studie van Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 N = negatief P = positief (P) = enigzins positief

5 gelatine hydrolyse N

zetmeel hydrolyse N

Tween-40 hydrolyse P

Tween-80 hydrolyse P

fosfatase activiteit P

10 catalase activiteit P

oxydase activiteit P

urease activiteit P

ammoniavorming uit

nitraat N

15 nitrietvorming uit

nitraat P

ontleding van

adenine P

ontleding van

20 esculine P

ontleding van

hypoxanthine N

ontleding van

xanthine N

25 tyrosine oplossing N

Gebruik als enige koolstofbron:

adoniet N

30 arabinose N

dulcitol N

fructose P

galactose N

glycerol P

35 glucose P

zetmeel N

inositol N

lactose N

c T ~ "3 S β „ b , v./ ö - 9 -

Tabel B (vervolg)

maltose N

5 mannitol N

mannose P

mucinezuur N

raffinose N

rhamnose N

10 xylose N

calciumlactaat P

natriumacetaat N

natriumbenzoaat N

natriumcitraat N

15 natriumgluconaat N

natriummalonaat N

natriumoxalaat N

natriumpyruvaat N

natriumsalicylaat N

natriumsuccinaat N

20

Gebruikt als enige stikstofbron:

ammoniumfosfaat P

ammoniumcarbonaat P

25 ammoniumchloride N

ammoniumnitraat P

ammoniumsulfaat P

calciumnitraat P

kaliumnitraat P

30

Zuurvorming op

adoniet P

arabinose N

35 dextrine N

dulcitol N

fructose P

galactose N

. < : Üi' 7 5 8 - 10 -

Tabel B (vervolg)

glycerol P

glucose P

5 inositol N

inuline N

zetmeel N

lactose N

mannitol N

mannose P

10 melicitose N

raffinose N

saccharose P

salicine (P)

sorbitol P

15 sorbose N

trehalose P

xylose P (tijdelijke variatie)

Groei op 20

2 % NaCl P

4 % NaCl P

6 % NaCl P

10 % NaCl N

25 MacConkey agar N

6°C P

hittebestendigheid

60°C/4 uur P

.6702758 - 11 -

Gebaseerd op het bovenstaande heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de bereiding van 9 -hydroxy--4-androsteen-3,17-dion uit natuurlijke sterolen van plantaardige of dierlijke oorsprong of uit mengsels daarvan door de 5 submerse aerobe fermentatie van een enzymdeficient, sterol-afbrekend micro-organisme in een voedingsmiddelmedium met daarin te benutten koolstof- en stikstofbronnen alsmede minerale zouten, en door isolatie van het gervormde produkt, waartoe het sterol of sterolmengsel wordt getransformeerd met 10 een cultuur van een 1,2-steroïd-dehydrogenase-deficiënte stam van nieuwe Mycobacterium roseum species, dat in staat is de zijketen van natuurlijke sterolen af te breken, bij voorkeur met Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 stam gedeponeerd bij de National Collection of Agricultural and Industrial 15 Microorganisms, Boedapest, Hongarije onder nummer NCAIM B (P) 000339, waarna het verkregen 9 a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion desgewenst wordt geïsoleerd en gezuiverd.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding vindt de afbraak van de zijketen plaats met 20 Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1. De gekozen stam heeft grote voordelen met het oog op zijn deficiëntie in 1,2-steroid--dehydrogenase-activiteit en zijn snelle groei. Het is voorts ook een gunstig aspect, dat er geen kostbare ingrediënten nodig zijn voor de fermentatiebouillon, de stam kan gebruik maken van 25 stikstofbronnen van natuurlijke oorsprong (soyameel, notenmeel, maïsvloeistof, caseïnehydrolysaat, gistextract) en ook stikstof van anorganische oorsprong.

Met voordeel worden de dit in de fermentatie-industrie gebruikelijke koolstofbronnen gebruikt, zoals 30 glucose, fructose, saccharose, melasse, glycerol en vetten. Metaalion-behoefte wordt gedekt door de nutritive ingrediënten van natuurlijke bronnen.

De groei van de stam wordt niet beïnvloed door de te transformeren sterolen, zo kunnen de substraten worden gesteri-35 liseerd tezamen met het nutritieve medium voorafgaande aan het inocculeren.

De aanwezigheid van polyoxyethyleen-sorbitanmonoole-aat (Tween-80) in het nutritieve medium waarborgt een gunstige, gelijkmatige en snelle groei. Kweken en bioconversie kunnen . r w l , b 8 - 12 - worden uitgevoerd bij een temperatuur tussen 28 en 37°C, bij voorkeur bij 32°C. Het verloop van transformatie wordt gevolgd via de dunne-laag chromotografie. De voor de omzetting benodigde tijd is kort, 100 tot 120 uur.

5 Volgens de experimentele resultaten wordt 9a-hydroxy- -4-androsteen-3,17-dion gevormd als belangrijkste produkt door Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 met een hoge opbrengst uit natuurlijke sterolen. In de fermentatiebouillon worden ook geringe hoeveelheden produkten met gedeeltelijk afgebroken zijke-10 ten gevormd te weten 9 a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-choleen-22-zure methylester, 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-choleen-22--zuur, 9 a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,1 7(20)-choladieen-22--zuur en 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladieen--22-aldehyde.

15 Het is gunstig de cellen van het micro-organisme af te zonderen door filtreren of centrifugeren. De tijdens de microbiele conversie gevormde en aan de cellen vasthechtende produkten kunnen met alcoholen, bijv. methanol, worden afgewassen, terwijl die in de bouillon met een wateronmengbaar 20 oplosmiddel kunnen worden geëxtraheerd, zoals gechloreerde koolwaterstoffen of ethylacetaat na instelling van de pH op een waarde van 2.

Het belangrijkste produkt 9a-hydroxy-4-androsteen--3,17-dion wordt van de andere in geringe hoeveelheden gevormde 25 produkten afgezonderd hetzij door kolom chromatografie hetzij door preparatieve dunne-laag chromatografie en vervolgens door kristallisatie.

De structuur van de geïsoleerde conversieprodukten werd opgehelderd via UV, IR, PMR en massaspectrometrie.

30 De volgende voorbeelden dienen ter verduidelijking van de onderhavige uitvinding zonder deze daartoe te beperken.

Voorbeeld 1 35 Er werd een celsuspensie bereid met 10 ml steriel water uit de 4-5 dagen oude cultuur van Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 £*NCAIM B (P) 000339J7, gekweekt op een aardap-pel-glucose agarhelling. 5 ml van deze suspensie werd gebruikt voor het inocculeren van 800 ml steriel UFR inoculum-medium in 40 een 3 1 Erlenmeyer kolf, met de volgende samenstelling: * f ' Γ / 7 5 8 « - 13 - UFR medium: glycerol 8,0 g ureum 0,4 g soyameel 1,6 g 5 gistextract 0,8 g ammoniumchloride 2,4 g calciumcarbonaat 2,4 g kaliumdiwaterstoffosfaat 0,4 g magnesiumsulfaat-water 1:7 0,4 g 10 ferrichloride-water 1:6 0,4 g

Tween-80 0,4 g in 800 ml leidingwater.

De pH van het voedingsmedium werd ingesteld op een waarde 7 15 voorafgaande aan een sterilisatie, waarna het mengsel gedurende 45 minuten bij 121°C werd gesteriliseerd.

De kolf wordt geïncubeerd bij 32°C gedurende 3 dagen op roterende schudmachine (340 omwentelingen per min., diameter 3,5 cm). De inhoud van deze kolf wordt gebruikt voor het 20 inocculeren van 5 1 üHP-medium in een 101 laboratoriumfermen-tatie-inrichting, die gedurende 60 minuten bij 121°C werd gesteriliseerd.

Samenstelling van UHF-medium: 25 glycerol 50 g ammoniumchloride 15 g calciumcarbonaat 15 g soyameel 10 g kaliumdiwaterstoffosfaat 2,5 g 30 ureum 2,5 g 2:1 mengsel van β-sitosterol- -campesterol 100 g polypropyleen-glycol 30 g

Tween-80 10 g 35 leidingwater ad 5 1.

De pH van het voedingsmedium werd ingesteld op een waarde van 7 voorafgaande aan steriliseren.

De geïnocculeerde kweek werd overgebracht in een 40 waterbad bij 32°C en bij 350 omwentelingen per min. geroerd.

• t v '::i 8 - 14 -

Eerst werd 90 1/uur, dan met geleidelijke afname van de schuimvorming, 150/1 uur luchtstroom door de bouillon geleid.

Het fermenteren wordt gedurende 100 uur voortgezet, waarna de omzettingsprodukten, gevormd uit het mengsel van 5 3-sitosterol-campesterol, werden geïsoleerd.

De sterolomzettingsprodukten van êên liter fermenta-tiebouillon, die oorspronkelijk 20 g ruw sitosterol (2:1 mengsel van β-sitosterol-campesterol) bevatte werden als volgt geïsoleerd.

10 De cellen van de bouillon werden gefiltreerd, waarna de aangehechte sterolomzettingsprodukten en de onveranderde oorspronkelijke materialen drie keer werden afgewassen met 200 ml methanol. De verenigde methanoleluaten werden bij verminderde druk ingedampt, onder oplevering van 12 g van het residu.

15 De gefiltreerde bouillon werd aangezuurd met 2N zwa velzuur (pH 2). Het gevormde neerslag, bestaande uit een mengsel van 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-choleen-22-zuur en 9 a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladieen-2 2-zuur, werd afgefiltreerd en gedurende 4 uur boven fosforpentoxide gedroogd 20 bij verminderde druk. Opbrengst: 1 g mengsel van zuren. Het filtraat werd twee keer geëxtraheerd met 200 ml ethylacetaat.

De verenigde ethylacetaatextracten werden boven watervrij natriumsulfaat gedroogd, bij verminderde druk ingedampt onder oplevering van 3,1 g van een residu.

25 Het ruwe omzettingsprodukt, geïsoleerd uit de cellen, en het residu, dat verkregen is uit de aangezuurde bouillon door extractie werden verenigd en vervolgens aan chromatografie via een kolom onderworpen, met als kolomvulling 250 g kiezelzuur, met behulp van n-heptaan-ethylacetaatmengsels met 30 daarin geleidelijk toenemende hoeveelheden ethylacetaat als ontwikkeloplosmiddel. Onveranderd uitgangsmateriaal werd uit de kolom geëlueerd met behulp van een n-heptaan-ethylacetaat-mengsel met daarin 25 % ethylacetaat. Na verdamping van deze fracties werd 1,5 g van een β-sitosterol-campesterolmengsel 35 verkregen. Na indampen van de fracties, geëlueerd met een n-heptaan-etylacetaatmengsel met daarin 40 % ethylacetaat en omkristalliseren van het residu uit aceton leverde 0,3 g 9a--hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-choleen-22-zure methylester op, met een smeltpunt van 212 tot 216°C.

40 Na indampen van de fracties geëlueerd met een • <- · - ί / o 8 - 15 - * n-heptaan-ethylacetaatmengsel met daarin 45 % ethylacetaat en omkristalliseren van het residu uit de aceton werd 0,1 g 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17-(20)-choladieen-22-aldehyde verkregen, met een smeltpunt van 204-209°C.

5 Na indampen van de fracties, geëlueerd met n-heptaan- -ethylacetaatmengsel met daarin 55 % ethylacetaat bij verminderde druk en omkristalliseren van het residu uit methanol werd 5,7 g 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion verkregen met een smeltpunt van 219 tot 221°C, £ ajp = +180° (c=l, 10 chloroform).

De fracties, geëlueerd met een n-heptaan-ethylacetaatmengsel met 70 % ethylacetaat werd onder verminderde druk ingedampt onder oplevering van een residu bestaande uit een mengsel van 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-choleen-22-zuur en 15 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladieen-22-zuur. Dit mengsel werd verenigd met het 1 g mengsel van zuren verkregen uit de gefiltreerde bouillon na aanzuren, waarna het gehele mengsel twee keer werd omgekristalliseerd uit methanol onder oplevering van 0,4 g chromatografisch zuiver 9a-hydroxy-3-oxo-20 -23,24-dinor-4,17(20)-choladieen-22-zuur, met een smeltpunt van 242 tot 248°C.

Het mengsel van 9a-hydroxy-3-oxo-23.24-dinor-4-cho-leen-22-zuur en 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-chola-dien-22-oinezuur in de omkristallisatiemoedervloeistof werd 25 afgezonderd via preparatieve dunne-laag chromatografie £ adsorbent: 2:1 mixture of Kieselgel G (Reanal, Boedapest) en Kiesel-gel 60 HF254-366 (Reanal, Boedapest) J, onder gebruikmaking van ontwikkeloplosmiddel van benzeen-aceton 1:1. Opbrengst: 0,1 g chromatografisch zuiver 9a-hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4-cho-30 leen-22-zuur (met een smeltpunt van 258 tot 262°C) en 0,2 g 9a--hydroxy-3-oxo-23,24-dinor-4,17(20)-choladieen-22-zuur.

€ 7 0 2 7 5 β

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van 9a-hydroxy-4-an-drosteen-3,17-dion uit natuurlijke sterolen van plantaardige of dierlijke oorsprong of uit mengsels daarvan door submerse aerobe fermentatie van een enzym-deficiënt, sterolafbrekend 5 micro-organisme in een voedingsmedium met daarin geschikte koolstof- en stikstofbronnen alsmede minerale zouten, en door isoleren van het gevormde produkt met het kenmerk, dat het sterol of sterolmengsel wordt getransformeerd met de kweek van een 1,2-steroïd-dehydrogenase deficiënte stam van 10 nieuwe Mycobacterium roseum species, die geschikt is voor het afbreken van de zijketen van natuurlijke sterolen, bij voorkeur met Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 gedeponeerd bij de National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Boedapest, Hongarije, onder nummer NCAIM B (P) 15 000339, waarna het verkregen 9a-hydroxy-4-androsteen-3,17-dion desgewenst wordt geïsoleerd en gezuiverd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een mengsel van β-sitosterol en campesterol (2:1) wordt gebruikt als substraat.

3. Mycobacterium roseum sp.

4. Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 gedeponeerd bij de National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Boedapest, Hongarije onder nummer NCAIM B (P) 000339. f

"· *· 5 A