DD232167A3 - Verfahren zur herstellung von androstanderivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Androstanderivaten, insbesondere von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion(9-OH-AD), durch mikrobielle Transformation von Sterolen. Androstanderivate wie 9-OH-AD sind wichtige Zwischenprodukte fuer die Partialsynthese von Steroidpharmaka. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung solcher Androstanderivate anzugeben. Diese Aufgabe wird in der Weise geloest, dass der Mikroorganismus Mycobacterium fortuitum N 10 (Stamm ZIMET 10 849) unter aeroben und sterilen Bedingungen in waessrigen Naehrmedien und in Gegenwart eines feinverteilten, festen, hydrophoben organischen Polymeren fuer die Dauer von 2 bis 6 Tagen fermentiert wird. Als Polymere kommen dabei vernetzte Polystyrole, Polyester, Polyphenyle oder Polyamide, vorzugsweise Polyamid 6 oder Polyamid 11, zum Einsatz.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Androstanderivaten aus Sterolen. Androstanderivate stellen wichtige Zwischenprodukte bei der Partialsynthese von Steroidpharmaka dar.

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen und unter Umständen in Teilbereichen der mikrobiologischen Industrie allgemein.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Androstanderivate durch mikrowellen Abbau von Sterolen hergestellt werden können. (K. Kieslich: „Steroid conversions" in: Ä.H.Rose (Ed.) Microbial enzymes and bioconversions. Economic Microbiology, 5 (1980), 370-467. Academic press; London, New York, Toronto, Sydney, San Francisco.) Diese Übersichtsarbeit gibt einen umfassenden Überblick zum Entwicklungsstand in allen Teilproblemen des mikrowellen Sterolabbaus.

Bekannt ist insbesondere (vgl. die Patentschrift DE-AS 2647895 bzw. die den gleichen Gegenstand betreffende parallele Patentschrift DD 127455) ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 9-OH-AD aus Sterolen, bei dem ein sowohl unter der Registriernummer NRRL B-8119 als auch unter der Registriernummer DSM 752 hinterlegter Mikroorganismus der Art Mycobacterium fortuitum eingesetzt wird. Die selektive Sterolumwandlung zu o. g. Zielprodukt erfolgt hierbei unter aeroben und sterilen Kultivierungsbedingungen in wäßrigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, wobei das zu transformierende Sterol in einer Konzentration von beispielsweise 10 g/l eingesetzt wird. Das Verfahren besitzt jedoch einen schwerwiegenden Nachteil: Verursacht sowohl durch die Wasserunlöslichkeit als auch durch die hohe Hydrophobizität der Sterole (wie Sito-, Ergo-, Campe-, Chole- bzw. Stigmasterol) weisen diese Einsatzstoffe hier nur eine geringe sog. Bioverfügbarkeit auf, was in Verbindung mit dem spezifischen Transformationsvermögen des eingesetzten Mikroorganismus zu langen Kultivierungsdauern von bis zu 15 Tagen führt.

Es hat im Anschluß an die technische Lösung gemäß der Patentschrift DE-AS 2647895 nicht an Versuchen gefehlt, durch gezielte Zusätze zum Fermentationsansatz die Bioverfügbarkeit der Sterole zu beeinflussen, damit die Gesamtumsatzraten bzw. Ausbeuten zu erhöhen und auf diese Weise wenigstens einen nachteiligen Aspekt der o. g. technischen Lösung abzubauen. Als derartige Zusätze kamen organische Lösungsmittel, bestimmte nichtionische Tenside sowie spezielle Nährmedienkomponenten zum Einsatz (vgl. K. Kieslich, a. a. 0.).

Zusätze von organischen Lösungsmitteln erwiesen sich wegen ihrer toxischen Wirkung schon in geringen Konzentrationen als nachteilig.

Zusätze von nichtionischen Tensiden und/oder von Produkten, die gleichzeitig als Nährmedienbestandteile anzusehen sind, führten hingegen zu dem Nachteil, daß, wenn sie in den aus der Sicht der bloßen Steroltransformation erforderlichen hohen Konzentrationen vorliegen, die Aufarbeitung der Fermentationsansätze, insbesondere die Extraktion der Androstanderivate als Zielprodukte, stark beeinträchtigt wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung von Androstanderivaten, insbesondere von 9a-Hydroxy-Androst-4-en-3,17-dion, als wichtige Zvischenprodukte für die Herstellung von Steroidpharmaka.

Darlegur <5 des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Androstanderivaten, insbesondere von 9a-Hydroxy-Androst-4-en-3,17-dion (9-OH-AD), durch mikrowellen Abbau von Sterolen anzugeben, das die Nachteile der bisher bekannten Lösungen vermeidet.

Es wurde zunächst gefunden, daß mit dem als Mycobacterium fortuitum N10 bezeichneten und in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11 unter der Registriernummer ZIMET10849 hinterlegten Stamm ein weiterer Mikroorganismus vorliegt, der wie der literaturbekannte Stamm M. fortuitum NRRLB-8TT9 Sterole selektiv zu 9-0H-A&umwandelt. Im Unterschied zu Stamm NRRL B-8119 ist für den Stamm ZIMET10849 unter ariderem eine signifikant verringerte Steroid-1-Dehydrogenase-Aktivität kennzeichnend, was sich in einer verminderten Bildung von weiteren Ringabbauprodukten zeigt.

Es wurde weiter gefunden, daß in Fermentationen von Stamm ZIMET10849 dann deutlich erhöhte Substratumsatzraten und Produktausbeuten auftreten, wenn diese Fermentationen in Gegenwart eines feinverteilten, festen, hydrophoben organischen Polymeren erfolgen. Dabei verbleibt das Produkt, d.h. das Androstanderivat 9-OH-AD, in der wäßrigen Phase und wird nicht am Träger adsorbiert.

Im Ergebnis dieser Befunde wird die erfindungsgemäße Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Zellmaterial des Mikroorganismus M. fortuitum N10 (Stamm ZlMET 10849) wird unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, welches eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthält, in Gegenwart eines feinverteilten, festen, hydrophoben organischen Polymeren sowie einer Sterol-Substratpräparation gezüchtet. Pro Liter Fermentationslösung werden dabei 1 g bis 100 g, vorzugsweise 2g bis 20 g, des organischen Polymeren, das sich im chemischen Sinne selbst nicht an der Transformation beteiligt, in einer Partikelgröße von 5μηη bis 300 μηη, vorzugsweise 100/zm, zugesetzt.

Die Fermentationsdauer beträgt 2 Tage bis 6 Tage.

Hinsichtlich der Einbringung des Polymeren und der Sterol-Substratpräparation wird das Verfahren in nachstehenden Varianten durchgeführt:

— Das Polymere wird während der Anzucht in Gegenwart des zu transformierenden Substrats verwendet, d.h. die Substratpräparation aus dem zu transformierenden Sterol oder Sterolgemisch wird dem ansonsten kompletten Fermentationsansatz bereits zum Anzuchtbeginn in Konzentrationen von 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10g/l, zugesetzt. Die so bereitete Kulturlösung wird bei pH 6 bis pH 8 und bei einer Temperatur von 26°C bis 35⁰C, vorzugsweise 28⁰C, zu dem C₁₉-Steroid 9-OH-AD fermentiert.

Nach Beendigung der Fermentation wird vom Feststoff abgetrennt, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und das erhaltene Sterolabbauprodukt 9-OH-AD in an sich bekannter Weise isoliert.

— Das Polymere wird während der Anzucht in Abwesenheit des zu transformierenden Substrats verwendet, d. h. die Substratpräparation obiger Kennzeichnung wird dem ansonsten kompletten Fermentationsansatz nach 1- bis 36stündiger, vorzugsweise 24stündiger, Präinkubation der M. fortuitum N10-Zellen mit dem Polymeren zugesetzt und die Fermentation unter den quantitativen Bedingungen gemäß Variante 1 durchgeführt. Die Aufarbeitung des erhaltenen Sterolabbauprodukts erfolgt gleichfalls wie in Variante 1.

— Das Polymere wird während deY Anzucht wiederum in Abwesenheit des zu transformierenden Sterol-Substrates verwendet, indem M. fortuitum N10-Zellen in Gegenwart des organischen Polymeren obiger Charakterisierung in Nährlösung 12 Stunden bis 36 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, angezüchtet werden, die erhaltene Biomasse-Polymer-Mischung nun aber vor ihrem Einsatz zur (Sterol-)Substrattransformation durch Sedimentation vom Nährmedium abgetrennt wird. Nachdem die Sterol-Substratpräparation in dieses Sediment eingerührt worden ist, wird das Gesamt-Mischprodukt in Pufferlösung eingebracht und in dieser bei den sonstigen quantitativen Bedingungen (pH-, Temperatur-Regime) von Variante 1 dann die Fermentation, d. h. die Sterol-Transformation, zu Ende geführt. Die Aufarbeitung des erhaltenen 9-OH-AD wird wiederum wie in Variante 1 vorgenommen.

Im weiteren wird das Verfahren noch wie folgt spezifiziert:

Als feinverteiltes, festes, hydrophobes organisches Polymere wird im Verfahren ein vernetztes Polystyrol, ein Polyester, ein Polyphenyl oder ein Polyamid, vorzugsweise Polyamid 6 oder Polyamid 11, eingesetzt.

Als zu transformierendes Substrat wird entweder eines der bekannten Sterole (Sito-, Ergo-, Campe-, Chole- bzw. Stigmasterol) oder ein Gemisch aus diesen Sterolen verwendet.

Die Fermentationsdauer wird vorzugsweise auf 4 Tage bemessen, und in der Extraktionsstufe während der Aufarbeitung vorzugsweise Butylazetat eingesetzt.

In der dritten Verfahrensvariante wird die Sterol-Transformation vorzugsweise in 0,01- bis0,1-molaren Phosphatpuffern durchgeführt.

Im Vergleich zu den bekannten Verfahren weist die Erfindung folgende Vorteile auf:

Bei der verfahrensgemäßen Sterol-Transformation, d. h. bei der verfahrensgemäßen Kombination von neuem Mikroorganismus und Polymer-Zusatz, erhöhen sich nachhaltig die Substratumsatzraten und die Produktausbeuten unter Anreicherung des Zielproduktes 9-OH-AD in der wäßrigen Phase. Die Fermentationsdauer kann somit merklich verkürzt werden. Im Vergleich zur jeweiligen Verfahrensführung ohne Polymer-Zusatz tritt bei erfindungsgemäßem Vorgehen (in Abhängigkeit von der gewählten Verfahrensvariante) eine Ausbeuteerhöhung um 40% bis 50% ein.

Die Abtrennung der wäßrigen Phase wird durch die Verteilung des Polymer-Zusatzes in der Fermentationslösung erleichtert. Für die Aufarbeitung des 9-OH-AD entstehen aus dem Zusatz eines Polymeren obiger Kennzeichnung keine Erschwernisse.

Ausführungsbeispiele

An einigen Ausführungsbeispielen soll das Verfahren näher erläutert werden:

1. Zwanzig 500ml-Standkolben mit je 50 ml einer Nährlösung, bestehend aus Hefe-Extrakt 10g; Glyzerin 10g; KH₂PO₄ 0,5g; K₂HPO₄0,5g; (NH₄J₂HPO₄1,5g; MgSO₄. 7H₂O 0,2g;

FeSO₄. 7H₂O 0,01g; ZnSO₄.7H₂O 0,02g; Polyamid 11 10,0g; Sitosterol in einer geeigneten Präparation 10g; Aqua dest. 1000 ml; pH 7; werden mit je 5 ml einer 48 Stunden alten Kultur von Mycobacterium fortuitum N10 beimpft. Die weitere Kultivierung erfolgt bei 28⁰C auf einem Rundschwingtisch. Nach 48 Stunden Fermentation wird vom Feststoff abgetrennt, mit Butylazetat extrahiert und auf übliche Weise das 9-OH-AD isoliert. Man erhält 5g 9-OH-AD, was im Vergleich zur Verfahrensführung hne Polymer-Zusatz einer Ausbeutesteigerung um 40% entspricht.

2. M. fortuitum N10 wird gemäß Beispiel 1 kultiviert und aufgearbeitet. Als Substrat wird /3-Sitosterol in einer Konzentration von 5g/l verwendet. Die Bildung von 9-OH-AD ist bei den Mykobakterienzellen, die in Gegenwart von organischen Polymeren gewachsen sind, um 50% gegenüber der Verfahrensführung ohne Polymer-Zusatz erhöht.

3. Zwanzig 500 ml-Standkolben mitje50mlderin Beispiel 1 angegebenen Nährlösung, jedoch ohne Sitosterol-Substrat, werden mit je 5 ml einer 48 Stunden alten Kultur von M. fortuitum N10 beimpft. Die Kultivierung erfolgt 24 Stunden bei 28°C auf einem Rundschwingtisch.

Nach 24stündiger Inkubation werden die Zellen eines jeden Kolbens vom Kulturfiltrat abgetrennt, mit einem Gemisch von 55%/3-Sitosterol + 6%Campesterol + 39% Stigmasterol (500 mg je 2,5g Biofeuchtmasse) gut verrührt und auf je 50 ml Puffer (Phosphatpuffer nach SÖRENSEN, pH 8,0) in 500ml Standkolben gesetzt.

Nach 100 Stunden wird die Fermentation abgebrochen und weiter verfahren, wie in Beispiel 1 ausgeführt. Die9-OH-AD-Bildung ist bei in Gegenwart von Polyamid 6 oder Polyamid 11 gewachsenen Zellen des Stammes M. fortuitum N10um 50% gegenüber der Polymer-freien Verfahrensführung erhöht.

Claims (6)

1. - "I - tu I OO

   Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung von Androstanderivaten, insbesondere von 9a-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion (9-OH-AD), durch mikrowellen Abbau von Sterolen mit Stämmen derArtMycobacteriumfortuitum unter aeroben und sterilen Bedingungen in wäßrigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, gekennzeichnet dadurch, daß der Mikroorganismus M. fortuitum N10 (Stamm ZIMET10849) eingesetzt und die Fermentation in Gegenwart eines feinverteilten, festen, hydrophoben organischen Polymeren für die Dauer von 2 Tagen bis 6 Tagen durchgeführt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Polymere während der Anzucht in Gegenwart des zu transformierenden Substrats verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Polymere während der Anzucht in Abwesenheit des zu transformierenden Substrats verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Polymere vernetzte Polystyrole, Polyester, Polyphenyle oder Polyamide, vorzugsweise Polyamid 6 oder Polyamid 11, verwendet werden.
5. 5. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die erhaltene Biomasse-Polymer-Mischung vor ihrem Einsatz zur Substrat-Transformation, d. h. zurTransformation der Sterole, vom Nährmedium abgetrennt und die Fermentation sodann in Pufferlösung zu Ende geführt wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß als Pufferlösungen 0,01- bis 0,1-molare Phosphatpuffer verwendet werden.