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lt Mikrobielle Sterinfermentation"
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterinfermentation, bei
welchem ethoxylierte Sterine als Emulgatoren eingesetzt werden.
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Es besteht ein wachsender Bedarf an Steroidzwischenstufen für die
Herstellung pharmazeutischer Wirkstoffe. Dieser Bedarf wird zunehmend aus fermentativ
gewonnenen Abbauprodukten von Sterinen gedeckt. Dazu werden Sterine pflanzlichen
oder tierischen Ursprungs in reiner oder stark angereicherter Form in wäßriger Nährlösung
eingesetzt. Durch Zusatz von Emulgatoren wird für eine geeignete Verteilung der
Sterine in dem wäßrigen Nährmedium gesorgt. Diese Emulgatoren dürfen das Wachstum
der Microorganismen und den Sterinabbau nicht stören. In der DE-OS 29 36 125 ist
ein Verfahren zum fermentativen Sterinabbau beschrieben, bei dem als Ausgangsmaterial
N ein natürlich angereichertes Sterinkonzentrat- dient.
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Als Emulgatoren werden Polyhydroxymethylmonolauryläther eingesetzt.
Die Sterinkonzentrate werden zu 20-1,4-Pregnadien-3-on (BNC) abgebaut. In der älteren
deutschen Patentanmeldung P 31 13 035 ist ein Verfahren zur Herstellung eines trizyklischen
Steroidabbauproduktes unter Verwendung der Microorganismen-Defektmutante Chol 149-K
14 (DSM 2065) beschrieben. Als Emulgatoren wurden Fett-
säure-soritanester
oder Ethylenoxidaddukte, Polyoxyethylen, Monolauryläther oder Fettsäureamidoalkylbetain
verwendet. In der Europäischen Patentanmeldung 79 101 036 ist ein Verfahren zur
Herstellung von 3-Oxo-pregna-4-en-20-carbonsSure (t -4 BNC) und/oder 3-Oxo-pregna-1,4-dien-20-carbonsäure
(ZL -1,4 BNC) aus Steroidsubstraten mit längeren Substituenten in C-17-Stellung
auf fermentativem lVege beschrieben. Als Emulgatoren wurden Tween 80 (Polyoxyäthylensorbitanmonooleat)
und BRI J 35 (PolyoxyethylenmonolaurylSther) verwendet.
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß sterinabbauende Mikroorganismen
in Gegenwart von ethoxylierten Sterinen als Emulgatoren in gesteigertem Maße metabolisieren
und dabei in erhöhten Mengen Stoffwechselprodukte, wie z. B.
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BNC bilden. Ethoxylierte Sterine sind optimale Emulgatoren für den
fermentativen Sterinabbau; sie führen zu einer beachtlichen Ausbeutesteigerung an
Abbauprodukten.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von ethpxylierten
Sterinen als Emulgatoren in der mikrobiellen Sterintransformation. Es sind pflanzliche
und tierische ethoxylierte Sterine mit verschiedenem Ethoxylierungsgrad geeignet.
Die erfindungsgemäße mikrobielle Sterinfermentation erfolgt in grundsätzlich bekannter
Weise. So kann beispielsweise die als Einsatzmaterial A gewählte Steroidverbindung
der Mikroorganismenkultur während der Inkubationsperiode zugesetzt werden, oder
sie kann dem Nährmedium vor der Inokkulierung der Defektmutante beigegeben werden.
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Es kann eine Steroidverbindung oder eine Mischung aus mehreren Steroidverbindungen
eingesetzt werden.
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Die optimale Konzentration an Steroidausgansverbindung ist durch einfache
Vorversuche zu ermitteln.
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Sie liegt im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 g pro Liter Nährmedium.
Fs kann dabei vorteilhaft sein, das dem partiellen Abbau zu unterwerfende Substrat
nicht auf einmal dem Reaktionsmedium zuzusetzen, sondern dieses portionsweise im
Verlauf der Reaktion zuzugeben. Dabei kann die Zugabe im wesentlichen kontinuierlich
erfolgen.
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Die Mikroorganismenkultur wird in einem Nfflhrmedium gezüchtet, das
als Kohlenstoffquelle die zu transformierende Steroidverbindung und gegebenenfalls
noch zusätzliche metabolisierbare Kohlenstoffquellen, sowie die Ublicherweise von
diesen Mikroorganismen benötigten Nähr- und Wuchsstoffe enthält. Geeignete Stickstoffquellen
sind Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Sojamehl, Schlempe oder Fischmehl.
Auch Fermentationsbeschleuniger wie Hefeextrakt und Vitamine können zugesetzt werden.
Das Nährmedium enthält darüber hinaus üblicherweise anorganische Salze wie Natrium-,
Kalium-oder Ammonium-Phosphate oder Calcium-, Magnesium-, Mangan- und/oder Eisensalze.
Die Emulgierung des Steroidausgangsmaterials erfolgt mit den ethoxylierten Sterinen.
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Besonders vorteilhaft ist es, ethoxylierte Sterine in Kombination
mit anderen Emulgatoren einzusetzen. Dadurch wurde eine weitere Steigerung der Bildung
von Steroid abbauprodukten festgestellt. Insbesondere in Kombinationmit Kokosfettsäuremonoäthanolamid
wurde ein deutlicher " synergistischer Effekt, d. h. eine weitere Erhöhung der Produktivität
der Mikroorganismen festgestellt.
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Geeignete Steroidausgangsmaterialien für die Transformation sind
natürliche Sterine wie Cholesterin, Sitosterin, Stigmasterin und/oder Ergosterin
oder Abkömmlinge hiervon.
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Auch Gallensäuren, wie Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure
und deren Gemische oder weitere Verbindungen mit der Steroidgrundstruktur, z. B.
partielle Abbauprodukte von natürlichen Sterinen, sind geeignet. Als Microorganismen,
die zur Sterinfermentation befähigt sind, seien beispielhaft genannt: Achromobacter,
Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Microbacterium,
Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.
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Besonders geeignet für die Steroidtransformation zu BNC sind die in
der Europäischen Patentanmeldung 79 101 C36 beschriebenen Mutantenstämme, die aus
bestimmt aus wählten Wildstämmen mit anschließender Mutation und Selektion gewonnen
worden sind. Es sind dies die Stämme: CBS 437, 77, ATCC 31 456, ATCC 31457, ATCO
31459, ATCC 31460, DSM 1437, DSM 1439, DSM 1442, DSM 1443, DS'I 1444 und DSM 1445.
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Im einzelnen gelten dabei die Angaben in der genannten europäischen
Anmeldung.
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Beispiel 1 Der Stamm T 191 (Corynebacterium spec.) DSM 1444 wurde
in folgendem Nährmedium bei 300C aerob angezüchtet: 0,30 % Glucose, 0,90 % Hefeextrakt,
0,80 % Pepton, 0,10 % K2HPO4, 0,08 % NaH2PO4 (pH 7,0), 0,5 % Cholesterin und 0,3
% ethoxyliertes Sojasterin (Generol 122-Typen). In 4 Parallelansätzen wurde Sojasterin
mit 5 ol, 10 Mol, 16 Mol und 25 Mol Ethylenoxid geprüft. Nach einer Kulturdauer
von 144 Stunden wurden Proben gezogen und die Ausbeute an BNC per Dünnschichtchromatographie
bestimmt:
| BNC-Ausbeute (g/l) |
| Emulgator |
| #-1,4 #-1,4,17 #-4 # |
| ohne |
| Generol 122-E5 0,93 0,28 0,06 1,27 |
| VI lt E 10 0,80 0,21 0,08 1,09 |
| " " E 16 0,71 0,20 0,05 o,g6 |
| " " E 25 0,89 0,10 0,03 1,02 |
Beispiel 2 In einer weiteren Versuchsserie wurde unter den gleichen Bedingungen
wie in Beispiel 1 die Wirkung von ethoxylierten Verbindungen in Kombination mit
einem weiteren Emulgator geprüft. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Versuchsbedingungen:
wie Beispiel 1
| BNC-Ausbeute (g/l) |
| Emulgator #-1,4 #-1,4,17 #-4 # |
| 0,1 % Comperlan 100+ |
| 0,2 % Generol 122-E 5 1,08 0,33 0,07 1,38 |
| 0,1 % Comperlan 100 |
| 0,2 % Generol 122-E 10 0,81 0,32 0,15 1,28 |
| 0,1 % Comperlan 100 |
| 0,2 % Generol 122-E 16 1,33 0,35 0,17 1,85 |
| 0,1 % Comperlan 100 |
| 0,2 % Generol 122-E 25 1,43 0,40 0,18 2,01 |
+ Comperlan: Kokosfettsäuremonoathanolamid
Eine Steigerung der BNC-Bildung
aus Sterinen durch ethoxylierte Generol 122-Typen konnte auch an Beispiel einer
weiteren Bakterienart demonstriert werden.
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Beispiel 3 Der Stamm SC 372-837 (Corynebacterium equi)DsM 1990 wurde
in folgendem Medium bei 300C aerob angezüchtet: 0,25 % Glucose, 0,25 ; Laktat, 0,80
% Hefeextrakt, 0,70 % Pepton, 0,10 % K2HPO4, 0,08 % NaH2PO4, 0,50 % Cholesterin,
0,30 % ethoxylierte Sterine (pH 7,0).
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Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
| BNC (g/l) |
| Emulgator #-1,4 #-1,4,17 #-4 |
| ohne 1,98 0,24 0,16 2,38 |
| Generol 122-E 5 3,49 t 0,36 0,12 3,97 |
| Generol 122-E 10 3,28 - - 3,28 |
| Generol 122-E 16 3,50 0,29 0,13 3,92 |
| Generol 122-E 25 3,46 0,39 0,10 3,95 |
Beispiel 4 In einer weiteren Versuchsserie wurde unter den gleichen Bedingungen
wie in Beispiel 3 die Wirkung der ethoxylierten Sterine in Kombination mit weiteren
Emulgatoren geprüft. Es wurden dabei folgende Ergebnisse erhalten:
| BNC (g/l) |
| Emulgator #-1,4 #-1,4,17 #-4 # |
| 0,1 % Comperlan 100 |
| 0,2 % Generol 122-E 5 4,21 0,55 0,13 4,91 |
| 0,1 % Comperlan 100 |
| 0,2 % Generol 122-E 10 3,35 0,46 0,31 4,12 |
Der Stamm SC 372-837 (Corynebacterium equi) DSM 1990 wurde unter den gleichen Kulturbedingungen
wie in Beisniel 3 jedoch unter Verwendung von 0,3 % Generol 122 anstelle von Cholesterin
als Substrat angezüchtet.
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Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
| Emulgator BNC (g/l) |
| ohne 0,48 |
| 0,3 % Generol 122-E 10 0,77 |
| 0,3 % Generol 122-s 16 0,81 |
| 0,3 % Generol 122-E 25 0,73 |