CN112110970A - 9-oh-ad副产物的回收利用方法及9-oh-ad的制备方法 - Google Patents

9-oh-ad副产物的回收利用方法及9-oh-ad的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种9‑OH‑AD副产物的回收利用方法及9‑OH‑AD的制备方法。9‑OH‑AD副产物的回收利用方法中，将微生物转化植物甾醇制备9‑OH‑AD产生的杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，并控制杂质粗品、二氯甲烷和甲醇的用量为1g:(2～5)mL:(5～10)mL，然后升温浓缩，以除去二氯甲烷，最后降温结晶，从含有多种副产物、成分复杂的杂质粗品中有效分离出化合物(Ⅰ)，再通过水解反应制得化合物(Ⅱ)，化合物(Ⅱ)可以进一步用于制备甾体化合物，从而节约了资源；避免了将副产物当危险固废处理造成资源浪费的问题。化合物(Ⅰ)和所述化合物(Ⅱ)的结构如下所示：
Figure DDA0002684246980000011

Description

9-OH-AD副产物的回收利用方法及9-OH-AD的制备方法
技术领域
本发明涉及甾体化合物的合成技术领域，特别涉及一种9-OH-AD副产物的回收利用方法及9-OH-AD的制备方法。
背景技术
甾体化合物是广泛存在于生物体组织内的一类重要的天然有机化合物，由于甾体类药物具有多种生理功能并发挥独特疗效，故在临床上有广泛的应用。 9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)具有9-羟基结构，进行简单的卤化反应后便可引入F或Cl等卤素取代基，从而有效提升某些皮质类激素的药效，如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等药物的药效。
目前工业生产中，常采用微生物转化植物甾醇制备9-羟基雄甾-4-烯-3,17- 二酮(9-OH-AD)。然而，在采用微生物转化植物甾醇制备9-羟基雄甾-4-烯-3,17- 二酮(9-OH-AD)时，植物甾醇经历复杂的中间转化过程，产生了许多复杂的中间体，这些中间体无法全部转化为目标产物9-OH-AD，导致转化降低，且生成大量副产物。
因微生物转化植物甾醇制备9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮时产生的副产物种类复杂，提纯困难，且没有有效的回收利用的方法，常直接将后处理得到的副产物当危险固废处理，造成很大的资源浪费。
因此，开发一种能够有效分离9-OH-AD副产物的回收利用方法具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明提供一种能够有效分离9-OH-AD副产物的回收利用方法及 9-OH-AD的制备方法。
本发明提供一种提供微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品；
将所述杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，升温浓缩，以除去二氯甲烷，然后降温结晶；得到化合物(Ⅰ)；
将所述化合物(Ⅰ)在碱性条件下进行水解反应，得到化合物(Ⅱ)；
其中，所述杂质粗品、所述二氯甲烷和所述甲醇的用量比为 1g:(2～5)mL:(5～10)mL；所述化合物(Ⅰ)和所述化合物(Ⅱ)的结构如下所示：
Figure RE-GDA0002779196510000021
在其中一些实施例中，所述水解反应的具体包括如下步骤：
将所述化合物(Ⅰ)与碱进行水解反应，酸化，过滤，得到粗产物；
对所述粗产物进行打浆处理，得到所述化合物(Ⅱ)。
在其中一些实施例中，所述化合物(Ⅰ)和所述碱的质量比为1:(0.1～0.4)。
在其中一些实施例中，所述打浆处理采用的溶剂为有机溶剂与水的混合液，所述有机溶剂与水的体积比为(3～10):1；所述有机溶剂选自丙酮、四氢呋喃、N,N- 二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的任意一种。
在其中一些实施例中，所述碱选自氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述酸化的步骤中，采用酸调节反应体系的pH值至 6～8。
在其中一些实施例中，所述酸选自盐酸、硫酸、硝酸及有机酸中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述水解反应的温度为30℃～50℃。
本发明的另一方面，还提供了一种9-OH-AD的制备方法，包括以下步骤：
采用上述任一种回收利用方法制得化合物(Ⅱ)；
将所述化合物(Ⅱ)制成转化培养基；
将耻垢分枝杆菌接种于所述转化培养基上，转化得到化合物9-OH-AD；
其中，以所述转化培养基的总质量为基准，所述化合物(Ⅱ)的质量百分数为0.5％～1.5％。
在其中一些实施例中，所述转化的温度为28℃～32℃。
有益效果
本发明提供一种9-OH-AD副产物的回收利用方法，首先将微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，并控制杂质粗品、二氯甲烷和甲醇的用量为1g:(2～5)mL:(5～10)mL，然后升温浓缩，以除去二氯甲烷，最后降温结晶，从而从含有多种副产物、成分复杂的杂质粗品中提纯得到高纯度的化合物(Ⅰ)；然后将化合物(Ⅰ)在碱性条件下水解得到化合物(Ⅱ)。该回收利用方法能从微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品中有效分离出化合物(Ⅰ)，回收制得的化合物(Ⅱ)可以进一步用于制备甾体化合物，从而节约了资源；避免了将副产物当危险固废处理造成资源浪费的问题。
进一步地，本发明还提供一种9-OH-AD的制备方法，采用上述回收利用方法制得的化合物(Ⅱ)制成转化培养基；将耻垢分枝杆菌接种于转化培养基上；且以转化培养基的总质量为基准，控制化合物(Ⅱ)的质量百分数为0.5％～1.5％，通过微生物转化得到化合物9-OH-AD。该制备方法通过有效分离微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品，获得纯度较高的化合物(Ⅰ)，从而回收得到化合物(Ⅱ)，进一步通过微生物转化将化合物(Ⅱ)转化为9-OH-AD，从而可以提高微生物制备甾体9-OH-AD的收率，节约资源，降低成本。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的化合物(Ⅰ)的核磁氢谱图；
图2为本发明实施例1制得的化合物(Ⅰ)的核磁碳谱图；
图3为本发明实施例1制得的9-OH-AD的核磁氢谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的化合物及其制备方法与应用作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明申请人在开发本发明的技术方案之前，开发出了一种耻垢分枝杆菌转化植物甾醇制备9-OH-AD的方法。采用耻垢分枝杆菌的菌株发酵制备 9-OH-AD时，有效的抑制了9-OH-AD的1、2位脱氢，进而抑制了其降解，提高了收率，9-OH-AD的收率可达到50％～55％。但在生产过程中，仍然会存在大量中间体未转化完全，这些中间体在后处理后产生大量副产品，通常直接将经后处理得到的副产物当危险固废处理，造成很大的资源浪费。
本发明的技术人员对其产生的副产品进行深入的分析研究，在经过大量的实验探究后，本发明的技术人员发现：在通过微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD 产生副产品中含有大量化合物(Ⅰ)。经过进一步的实验研究得知：在微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD的过程中产生了化合物(Ⅱ)，在转化过程中，化合物(Ⅱ) 无法完全转化成为9-OH-AD，未转化完全的化合物(Ⅱ)在后处理过程中形成的化合物(Ⅰ)，导致绝大多数化合物(Ⅱ)是以化合物(Ⅰ)的形式存在副产品中。化合物(Ⅰ) 和化合物(Ⅱ)的结构如下所示：
Figure RE-GDA0002779196510000041
由于微生物转化植物甾醇制备9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮时产生的副产物种类复杂，提纯困难，副产物暂时也没有其他用处，只能直接当危险固废处理，这造成很大的资源浪费。且化合物(Ⅰ)直接用9-OH-AD的发酵方法根本无法转化得到9-OH-AD。
基于这一发现，本发明的技术人员基于自身丰富的科研经验的技术上，通过大量的实验发现创造性地通过将杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，进行重结晶，以获得纯度高的化合物(Ⅰ)，进而通过水解以获得化合物(Ⅱ)；化合物(Ⅱ) 可以进一步通过微生物转化技术制备甾体化合物，可以提高微生物制备 9-OH-AD的收率，节约资源，从而满足实际工业生产的需求。
本发明一实施方式提供了一种9-OH-AD副产物的回收利用方法，包括如下步骤S10～S30。
步骤S10、提供微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品。
步骤S20、将步骤S10获得的杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，升温浓缩，以除去二氯甲烷，然后降温结晶，得到化合物(Ⅰ)；
步骤S30、对步骤S20获得的化合物(Ⅰ)在碱性条件下进行水解反应，得到化合物(Ⅱ)。
上述化合物(Ⅰ)和上述化合物(Ⅱ)的结构如下所示：
Figure RE-GDA0002779196510000051
本发明的技术人员对其产生的副产品进行深入的分析研究中发现：化合物(Ⅰ) 在甲醇或二氯甲烷等低毒溶剂中的溶解度很差，很难对其进行分离提纯。经过大量的实验研究后，本发明的技术人员创造性地将先将杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，并控制杂质粗品、二氯甲烷和甲醇的用量为1g： (2～5)mL:(5～10)mL，然后升温浓缩，以除去二氯甲烷，最后降温结晶；从而从含有多种副产物获、成分复杂的杂质粗品中提纯得到高纯度的化合物物(Ⅰ)。该方法工艺简单环保，产物纯度高。
然后将化合物(Ⅰ)在碱性条件下水解得到化合物化合物(Ⅱ)。制得的化合物(Ⅱ)为微生物制备甾体化合物的中间产物，可以进一步应用于制备甾体化合物，从而节约了资源。
在其中一些实施例中，步骤S20中，升温浓缩的步骤中，温度升至(30～50)℃，以除去二氯甲烷。
在其中一些实施例中，步骤S30中的水解反应的具体包括如下步骤S21～S22。
步骤S21、将步骤S20制得的化合物(Ⅰ)与碱进行水解反应，酸化，过滤，得到粗产物。
步骤S21、对步骤S10制得粗产物进行打浆处理，得到化合物(Ⅱ)。
上述9-OH-AD副产物的回收利用方法能从微生物转化植物甾醇制备 9-OH-AD产生的杂质粗品中有效分离出化合物(Ⅰ)，将提纯得到的化合物(Ⅰ)与碱进行水解反应，酸化，过滤，得到粗产物；通过水解反应将化合物(Ⅰ)上的酯基转化为羧基；并对粗产物进行打浆，得到高纯度的化合物(Ⅱ)；该制备工艺简单，效率高，且制备得到高纯度的化合物(Ⅱ)为可直接用于制备甾体化合物，收率较高，从而节约了资源，避免了将副产物当危险固废处理造成资源浪费的问题。
在其中一些实施例中，步骤S30中，化合物(Ⅰ)和碱的用量为1:(0.1～0.4)。
进一步地，步骤S20中，还包括将化合物(Ⅰ)溶于有机溶剂的步骤，有机溶剂选自四氢呋喃丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的任意一种。具体地，有机溶剂选自四氢呋喃，进一步地，化合物(Ⅰ)、四氢呋喃和碱的用量为1:(3～10):(0.1～0.4)。
在其中一些实施例中，步骤S30中，碱为无机强碱，进一步地，碱选自氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
在其中一些实施例中，步骤S30中水解反应的温度为30℃～50℃。
在其中一些实施例中，步骤S30中的打浆处理采用的溶剂为有机溶剂与水的混合液，有机溶剂与水的体积比为(3～10):1；且，有机溶剂选自丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的任意一种。
在其中一些实施例中，步骤S30中的酸化步骤中，采用酸调节反应体系的 pH值至6～8。进一步地，酸选自盐酸、硫酸、硝酸及有机酸中的至少一种。
进一步地，本发明的一实施方式提供了一种9-OH-AD的制备方法，包括以下步骤S40～S60。
步骤S40、采用上述任一种回收利用方法制得的化合物(Ⅱ)。
步骤S50、将步骤S40制得的化合物(Ⅱ)制成转化培养基；其中，以转化培养基的总质量为基准，化合物(Ⅱ)的质量百分数为0.5％～1.5％。
在其中一些实施例中，步骤S50中的述转化培养基重量配方为：磷酸二氢钾0.07％～0.09％，三水磷酸氢二钾0.4～0.5％，磷酸氢二铵0.2～0.4％，葡萄糖 0.45％～0.55％，β-环糊精6％～7％，化合物(Ⅱ)0.5％～1.5％，质量浓度为20％～40％的有机硅消泡剂0.045％～0.055％，微量营养物3％～5％，其余为水。转化培养基的pH值为7～9；微量营养物3％～5％的成分包括：七水硫酸镁0.8％～1.2％，七水硫酸铁0.45％～0.55％，七水硫酸锌0.0％8～0.12％，质量浓度为20％～40％的硫酸0.05％。
步骤S60、将耻垢分枝杆菌接种于步骤S50制得的转化培养基上，转化得到化合物9-OH-AD。
9-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)具有9-羟基结构，进行简单的卤化反应后便可引入F或Cl等卤素取代基，从而有效提升某些皮质类激素，如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等药物的药效。
具体地，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)采用保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO:M2013544的耻垢分枝杆菌菌株。步骤 S50还包括生产含耻垢分枝杆菌的液体菌剂，具体步骤如下：
(1)斜面种子培养：
将斜面种子培养基灭菌，冷却后接种耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)CCTCC NO：M2013544，28～32℃，优选30℃培养3-5天。斜面种子培养基配方为：玉米浆9g/L～11g/L、硫酸铵1.3g/L～1.7g/L、磷酸二氢钾0.45 g/L～0.55g/L、磷酸氢二钾0.5g/L～0.6g/L、蔗糖0.45g/L～0.55g/L、七水硫酸镁 0.18g/L～0.22g/L、七水硫酸亚铁0.004g/L～0.006g/L、七水硫酸锌0.001g/L～ 0.003g/L、琼脂18g/L～22g/L，调节pH值为7.1g/L～7.2。优选配方为，玉米浆 10g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.55g/L、蔗糖0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.005g/L、七水硫酸锌0.002g/L、琼脂20g/L，调节pH值为7.1～7.2。
(2)一级种子培养
将液体种子培养基灭菌，冷却至室温，把上述斜面种子培养的菌落加入液体种子培养基中培养，温度为28～32℃，优选30℃，转速为200rpm，时间为48小时。液体种子培养基配方为：玉米浆9g/L～11g/L、硫酸铵1.3g/L～1.7g/L、磷酸二氢钾0.45g/L～0.55g/L、磷酸氢二钾0.5g/L～0.6g/L、蔗糖9g/L～11g/L、七水硫酸镁0.18g/L～0.22g/L、七水硫酸亚铁0.004g/L～0.006g/L、七水硫酸锌 0.001g/L～0.003g/L，调节pH值为7.1～7.2。优选配方为，玉米浆10g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.55g/L、蔗糖10g/L、七水硫酸镁 0.2g/L、七水硫酸亚铁0.005g/L、七水硫酸锌0.002g/L，调节pH值为7.1-7.2。
(3)二级种子培养
将一级种子培养后的菌液接种到上述液体种子培养基中，接种量为9％～ 11％，优选为10％，温度为28～32℃，优选为30℃，转速为200rpm，时间为 48小时，得含耻垢分枝杆菌的液体菌剂。
(4)检测二级种子培养后的菌株活性
检测培养基灭菌。将待测试的液体菌剂(二级种子培养后的液体菌剂)接种到检测培养基中，接种量4.5％～5.5％，180rpm～220rpm，28℃～32℃培养 48小时。取样送液相检测，若其中9-OH-AD浓度大于5g/L，则二级种子培养后的液体菌剂合格，适于转化。检测培养基为，磷酸氢二胺3g/L，磷酸二氢钾 1g/L，磷酸氢二钾4g/L，蔗糖5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.005g/L，七水硫酸锌0.002g/L，β-环糊精50g/L，化合物(Ⅱ)10g/L，pH为7.1～7.2。
(5)发酵培养
把上述合格的液体菌剂接种到灭菌后的步骤S50中制得的转化培养基中，接种量为10％，转化温度为28℃～32℃，优选为30℃，转速为400rpm～600rpm，转化时间为120小时，空气流量为0.18Nm3/h～0.22Nm3/h，优选为0.2Nm3/h，罐压为MPa 0.045～0.055MPa，优选为0.05MPa，
(6)分离提取
离心，分离出菌体，离心后的发酵液用氯仿提取，每次用0.5倍发酵液体积的氯仿，提取三次，合并氯仿层，浓缩至小体积，加入500毫升甲醇，浓缩至约剩余100毫升甲醇，冷却到4℃，抽滤，滤饼层用20毫升甲醇淋洗，得白色晶体的滤饼层，于70℃烘干得到9-OH-AD，重量收率为50～55％，HPLC外标含量>97％。
上述9-OH-AD的制备方法中，采用上述回收利用方法制得的化合物(Ⅱ)制成转化培养基；将耻垢分枝杆菌接种于转化培养基上；且以转化培养基的总质量为基准，控制化合物(Ⅱ)的质量百分数为0.5％～1.5％，通过微生物转化得到化合物9-OH-AD。该制备方法通过有效分离微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品，获得纯度较高的化合物(Ⅰ)，从而回收得到化合物(Ⅱ)，进一步通过微生物转化将化合物(Ⅰ)转化为9-OH-AD，从而可以提高微生物制备甾体 9-OH-AD的收率，节约资源，降低成本。
例如，在采用耻垢分枝杆菌转化植物甾醇制备9-OH-AD时，后处理中产生的固体杂质每批约占产品的2％～3％，按照本发明的技术方案将固体杂质提纯，水解制得化合物(Ⅱ)，采用微生物发酵化合物(Ⅱ)制成9-OH-AD，一方面产生了直接的经济效益，例如按每批产生产品3％的副产物，后续回收利用再按35％的 9-OH-AD收率计算，折算后，每批收率提高1％左右，也降低了危险固废处理的成本。同时，本发明的实验条件温和，生产过程的试剂的毒性小，污染小，可操作性强。
下面将结合具体的实施例对本发明进行了说明，但本发明并不局限于下述实施例，应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。
具体实施例
这里按照本发明的9-OH-AD副产物的回收利用方法及9-OH-AD的制备方法举例，但本发明并不局限于下述实施例。
实施例1～6中采用的杂质粗品为耻垢分枝杆菌发酵植物甾醇制备9-OH-AD 时，产生的杂质粗品。将10g杂质粗品溶于5mL二氯甲烷和10mL甲醇，升温至40℃浓缩以除去二氯甲烷，降温结晶、过滤得到化合物(Ⅰ)。
对化合物(Ⅰ)进行质谱测试：[M+H]＝375.24，其中M代表化合物(Ⅰ)。
对化合物(Ⅰ)进行核磁氢谱测试，测试结果如下：
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.71(s),5.45(dd,J＝15.4,13.7Hz),3.62(s),2.43(d,J＝2.5 Hz),2.22-1.89(m),1.71(ddt,J＝35.7,18.1,9.2Hz),1.53-0.96(m),0.93-0.74(m),0.65(s).核磁氢谱图如附图1所示。
对化合物(Ⅰ)进行核磁碳谱测试，测试结果如下：
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ:199.36(s),177.22(s),170.02(s),144.74(s),124.01(s),118.85(s),77.48(s),77.16(s),76.85(s),52.94(s),52.46(s),51.47(s),42.54(s),41.65(s),40.97(d,J＝3.8Hz),37.39(s),34.34(s),33.84(s),32.97(s),32.22(s),29.77(s),27.57(s),26.19(s),25.39(s),16.81(s),11.76(s).核磁碳谱图如附图2所示。
实施例1
1)将从杂质中提纯得到的30g化合物(Ⅰ)溶于150g四氢呋喃，加入60g30％的氢氧化钠水溶液。升温30℃，并保温30℃反应直至化合物(Ⅰ)全部转化。降温后用10％盐酸将反应体系的pH值调节至8。然后升温至40～45℃浓缩，回收四氢呋喃，过滤，得到滤饼。
2)将步骤1)得到的滤饼加入60ml丙酮和20ml水的混合液中，进行打浆，最后
水洗，烘干，得化合物(Ⅱ)，收率为94.5％。
3)将步骤2)得到的化合物(Ⅱ)通过微生物转化制备9-OH-AD，具体步骤如下：
(1)斜面种子培养：
将斜面种子培养基灭菌，冷却后接种耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)CCTCC NO：M2013544，30℃培养5天。斜面种子培养基配方为：玉米浆10g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.55g/L、蔗糖 0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.005g/L、七水硫酸锌0.002g/L、琼脂20g/L，调节pH值为7.1～7.2。
(2)一级种子培养
将液体种子培养基灭菌，冷却至室温，把上述(1)的斜面种子培养的菌落加入液体种子培养基中培养，培养温度为30℃，转速为200rpm，培养时间为48 小时。液体种子培养基配方为：玉米浆10g/L、硫酸铵1.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.55g/L、蔗糖10g/L、七水硫酸镁0.2g/L、七水硫酸亚铁0.005g/L、七水硫酸锌0.002g/L，调节pH值为7.1～7.2。
(3)二级种子培养
将一级种子培养后的菌液再接种到上述液体种子培养基中，接种量10％，转速为200rpm，30℃下培养48小时，得含耻垢分枝杆菌的液体菌剂。
(4)检测二级种子培养后的菌株活性
检测培养基灭菌。将待测试的液体菌剂(二级种子培养后的液体菌剂)接种到检测培养基中，接种量5.5％，220rpm，32℃培养48小时。取样送液相检测，若其中9-OH-AD浓度大于5g/L，则二级种子培养后的液体菌剂合格，适于转化。检测培养基配方为：磷酸氢二胺3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾4g/L，蔗糖5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸亚铁0.005g/L，七水硫酸锌0.002g/L，β-环糊精50g/L，化合物(Ⅱ)10g/L，pH为7.1～7.2。
(5)发酵培养
把上述合格的液体菌剂接种到灭菌后的步骤S40中制得的转化培养基中，接种量为10％，转速为600rpm，30℃下转120小时，空气流量为0.2Nm3/h，罐压为0.05MPa，转化培养基的重量配方为：磷酸二氢钾0.08％，三水磷酸氢二钾 0.42％，磷酸氢二铵0.3％，葡萄糖0.55％，β-环糊精6.65％，步骤2)制得的化合物(Ⅱ)1.5％，质量浓度为30％的有机硅消泡剂0.05％，微量营养物4％，pH值为 8。微量营养物的成分包括：七水硫酸镁1％，七水硫酸铁0.5％，七水硫酸锌0.1％，质量浓度为30％的硫酸0.05％，其余为水。
(6)分离提取
离心，分离出菌体，离心后的发酵液用氯仿提取，每次用0.5倍发酵液体积的氯仿，提取三次，合并氯仿层，浓缩至小体积，加入500毫升甲醇，浓缩至约剩余100毫升甲醇，冷却到4℃，抽滤，滤饼层用20毫升甲醇淋洗，得白色晶体的滤饼层，于70℃烘干得到9-OH-AD。9-OH-AD的收率36.5％。
对制得的9-OH-AD进行核磁氢谱测试，核磁氢谱图如附图3所示。
实施例2
1)将从杂质中提纯得到的30g化合物(Ⅰ)溶于150g四氢呋喃，加入30g30％的氢氧化钠水溶液。升温30℃，并保温30℃反应直至化合物(Ⅰ)全部转化。降温后用10％盐酸将反应体系的pH值调节至8。然后升温至40～45℃浓缩，回收四氢呋喃，过滤，得到滤饼。
2)将步骤1)得到的滤饼加入60ml丙酮和20ml水的混合液中，进行打浆，最后水洗，烘干，得化合物(Ⅱ)，收率为96.5％。
3)将步骤2)得到的化合物(Ⅱ)通过微生物转化制备9-OH-AD，具体步骤与实施例1步骤3)相同。9-OH-AD的收率38.3％。
实施例3
1)将从杂质中提纯得到的30g化合物(Ⅰ)溶于150g四氢呋喃，加入92g30％的氢氧化钠水溶液。升温30℃，并保温30℃反应直至化合物(Ⅰ)全部转化。降温后用10％盐酸将反应体系的pH值调节至8。然后升温至40～45℃浓缩，回收四氢呋喃，过滤，得到滤饼。
2)将步骤1)得到的滤饼加入60ml丙酮和20ml水的混合液中，进行打浆，最后水洗，烘干，得化合物(Ⅱ)，收率为94.0％。
3)将步骤2)得到的化合物(Ⅱ)通过微生物转化制备9-OH-AD，具体步骤与实施例1步骤3)相同。9-OH-AD的收率37.0％。
实施例4
1)将从杂质中提纯得到的30g化合物(Ⅰ)溶于150g四氢呋喃，加入60g30％的氢氧化钠水溶液。升温50℃，并保温50℃反应直至化合物(Ⅰ)全部转化。降温后用10％盐酸将反应体系的pH值调节至8。然后升温至40～45℃浓缩，回收四氢呋喃，过滤，得到滤饼。
2)将步骤1)得到的滤饼加入60ml丙酮和20ml水的混合液中，进行打浆，最后水洗，烘干，得化合物(Ⅱ)，收率为93.5％。
3)将步骤2)得到的化合物(Ⅱ)通过微生物转化制备9-OH-AD，具体步骤与实施例1步骤3)相同。9-OH-AD的收率35.5％。
实施例5
1)将从杂质中提纯得到的30g化合物(Ⅰ)溶于150g四氢呋喃，加入60g30％的氢氧化钠水溶液。升温40℃，并保温40℃反应直至化合物(Ⅰ)全部转化。降温后用10％盐酸将反应体系的pH值调节至8。然后升温至40～45℃浓缩，回收四氢呋喃，过滤，得到滤饼。
2)将步骤1)得到的滤饼加入60ml丙酮和20ml水的混合液中，进行打浆，最后水洗，烘干，得化合物(Ⅱ)，收率为96.0％。
3)将步骤2)得到的化合物(Ⅱ)通过微生物转化制备9-OH-AD，具体步骤与实施例1步骤3)相同。9-OH-AD的收率37.5％。
实施例6
1)将30g化合物(Ⅰ)溶于150g四氢呋喃，加入60g30％的氢氧化钠水溶液。升温30℃，并保温30℃反应直至化合物(Ⅰ)全部转化。降温后用10％盐酸将反应体系的pH值调节至8。然后升温至40～45℃浓缩，回收四氢呋喃，过滤，得到滤饼。
2)将步骤1)得到的滤饼加入70ml丙酮和10ml水的混合液中，进行打浆，最后水洗，烘干，得化合物(Ⅱ)，收率为95.6％。
3)将步骤2)得到的化合物(Ⅱ)通过微生物转化制备9-OH-AD，具体步骤与实施例1步骤3)相同。9-OH-AD的收率为35.5％。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于，对比例1中采用的杂质粗品为耻垢分枝杆菌发酵植物甾醇制备9-OH-AD时，产生的杂质粗品。将20g杂质粗品溶于40mL二氯甲烷和40mL甲醇，升温至40℃浓缩以除去二氯甲烷，降温结晶、过滤得到化合物(Ⅰ)。其余步骤与实施例1相同。
结果表明步骤20中制得的得化合物(Ⅱ)的收率仅为75.5％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种9-OH-AD副产物的回收利用方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供微生物转化植物甾醇制备9-OH-AD产生的杂质粗品；
将所述杂质粗品溶于二氯甲烷和甲醇的混合液，升温浓缩以除去二氯甲烷，然后降温结晶，得到化合物(Ⅰ)；
将所述化合物(Ⅰ)在碱性条件下进行水解反应，得到化合物(Ⅱ)；
其中，所述杂质粗品、所述二氯甲烷和所述甲醇的用量比为1g:(2～5)mL:(5～10)mL；所述化合物(Ⅰ)和所述化合物(Ⅱ)的结构如下所示：
Figure FDA0002684246950000011
2.如权利要求1所述的回收利用方法，其特征在于，所述水解反应的具体包括如下步骤：
将所述化合物(Ⅰ)与碱进行水解反应，酸化，过滤，得到粗产物；
对所述粗产物进行打浆处理，得到所述化合物(Ⅱ)。
3.如权利要求2所述的回收利用方法，其特征在于，所述化合物(Ⅰ)和所述碱的质量比为1:(0.1～0.4)。
4.如权利要求2所述的回收利用方法，其特征在于，所述打浆处理采用的溶剂为有机溶剂与水的混合液，所述有机溶剂与水的体积比为(3～10):1；所述有机溶剂选自丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中的任意一种。
5.如权利要求2所述的回收利用方法，其特征在于，所述碱选自氢氧化钠和氢氧化钾中的至少一种。
6.如权利要求2所述的回收利用方法，其特征在于，所述酸化的步骤中，采用酸调节反应体系的pH值至6～8。
7.如权利要求6所述的回收利用方法，其特征在于，所述酸选自盐酸、硫酸、硝酸及有机酸中的至少一种。
8.如权利要求1～7任一项所述的回收利用方法，其特征在于，所述水解反应的温度为30℃～50℃。
9.一种9-OH-AD的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用权利要求1～8任一项所述的回收利用方法制得化合物(Ⅱ)；
将所述化合物(Ⅱ)制成转化培养基；
将耻垢分枝杆菌接种于所述转化培养基上，转化得到化合物9-OH-AD；
其中，以所述转化培养基的总质量为基准，所述化合物(Ⅱ)的质量百分数为0.5％～1.5％。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述转化的温度为28℃～32℃。
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