PL207379B1

PL207379B1 - Sposób fermentacji kompozycji fitosteroli do androstadienodionu i Fusarium solani FMI 33

Info

Publication number: PL207379B1
Application number: PL371656A
Authority: PL
Inventors: James P. Kutney; Edward J. Herrington; Grigor Spassov
Original assignee: Organon Nv
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-02-03
Publication date: 2010-12-31
Also published as: EP1507867B1; EP1507867A2; WO2003064674A3; RU2004126437A; BR0307349A; ZA200406090B; BRPI0307349B1; CA2474575A1; NO20043641L; CN1639354A; AU2003240010B2; WO2003064674A2; MXPA04007401A; BRPI0307349B8; ATE518961T1; PL371656A1; NZ534342A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób fermentacji w kompozycji fitosteroli do androstadienodionu i Fusarium solani FMI 33.

Wynalazek obecny dotyczy ogólnie sposobów fermentacji, konkretnie biokonwersji kompozycji fitosteroli do androstadienodionu.

Obecnie znane są dwie główne drogi przemysłowego wytwarzania leków steroidowych. W jednej z tych dróg stosuje się diosgeninę, zaś drugie podejście oparte jest na mikrobiologicznej transformacji. Diosgenina jest steroidalnym glikonem typu spiroketalowego, wyizolowanym z roślin z rodziny Composite (Dioscorea sp.). W późnych latach 1940 i wczesnych latach 1950 tę drogę syntezy rozwinięto, opierając się głównie na następujących reakcjach chemicznych:

Droga wytwarzania związków steroidowych z zastosowaniem diosgeniny:

ADO (1,4-andfoste»)ier»-3,1?-dien)

AD ;4-ar,d^:’0'5ter>0-3.17 4mJ antykoncepcyjne estrogeny doustne kert^oWy progestyny męskie h hormony diosgewna

Aczkolwiek droga ta nadal jest ważna w produkcji steroidów w skali przemysłowej, w latach 1970 zaczęto rozważać alternatywne sposoby. Cena diosgeniny została znacznie podniesiona, zwłaszcza przez rząd meksykański i z uwagi, częściowo, na zmniejszoną zawartość diosgeniny w suchej masie roślinnej i zwiększone koszty obróbki, itd. A zatem do wytwarzania AD w przyszłości konieczne stały się alternatywne sposoby.

Jak wiadomo z intensywnych badań w przemyśle farmaceutycznym w latach 1960 i 70, wiele mikroorganizmów (np. z rodzaju Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Nocardia, Streptomyces i, zwłaszcza Mycobacterium) ma naturalną zdolność do rozkładania naturalnie występujących 3e-hydroksy-.-Y^:-steroli (takich jak cholesterol, β-sitosterol lub α-sitosterol) lub mieszaniny steroli (jak przedstawiono poniżej) na ditlenek węgla i wodę, a jako produkty pośrednie podczas tego rozkładu tworzą się 4-androsteno-3,17-dion (androstenodion) i 1,4-androstadieno-3,17dion (androstadienodion).

Związki fitosterolowe stosowane jako substraty do biotransformacji bakteryjnej:

PL 207 379 B1

β- Sitosieroi

Kampesterol

Stigjnastaaiol

Jednym z dostępnych na rynku źródeł fitosteroli są oleje pochodzenia roślinnego. Konwersja bakteryjna tych dostępnych steroli do AD i ADD stanowi szczególnie ważną drogę w przemyśle leków steroidowych.

ADD jest zasadniczym surowcem do wytwarzania różnych syntetycznych steroidów, obejmujących środki przeciwzapalne, doustne środki antykoncepcyjne, syntetyczne steroidy nadnerczowe, środki anaboliczne (stymulujące wzrost) i inne syntetyczne steroidy.

Znany sposób fermentacji zwykle obejmuje namnażanie mutanta Mycobacterium w odpowiedniej pożywce hodowlanej, przeniesienie hodowli do bioreaktora zawierającego fitosterole, a następnie pozostawienie do biotransformacji do AD i/lub ADD na około 120 godzin. Po zebraniu brzeczki fermentacyjnej, ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym i następnie po krystalizacji w rozpuszczalniku organicznym, uzyskuje się na ogół produkty AD i/lub ADD w postaci białych krystalicznych proszków.

Poniżej przedstawiono odpowiednie publikacje, w których omówiono znany sposób i zestawiono wcześniejsze badania:

S. Kraychy i R.D. Muir, patent USA nr 3,684,657 (1972).

W.J. Marsheck, S. Kraychy i R.D. Muir, Appl. Microbiol., 23, 72 (1972).

A.H. Conner, M. Nagaoka, J.W. Rowe i D. Perlman, Appl. and Environ. Microbiol., 32, 310 (1976).

K. Kieslich, J. Basic Microbiol., 25, 461 (1985).

Jeden z problemów związanych ze znanym sposobem biokonwersji fitosteroli (który jest plagą całego przemysłu steroidów) polega na złej rozpuszczalności substratu, w tym przypadku kompozycji fitosteroli, w wodnej pożywce hodowlanej. Nieodpowiednia rozpuszczalność warunkuje obecność w pożywce hodowlanej jedynie stosunkowo niskich stężeń substratu, co powoduje zły kontakt z mikroorganizmem i na ogół prowadzi do niskich wydajności produktów końcowych. Do uzyskania zadowalającego stopnia biokonwersji konieczne są na ogół długie czasy prowadzenia fermentacji. W celu uzyskania alternatywnej drogi do AD i ADD, w której istotny jest problem rozpuszczalności substratu, twórcy niniejszego wynalazku wykazali, że fitosterole (β-sitosterol, kampesterol i stigmastanol), otrzymane z „mydła dostępnego w ilościach wielotonowych w przemyśle leśnym, mogą być solubilizowane i biotransformowane ilościowo do ADD przez mutanty Mycobacterium (PCT/CA99/00267).

PL 207 379 B1

Inny problem związany ze znanym procesem biokonwersji fitosteroli polega na tym, że produkt końcowy biokonwersji fitosteroli (lub kompozycji fitosteroli) na ogół zawiera znaczne ilości zarówno AD, jak i ADD. Z uwagi na podobną strukturę chemiczną AD i ADD, oddzielenie tych dwóch produktów steroidowych jest trudne i kosztowne.

A zatem, w celu wytworzenia ADD, produkt z początkowej fermentacji (AD) należy ekstrahować, oczyścić, a następnie poddać drugiej biotransformacji, aby uzyskać ADD. Proces ten jest naturalnie kosztowny i czasochłonny, ponieważ obejmuje przerwanie fermentacji AD oraz usunięcie i oczyszczenie AD przed drugą biotransformacją.

Celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie lub zmniejszenie tych niedogodności.

Według wynalazku sposobu fermentacji kompozycji fitosteroli, z wytworzeniem androstenodionu (androst-4-eno-3,17-dionu lub „AD) i następnie androstadienodionu (androsta-1,4-dieno-3,17-dionu lub „ADD), obejmuje:

prowadzenie hodowli bakterii z rodzaju Mycobacterium w pierwszej pożywce hodowlanej; umieszczenie hodowli bakterii i kompozycji fitosteroli w bioreaktorze na czas wystarczający do transformacji kompozycji do androstenodionu (roztwór „AD); prowadzenie hodowli grzybów rodzaju Fusarium w drugiej pożywce hodowlanej; oraz następnie wstrzykiwanie 1) Fusarium sp. i/lub 2) pożywki hodowlanej dla grzybów zawierającej Fusarium sp., do bioreaktora i fermentację roztworu AD przez czas wystarczający do transformacji roztworu AD w androstadienodion.

Ważna i znaczna korzyść ze sposobu według wynalazku polega na tym, że biotransformację

AD do ADD z zastosowaniem Fusarium sp. można prowadzić w tym samym bioreaktorze, w którym prowadzi się początkową transformację bakteryjną, tj. w tym samym reaktorze, w którym wytwarza się AD z kompozycji fitosteroli. Innymi słowy, AD wytworzonego w początkowym etapie fermentacji nie usuwa się z bioreaktora (co jest znane i praktykowane w stanie techniki), ale w celu transformacji roztworu AD w ADD bioreaktor zaszczepia się (jak opisano bardziej szczegółowo poniżej) 1) hodowlą grzybów Fusarium sp., i/lub 2) pożywką do hodowli grzybów zawierającą Fusarium sp. Nieoczekiwanie stwierdzono, że Fusarium sp., a zwłaszcza korzystny szczep, jak ujawniono poniżej, zachowuje zdolność do transformowania AD w ADD, niezależnie od obecności resztkowej hodowli bakteryjnej.

Tak więc, sposób według wynalazku nie obejmuje przerywania początkowej fermentacji AD, albo usuwania i oczyszczania AD przed drugą biotransformacją. Zaoszczędza się znacznie czas, energię i surowce.

Przedmiotem wynalazku jest również nowy mikroorganizm z rodzaju Fusarium, który zdeponowano w ATCC jako Fusarium solani FMI 33 pod numerem PTA-3947, dnia 21 grudnia 2001.

Korzystnie, mikroorganizmem jest Mycobacterium MB 3683.

Korzystnie jako grzyby stosuje się Fusarium solani lub Fusarium oxysporu.

Korzystnie hodowlą grzybów jest hodowla Fusarium solani FMI33 zdeponowanego w ATCC jako PTA-3947.

Korzystnie stosuje się kompozycję fitosteroli, która pochodzi ze smoły oleju talowego lub z pulpy mydlanej.

Również korzystna jest kompozycja fitosteroli pochodząca z oleju roślinnego. Korzystnie taka kompozycja pochodzi z oleju roślinnego, który jest wybrany z grupy obejmującej olej sojowy, olej z nasion rzepaku, olej kukurydziany, olej z nasion bawełny, olej słonecznikowy, olej z oliwek, olej z nasion lnu lub olej z otrąb ryżowych.

Korzystnie kompozycja fitosteroli obejmuje jeden lub więcej spośród następujących fitosteroli: sitosterol, kampesterol, stigmasterol, brassicasterol, desmosterol, chalinosterol, poriferasterol, klionasterol, wszystkie ich uwodornione odpowiedniki oraz wszystkie naturalne i syntetyczne postaci i pochodne, łącznie z izomerami.

Korzystnie pierwsza pożywka hodowlana zawiera melasę rafinowaną i nieorganiczne sole, a druga pożywka hodowlana zawiera glukozę i namok kukurydziany.

Korzystnie fermentacje prowadzi się przy dostępie tlenu.

Korzystnie kompozycję fitosteroli rozpuszcza się do postaci roztworu, stosując czynnik solubilizujący, a następnie dodaje się do reaktora.

Korzystnie czynnik solubilizujący należy do rodziny glikoli i korzystnie jest nim glikol polipropylenowy.

Korzystnie też czynnik solubilizujący należy do rodziny silikonów.

PL 207 379 B1

Korzystnie przed wstrzyknięciem 1) hodowli grzybów i/lub 2) pożywki z hodowlą grzybów bioreaktor sterylizuje się, a następnie oziębia.

Wynalazek zilustrowano następującymi, nieograniczającymi, rysunkami, na których:

Na Fig. 1 przedstawiono schemat ilustrujący bakteryjną konwersję fitosteroli w ADD sposobem według wynalazku; oraz

Na Fig. 2 przedstawiono schemat blokowy ilustrujący korzystny sposób biotransformacji AD do ADD z zastosowaniem Fusarium solani sposobem według wynalazku.

W celu umoż liwienia specjalistom w tej dziedzinie techniki realizacji wynalazku przedstawiono poniżej następujący szczegółowy opis. Jednakże, poniższy szczegółowy opis nie ogranicza nadmiernie zakresu wynalazku. Do omówionych tu wykonań specjalista w tej dziedzinie techniki może wprowadzać modyfikacje i zmiany, bez wykraczania poza istotę i zakres wynalazku.

W pierwszym etapie obecnego wynalazku prowadzi się hodowlę bakterii rodzaju Mycobacterium w pożywce hodowlanej. W technice znanych jest i dostępnych wiele odpowiednich ośrodków i warunków do hodowli, a zatem wynalazek nie ogranicza się do konkretnych z nich. Niemniej jednak, w korzystnej postaci, Mycobacteria sp. hoduje się w poż ywce do hodowli zaszczepiają cej, obejmującej melasę rafinowaną (Rafiners), azotan sodu, fosforan amonu i glukozę. Odpowiednie pożywki hodowlane opisano w patencie USA nr 6,071,174 na rzecz Kutney i in.

Pożywki hodowlane wymagane do hodowli Mycobacteria sp. i Fusarium sp. powinny zawierać przyswajalny azot i węgiel i należy zapewnić im odpowiedni dostęp sterylnego powietrza, na przykład przez eksponowanie dużej powierzchni pożywki na powietrze lub przez przepuszczenie przez pożywkę powietrza w ilościach wystarczających do prowadzenia hodowli zanurzeniowej.

Odpowiednimi źródłami azotu są powszechnie stosowane do tego celu źródła obejmujące mączkę sojową, mączkę bawełnianą, strawioną przez trzustkę kazeinę, mączkę rybną, namok kukurydziany, ekstrakt mięsny, białko, autolizowane drożdże browarniane ze stałymi substancjami mlecznymi, pepton, ekstrakt drożdżowy, hydrolizat kazeiny, azotany i/lub związki amonowe. Większość spośród tych substancji można również stosować jako źródło węgla. Inne substancje zawierające węgiel obejmują węglowodany, takie jak gliceryna, glukoza, fruktoza, sacharoza, laktoza, maltoza, inozytol, dekstryna, melasa, skrobia i serwatka. Korzystnie można również stosować kombinacje tych źródeł węgla i azotu.

W razie potrzeby, jako czynniki promujące hodowlę, można również wprowadzać jony fosforanowe, magnezowe i/lub żelaza, a w celu rozpoczęcia hodowli przy zasadniczo obojętnym pH można dodawać bufory. Korzystne mogą być również środki przeciwpieniące. Gdy zamiast nienaruszonych i wzrastają cych mikroorganizmów do zaindukowania fermentacji stosuje się wyizolowane komórki lub enzymy, wówczas substancje odżywcze nie są konieczne, ale w innych przypadkach stosuje się zwykle głównie pożywkę wodną.

W drugim etapie według wynalazku, substrat (kompozycj ę fitosteroli) korzystnie rozpuszczony w odpowiednim rozpuszczalniku, lub w jego zemulgowanej postaci, i hodowlę bakteryjną dodaje się do bioreaktora. Fermentację prowadzi się do momentu uzyskania maksymalnej konwersji substratu (fitosteroli w roztwór AD).

Można stosować każdy czynnik emulgujący, jeśli ułatwia on mieszanie substratu-fitosteroli w rozpuszczalniku, co tym samym zwię ksza moż liwość kontaktu substratu z hodowlą mikrobakteryjną. Przykłady obejmują, ale nie wyłącznie, addukty tlenków etylenu lub estry kwasów tłuszczowych i poliglikoli oraz środki dostępne na rynku pod nazwami Tegin™, Tween™ i Span™.

W alternatywnym sposobie, można stosować czynniki solubilizujące, które ułatwiają rozpuszczenie kompozycji fitosteroli i uzyskanie klarownego roztworu, zapewniając tym samym doskonały kontakt z mikroorganizmem stosowanym do biokonwersji. Te wybrane odpowiednie czynniki solubilizujące, które obejmują przedstawicieli z rodziny glikoli i z rodziny silikonów, zapewniają wysokie stężenia fitosteroli, które mają być rozpuszczone w pożywce hodowlanej. Zapewnia to również doskonały kontakt z mikroorganizmem, zmniejsza czas fermentacji oraz daje stosunkowo wysokie wydajności produktów końcowych. Korzystne są czynniki solubilizujące znane w technice, takie jak olej słonecznikowy.

W trzecim etapie wedł ug wynalazku, prowadzi się hodowlę grzybów z rodzaju Fusarium w drugiej pożywce hodowlanej. Jak opisano powyżej, w technice znanych jest wiele pożywek i warunków odpowiednich do hodowli, a zatem wynalazek nie ogranicza się do konkretnie określonych. Niemniej jednak, w korzystnej postaci, hodowlę Fusarium sp. prowadzi się w pożywce dla hodowli zaszczepiającej obejmującej namok kukurydziany i glukozę.

PL 207 379 B1

W czwartym etapie wedł ug wynalazku, w celu transformacji roztworu AD do ADD, do bioreaktora zawierającego roztwór AD wstrzykuje się 1) Fusarium sp. i/lub 2) pożywkę do hodowli grzybów (zawierającą enzymy grzybów), zawierającą Fusarium sp. W korzystnym wykonaniu, przed wstrzykiwaniem bioreaktor sterylizuje się (na przykład przez ogrzewanie do temperatury około 120°C) w celu zabicia bakterii.

Najprostszym i najbardziej ekonomicznym sposobem tego „wstrzykiwania jest zaszczepienie sterylizowanego bioreaktora pewną ilością pożywki do hodowli grzybów. Jednakże, alternatywnie, można wydzielić komórki grzybów z pożywki hodowlanej, na przykład przez odwirowanie, i wstrzyknąć te komórki. Ponadto, komórki można rozerwać, stosując ultradźwięki lub innym sposobem, aby ułatwić dostęp obecnych enzymów, które można wyodrębnić przez przesączenie lub ekstrakcję rozpuszczalnikiem, takim jak aceton i woda, a następnie wstrzyknąć do bioreaktora zamiast pożywki lub komórek grzybów.

Optymalne stężenie substratu, czas dodawania substratu oraz czas fermentacji w każdej z dwóch opisanych „faz (transformacja fitosteroli do AD i AD do ADD) zależy od rodzaju stosowanych mikroorganizmów i warunków fermentacji. Specjalista w tej dziedzinie będzie w stanie określić warunki bez zbędnych doświadczeń.

W najkorzystniejszym wykonaniu obecnego wynalazku biokonwersję kompozycji fitosteroli do AD prowadzi się stosując Mycobacterium MB 3683. W najkorzystniejszym wykonaniu obecnego wynalazku biokonwersję AD do ADD prowadzi się stosując Fusarium solani albo Fusarium oxysporum.

Zgodnie z jednym z wykonań obecnego wynalazku, w wyniku mutacji F. solani, z zastosowaniem nitrozoguanidyny, otrzymano nowego mutanta, który jest szczególnie skuteczny do transformacji AD do ADD w tym samym naczyniu reakcyjnym, w którym prowadzono transformację steroidów do AD, tj. bez konieczności oddzielania AD z pierwszego etapu fermentacji. Ten zmutowany mikroorganizm zdeponowano w celach patentowych w organie depozytowym pod oznaczeniem PTA-3947 w American Type Culture Collection („ATCC), 10801 University Blvd., Manassas VA, USA, 201102209. Subkultura tego mikroorganizmu jest dostępna na żądanie, ale należy rozumieć, że dostępność taka nie jest równoznaczna z pozwoleniem na realizację przedmiotowego wynalazku.

Na Fig. 1 przedstawiono etapy fermentacji bakterii i grzybów zgodnie z jednym z wykonań wynalazku, w którym fitosterole są transformowane przez Mycobacterium sp. do AD, a następnie AD jest transformowany do ADD i boldenonu przez Fusarium sp.

Na Fig. 2 zilustrowano inne wykonanie wynalazku, w którym ADD wytworzono bezpośrednio ze źródła AD. Prowadzi się hodowlę Fusarium sp., a następnie inokulum dodaje się do reaktora zawierającego AD w warunkach fermentacji. Następnie wyodrębnia się i oczyszcza ADD.

Fitosterole/Fitostanole

Stosowane tu określenie „kompozycja fitosteroli obejmuje wszystkie sterole bez ograniczeń, na przykład: sitosterol, kampesterol, stigmasterol, brassikasterol (obejmujący dihydrobrassikasterol), desmosterol, chalinosterol, poriferasterol, klionasterol, ergosterol, koprosterol, kodisterol, izofukosterol, fukosterol, klerosterol, nerwisterol, latosterol, stellasterol, spinasterol, chondrillasterol, peposterol, avenasterol, izoavenasterol, fekosterol, pollinastasterol, cholesterol oraz wszystkie naturalne i syntetyczne postaci i pochodne, łącznie z izomerami, jak również wszystkie uwodornione odpowiedniki („fitostanole). Fitostanole obejmują wszystkie nasycone lub uwodornione fitosterole oraz wszystkie ich naturalne lub syntetyczne postaci i pochodne, łącznie z izomerami. Należy również rozumieć, że w całym opisie określenie „kompozycja fitosteroli może obejmować fitosterole i fitostanole.

Sterole i stanole do stosowania w biotransformacji według wynalazku mogą pochodzić z różnych naturalnych źródeł. Przykładowo, można je otrzymać z przeróbki olejów roślinnych (łącznie z roślinami wodnymi), takich jak olej kukurydziany i inne oleje roślinne, olej z ziaren pszenicy, ekstraktu sojowego, ekstraktu ryżowego, otręb ryżowych, oleju z nasion rzepaku, oleju słonecznikowego, oleju sezamowego i oleju rybnego (lub innych źródeł pochodzących z morza). Mogą one również pochodzić od grzybów, jak na przykład ergosterol. Tak więc, wynalazek obecny nie ogranicza się do jednego źródła steroli. W patencie USA nr seryjny 4,420,427 opisano wytwarzanie steroli ze szlamu olejów roślinnych, z zastosowaniem rozpuszczalników, takich jak metanol. Alternatywnie, fitosterole i fitostanole można otrzymać ze smoły oleju talowego lub pulpy mydlanej, produktów ubocznych w przemyśle drzewnym, jak opisano w patencie USA nr seryjny 5,770,749.

Podczas procesu fermentacji korzystnie temperaturę utrzymuje się w zakresie około 30-37°C, a bardziej korzystnie od 25-35°C. Gdy podczas fermentacji monitorowano pH, zaobserwowano, że

PL 207 379 B1 może się ono zmieniać od około 7,0 w okresie początkowym do około 4,7 w czasie zbioru. Po zakończeniu procesu fermentacji lub transformacji ADD odzyskuje się sposobami znanymi w technice.

Następujące przykłady odnoszą do skali laboratoryjnej. Jednakże, stosując znane techniki opisany tu wynalazek można również zrealizować w skali przemysłowej.

P R Z Y K Ł A D 1. BIOTRANSFORMACJA FITOSTEROLI DO ADD Z ZASTOSOWANIEM MYCOBACTERIUM SP. I FUSARIUM SOLANI

Biotransformacja z zastosowaniem Mycobacterium sp. (Etap 1)

Przygotowanie pożywki do posiewu Mycobacterium sp.

Przygotowano inokulum do biotransformacji w hodowli ciekłej. Kolby Erlenmeyera inokulowano ze skosu agarowego (hodowanego w szklanej probówce do badań). Dla objętości roboczych do 40 l stosowano 1-litrowe kolby Erlenmeyera, z których każda zawierała po 200 ml pożywki hodowlanej do posiewu, a dla objętości do 50 l i większych stosowano 2-litrowe kolby Erlenmeyera, z których każda zawierała po 400 ml pożywki. Inokulację prowadzono w sterylnych warunkach (pod wyciągiem Biohazard). Na skos agarowy odpipetowano sterylną wodę (5 ml). Z końca pipety delikatnie zdrapano hodowlę bakteryjną. Następnie zawieszoną hodowlę przeniesiono pipetą do kolb Erlenmeyera. Hodowlę bakteryjną prowadzono na wytrząsarce obrotowej (200 obr./min., skok 1, temperatura otoczenia 30°C). Po 72 godzinach inkubacji hodowla zaszczepiająca jest gotowa do przeniesienia do bioreaktora. Nie zaleca się długiego przechowywania hodowli zaszczepiającej przed inokulacją.

Poniżej przedstawiono protokół hodowli zaszczepiającej:

pożywka: skład dla hodowli zaszczepiającej (na 1 l) ml melasy rafineryjnej (cukier BC)

5,4 g NaNO3

0,6 g NH4H2PO4 6,0 g glukozy pH doprowadzone do wartości 7,0 objętość pożywki: 200 ml/kolbę objętość inokulum: 3 ml zawiesiny komórek ze skosu agarowego na 200 ml nowej pożywki naczynie: 1000 ml kolba Erlenmeyera mieszanie: wytrząsarka (skok 1), 200 obr./min.

temperatura: 30°C czas wzrostu: 72 godziny inkubacji

Komentarz: Dobry wzrost hodowli wskazuje wytworzony na dnie zabarwiony na żółto osad komórkowy.

Przygotowanie pożywki do biotransformacji dla doświadczeń z 3 l objętością roboczą z zastosowaniem Mycobacterium sp.

Tę procedurę przygotowania pożywki stosowano tylko dla objętości roboczych 3 l. Poniżej opisano procedurę w większej skali.

Skład pożywki do biotransformacji jest następujący: pożywka: pożywka do biotransformacji (dla 3 litrów pożywki)

162 ml sterylizowanej melasy (cukier BC) (5,4% obj./obj.)

16,2 g NaNO3 (0,54%)

1,8 g NH4H2PO4 (0,06%) substrat: 30,0 g fitosterolu roślinnego (1,0%) emulgator: 480 ml oleju słonecznikowego

Na jeden dzień przed stosowaniem wymaganą ilość melasy rafineryjnej (162 ml) zmieszano z wodą (300 ml) i sterylizowano (121°C przez 20 minut) w kolbie Erlenmeyera.

W kolbie lub w zlewce wody (2,0 l) zmieszano składniki pożywki (oprócz fitosterolu i oleju słonecznikowego). pH pożywki doprowadzono do wartości 8,1 dodatkiem 1M roztworu NaOH (40 g/l NaOH) i pożywkę przeniesiono do bioreaktora, a następnie ogrzewano do temperatury 60-70°C.

Fitosterole (30 g) odważono w zlewce i dodano olej słonecznikowy (480 ml) i mieszaninę mieszano podczas ogrzewania na gorącej płycie, aż olej stał się klarowny. Na ogół uzyskuje się to w temperaturze około 120°C. Klarowny żółty roztwór fitosterolu w oleju bez mieszania przelano do ogrzanej wcześniej ciekłej pożywki (60-70°C) w bioreaktorze.

PL 207 379 B1

Fermentor wysterylizowano (121°C przez 30 minut) i oziębiono do temperatury 30°C.

Powyższą procedurę przygotowania pożywki stosowano jedynie dla 3 l objętości roboczych.

Komentarz: Pożywka do biotransformacji zawiera 7% suchej substancji (pomiar refraktometryczny).

Przygotowanie pożywki do biotransformacji do badań w skali przemysłowej z zastosowaniem Mycobacterium sp.

Powyższą procedurę przygotowania pożywki stosowano do objętości roboczych 40 l lub powyżej.

T a b l i c a 1

Skład fitosteroli roślinnych według producenta # Nazwa Rt(min.) Ilość (%)

Mono C16	_*	9,378	0,10
Mono C18 7	_*	10,698	0,12
d-Tokoferol	**	11,291	0,18
γ-Tokoferol	**	11,900	0,12
Cholesterol	***C	12,625	0,29
α-Tokoferol	**	12,726	0,03
Brassikasterol	***	12,893	4,43
Kampesterol	***	13,253	27,71
Kampestanol	***	13,301	0,44
Stigmasterol	***	13,438	18,13
β-Sitosterol	***	13,765	44,88
Sitostanol	***	13,855	1,15
MAG (*)			0,22
Tokoferole (**)			0,33
Sterole (***)			95,05
Stanole (***)			1,59
Cholesterol (***^C)			0,29
Fitosterole+Cholesterol			96,93

Skład pożywki był następujący:

pożywka: pożywka do biotransformacji (na litr pożywki) ml sterylizowanej melasy (cukier BC) (5,4% obj./obj.)

5,4 g NaNO3 (0,54%)

0,6 g NH4H2PO4 (0,06%) substrat: 10,0 g fitosterolu roślinnego (1,0%) emulgator: 160 ml oleju słonecznikowego (16%)

Na 1 dzień przed stosowaniem wymaganą objętość melasy rafineryjnej (54 ml/l pożywki) zmieszano z wodą (100 ml/l pożywki) i wysterylizowano.

Wszystkie składniki (łącznie z konieczną ilością wody, ale bez fitosteroli i oleju słonecznikowego) zmieszano razem i mieszano w fermentorze, z wytworzeniem klarownego roztworu. Wymaganą ilość wody obliczono przez odjęcie objętości melasy, oleju i inokulum od żądanej objętości końcowej. pH pożywki doprowadzono do wartości 8,1 dodatkiem wodnego roztworu NaOH (20%). Do pożywki dodano fitosterole i olej słonecznikowy i fermentor wysterylizowano (121°C, 30-60 minut).

PL 207 379 B1

Biotransformacja w fermentorze z zastosowaniem Mycobacterium

Biokonwersję prowadzono w fermentorach ze stali nierdzewnej, ze skutecznym mieszaniem w dnie. W Tablicy 2 przedstawiono główne parametry stosowanych fermentorów. Temperaturę pożywki w fermentorze doprowadzono do wartości 30°C i wprowadzono inokulum w sterylnych warunkach. Cały proces prowadzono w 30°C. W etapie tym od początku do końca monitorowano pH i sterylność procesu. Po 40 godzinach rozpoczęto monitorowanie substratu (fitosteroli) i produktu (AD). Poniżej podano szczegóły prowadzonych analiz (HPLC, GC). W czasie procesu pH mieszaniny do biotransformacji zwykle zmienia się w zakresie 1 jednostki i nie jest korygowane. Biotransformację uważa się za zakończoną z chwilą uzyskania maksymalnego stężenia produktu (AD) w warstwie piany lub gdy stężenie substratu (fitosterolu) osiągnie wartość 1/20 stężenia początkowego.

T a b l i c a 2

Parametry fermentacji fitosterolu z zastosowaniem Mycobacterium sp.

Parametr	Wartość
Całkowita objętość (l)	10	40	100	1000	5000
Objętość robocza (l)	3	30	50	500	2500
Objętość inokulum (l)	0,4	3,0	2,4	50	500
Wiek inokulum (godz.)	72	72	72	48-70	48-70
Napowietrzenie (l/l/min.)	0,2	0,2	1,0	1,0	1,0
Mieszanie (obr./min.)	300	300	200	200	200

Uwaga: W celu uzyskania maksymalnego kontaktu z mikroorganizmem wymagane jest wysoce skuteczne mieszanie. Dobra emulsja na ogół charakteryzuje się wyglądem „koktajlu mlecznego.

Uwagi dotyczące morfologii (obserwacje pod mikroskopem świetlnym): Na każdym etapie, od skosu agarowego do końcowego zbioru, morfologia komórek pozostaje taka sama, to znaczy komórki mają bipolarne jądra i są w kształcie pręcików.

Biotransformacja z zastosowaniem Fusarium solani (Etap 2).

Przygotowanie hodowli zaszczepiającej Fusarium solani

W ciekłej pożywce (10 g/l namoku kukurydzianego, 10 g/l glukozy, pH 6,5) prowadzono hodowlę grzybów Fusarium solani. Kolby Erlenmeyera (1 l objętości, 0,2 l pożywki) inokulowano hodowlą wzrastającą na agarze z mączką owsianą przez 120 godzin w temperaturze 30°C. Hodowlę w ciekłej pożywce prowadzono w wytrząsarce obrotowej (26°C, 120 obr./min., skok 1) przez 72 godziny.

Można również prowadzić subhodowlę Fusarium przez przeniesienie z cieczy do ciekłej pożywki aż do 4-5 pokolenia lub do momentu, w którym następna hodowla zmieni zabarwienie na różowe.

Inokulum w kolbach wytrząsarki można przechowywać w temperaturze 4°C w czasie aż do 1 miesiąca, bez znaczącej zmiany aktywności.

Droga wytwarzania związków steroidowych z zastosowaniem dios geniny:

Preparat do biotransformacji z zastosowaniem Fusarium solani

Drugi etap biotransformacji prowadzono stosując całą brzeczkę z biotransformacji z pierwszego etapu.

Po zakończeniu transformacji fitosteroli do AD do brzeczki z pierwszego etapu dodano konieczne składniki (10 g/l glukozy, 10 g/l namoku kukurydzianego) i pH doprowadzono do wartości 6,7 dodatkiem wodnego HCl (4%). Brzeczkę sterylizowano (121°C, 30 minut) i temperaturę doprowadzono do 30°C.

Biotransformacja AD do ADD z zastosowaniem brzeczki z etapu 1 i Fusarium solani

Biokonwersję prowadzono w fermentorach ze stali nierdzewnej, ze skutecznym mieszaniem na spodzie. W Tablicy 3 przedstawiono główne parametry stosowanych fermentorów. Temperaturę pożywki w fermentorze doprowadzono do wartości 30°C i w sterylnych warunkach wprowadzono inokulum.

PL 207 379 B1

T a b l i c a 3

Parametry fermentacji fitosteroli z zastosowaniem Fusarium solani

Parametr	Wartość
Całkowita objętość (l)	10
Objętość robocza (l)	3,0
Objętość inokulum (l)	0,2
Wiek inokulum (godz.)	72
Napowietrzenie (l/l/min.)	0,2
Mieszanie (obr./min.)	200

Cały proces prowadzono w temperaturze 30°C. W etapie tym od początku do końca monitorowano pH i sterylność procesu. Po 15 godzinach rozpoczęto monitorowanie substratu (AD) i produktu (ADD). Szczegóły dotyczące procedur analitycznych (HPLC, GC) podano w Przykładzie 4. W Przykładzie 4 podano wyniki monitorowania procesu. W czasie procesu pH mieszaniny do biotransformacji zwykle zmienia się w zakresie 1 jednostki i nie jest korygowane. Biotransformację uważa się za zakończoną z chwilą uzyskania maksymalnego stężenia produktu (ADD) w warstwie piany lub gdy stężenie substratu (AD) osiągnie wartość 1/20 stężenia początkowego. Proces kończy się sterylizacją (121°C, 30 minut).

P R Z Y K Ł A D 2. JEDNOETAPOWA BIOTRANSFORMACJA AD DO ADD Z ZASTOSOWANIEM FUSARIUM SOLANI

Przygotowanie hodowli zaszczepiającej Fusarium solani

Przygotowanie pożywki do biotransformacji dla Fusaritim solani

Proces prowadzono stosując już wyizolowany AD.

Pożywka do biotransformacji miała następujący skład

pożywka:	pożywka do biotransformacii (dla 3 litrów pożywki) 30 g glukozy 30 ml namoku kukurydzianego (obj./obj.)	(10%) (10%)
substrat:	30,0 g AD	(1,0%)
emulgator:	480 ml oleju słonecznikowego	(16%)

W kolbie lub w zlewce wody (2,5 l) zmieszano składniki pożywki (oprócz AD i oleju słonecznikowego). pH pożywki doprowadzono do wartości 6,5 dodatkiem 1M roztworu NaOH (40 g/l NaOH) i pożywkę przeniesiono do bioreaktora, a następnie ogrzewano do temperatury 60-70°C.

Dodano odważony w zlewce AD (30 g) i olej słonecznikowy (480 ml) i mieszaninę mieszano podczas ogrzewania na gorącej płycie, aż olej stał się klarowny. Klarowny żółty roztwór AD w oleju bez mieszania przelano do ogrzanej uprzednio ciekłej pożywki (60-70°C) w bioreaktorze.

Biotransformacja AD do ADD w fermentorze ze stali nierdzewnej

Biokonwersję prowadzono w fermentorach ze stali nierdzewnej, ze skutecznym mieszaniem na spodzie. W Tablicy 4 przedstawiono główne parametry stosowanych fermentorów. Temperaturę pożywki w fermentorze doprowadzono do wartości 30°C i w sterylnych warunkach wprowadzono inokulum. Cały proces prowadzono w temperaturze 30°C. W etapie tym od początku do końca monitorowano pH i sterylność procesu. Po 15 godzinach rozpoczęto monitorowanie substratu (AD) i produktu (ADD). Poniżej podano szczegóły dotyczące procedur analitycznych (HPLC, GC) i uzyskane wyniki. W czasie procesu pH mieszaniny do biotransformacji zwykle zmienia się w zakresie 1 jednostki i nie jest koryPL 207 379 B1 gowane. Biotransformację uważa się za zakończoną z chwilą uzyskania maksymalnego stężenia produktu (ADD) w warstwie piany lub gdy stężenie substratu (AD) osiągnie wartość 1/20 stężenia początkowego. Proces kończy się sterylizacją (121°C, 30 minut).

T a b l i c a 4

Parametry fermentacji fitosterolu z zastosowaniem Fusarium solani

P R Z Y K Ł A D 3. EKSTRAKCJA BRZECZKI FERMENTACYJNEJ

Brzeczkę fermentacyjną zebrano do rozdzielacza. Do brzeczki dodano octanu etylu (6,0 l) i całość wytrząsano przez 2-3 minuty. Po 15 minutach mieszaninę rozdzielono na dwie warstwy (warstwa górna z octanem etylu i wodna warstwa dolna). Warstwę z octanem etylu usunięto i przeniesiono do innego naczynia. Dolną warstwę wodną ekstrahowano drugą porcją octanu etylu (4,0 l), po czym górną warstwę (z octanem etylu) usunięto i połączono z pierwszym ekstraktem w octanie etylu. Połączone ekstrakty w octanie etylu zatężono na wyparce obrotowej i otrzymano czerwony gęsty olej (około 450 ml), który stosowano do dalszego oczyszczenia.

Wszystkie ekstrakty w octanie etylu i wodną pozostałość badano metodą HPLC na zawartość steroidów. W Tablicy 5 przedstawiono wyniki dla dwuetapowego sposobu, a w Tablicy 6 przedstawiono wyniki dla jednoetapowego sposobu.

Oddzielenie ADD od oleju

Oleistą pozostałość (około 450 ml) zmieszano dokładnie z heksanami (1,25 ml). Roztwór olej-heksany ekstrahowano MeOH (2,0 l x 2). Dwa ekstrakty w metanolu połączono i odparowywano do suchości i uzyskano beżową oleistą pozostałość. Pozostałość tę wysuszono pod próżnią. W celu określenia czy rozdzielanie zostało zakończone, wszystkie warstwy heksanowe i metanolowe analizowano metodą HPLC.

A) Krystalizacja ADD z dwuetapowej fermentacji fitosteroli do ADD

Pierwsza krystalizacja

W niektórych przypadkach pozostałość po odparowaniu metanolu suszono pod próżnią. Jeśli miało to miejsce, pozostałość tę (około 40-50 g, zawartość ADD 17-18 g, czystość 30-40% zgodnie z HPLC) rozpuszczano w octanie etylu (100 ml).

Gdy pozostałości po odparowaniu metanolu nie suszono pod próżnią, wówczas pozostałość tę rozpuszczano w octanie etylu (250 ml), suszono nad Na2SO4 i zatężano do mniejszej objętości (100 ml).

Dodano węgla drzewnego (4,0 g) i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Po oziębieniu mieszaninę przesączono na lejku ze spiekanego szkła i filtr przemyto octanem etylu. Alternatywnie, roztwór można przesączyć przez wkładkę Celite i przemyć octanem etylu. Przesącz zatężono na wyparce obrotowej do suchości. Dodano heksanów (200 ml) i mieszaninę mieszano pod chłodnicą zwrotną przez 20 minut, oziębiono do temperatury pokojowej i pozostawiono na 30 minut w celu rozdzielenia. Górną warstwę z heksanami przeniesiono do innego naczynia i pozostawiono do wykrystalizowania po odstaniu przez noc. Z roztworu w heksanach odsączono kryształy ADD, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1), wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano białe kryształy ADD (0,23 g). Lepki olej rozpuszczono w octanie etylu (8 ml) i mieszano z ogrzewaniem przez 10 minut. Roztwór oziębiono do temperatury pokojowej i pozostawiono do odstania przez noc. Kryształy ADD odsączono, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując białe kryształy ADD (2,51 g). Kryształy i roztwór macierzysty analizowano metodą HPLC.

Druga krystalizacja

Roztwór macierzysty po pierwszej krystalizacji zatężono na wyparce obrotowej. Dodano octanu etylu i mieszaninę mieszano pod chłodnicą zwrotną przez 10 minut, oziębiono do temperatury poko12

PL 207 379 B1 jowej i pozostawiono do wykrystalizowania przez noc. Kryształy ADD odsączono, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując białe kryształy ADD (1,25 g). Produkt i roztwór macierzysty analizowano metodą HPLC.

T a b l i c a 5

Wyniki ekstrakcji i oddzielania produktu (ADD) z dwuetapowego procesu

Przykład	Ekstrakcja z użyciem EtOAc	Rozdzielanie z użyciem MeOH
Nr	Czas (godz.)	Substrat (g)	ADD (g)	AD (g)	Boldenon (g)	ADD (g)	AD (g)	Boldenon (g)
444	90/46	30	6,86	0,80	1,08	6,29	0,08	0,95
445	91/42	30	6,71	0,90		3,92	1,25	2,48
446	73/22	30	5,85	2,50	1,47	5,72	2,07	1,22
447	71/23	30	12,10	1,46	2,00	11,92	1,18	1,82

Trzecia krystalizacja

Roztwór macierzysty po drugiej krystalizacji zatężono na wyparce obrotowej. Mieszaninę octanu etylu (2 ml) i heksanów (1 ml) mieszano ogrzewając pod chłodnicą zwrotną przez 10 minut, oziębiono do temperatury pokojowej i pozostawiono do wykrystalizowania przez noc. Kryształy ADD odsączono, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując białe kryształy ADD (0,16 g). Produkt i roztwór macierzysty analizowano metodą HPLC.

Łączna ilość wykrystalizowanego ADD wynosi 4,25 g.

B) Wyizolowanie ADD z jednoetapowej fermentacji AD do ADD

Pierwsza krystalizacja

Gdy pozostałość po odparowaniu metanolu była suszona pod próżnią, pozostałość tę (około 40-50 g, zawartość ADD 17-18 g, czystość 30-40% według HPLC) rozpuszczano w octanie etylu (150 ml).

Gdy pozostałości po odparowaniu metanolu nie suszono, wówczas rozpuszczano ją w octanie etylu (250 ml), suszono nad Na2SO4 i zatężano do mniejszej objętości (150 ml).

Dodano węgla drzewnego (4,0 g) i mieszaninę ogrzewano do wrzenia pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę. Po oziębieniu mieszaninę przesączono na lejku ze spiekanego szkła i filtr przemyto octanem etylu. Alternatywnie, roztwór można przesączyć przez wkładkę Celite i przemyć octanem etylu. Przesącz zatężono na wyparce obrotowej do suchości, po czym pozostałość rozpuszczono w octanie etylu (6 ml) z jednoczesnym ogrzewaniem, a następnie oziębiono do temperatury pokojowej w celu krystalizacji. Po odstaniu przez noc, kryształy ADD odsączono, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1) i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując białe kryształy ADD. Kryształy i roztwór macierzysty analizowano metodą HPLC.

Druga krystalizacja

Roztwór macierzysty po pierwszej krystalizacji zatężono na wyparce obrotowej. Dodano heksanów (50 ml) i mieszaninę mieszano ogrzewając pod chłodnicą zwrotną przez 1 godzinę, oziębiono do temperatury pokojowej i pozostawiono na 30 minut do rozdzielenia. Górną warstwę z heksanami przeniesiono do drugiego naczynia i pozostawiono do odstania na noc w celu krystalizacji. Lepki olej zmieszano z octanem etylu (2 ml), heksanami (1 ml) i mieszano podczas ogrzewania przez 10 minut. Roztwór oziębiono do temperatury pokojowej i pozostawiono do odstania przez noc. Kryształy ADD odsączono, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1), wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano białe kryształy ADD. Z warstwy z heksanami również uzyskano jedną porcję kryształów ADD. Kryształy i roztwór macierzysty analizowano metodą HPLC.

Trzecia krystalizacja

Roztwór macierzysty po drugiej krystalizacji zatężono na wyparce obrotowej. Lepki olej zmieszano z octanem etylu (1 ml), heksanami (3 ml) i podczas ogrzewania mieszano przez 10 minut. Po oziębieniu roztwór pozostawiono do odstania przez noc w celu krystalizacji. Kryształy ADD odsączono, przemyto mieszaniną heksany/EtOAc (3/1), wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano kryształy ADD. Kryształy i roztwór macierzysty analizowano metodą HPLC.

Wyniki krystalizacji ADD przedstawiono w Tablicy 6.

PL 207 379 B1

T a b l i c a 6

Wyniki ekstrakcji, rozdzielania i krystalizacji ADD z procesu jednoetapowego

Przykład	Ekstrakcja z uż yciem EtOAc	Ekstrakcja z użyciem NaOH	Krystalizacja
Nr	Czas (godz.)	AD (g)	ADD (g)	AD (g)	Bolde- non (g)	ADD (g)	AD (g)	Bolde- non (g)	I-sza ADD (g)	II heksany ADD (g)	II EtOAc ADD (g)	III ADD (g)	Łącz- nie ADD (g)
454	24	26,52	18,83	1,37	1,07	18,72	1,41	1,03	13,62	0,85	1,44	-	15,91
455	39	26,52	17,20	1,20	1,22	15,26	1,78	1,08	7,43	4,31	2,30	-	14,04
456	48	26,52	19,64	0,54	1.00	17,32	0,00	1,76	10,02	4,46	2,03	-	16,51
457	46	26,52	18,27	0,58	1,58	19,20	0,58	1,58	4,01	8,32	1,96	1,87	16,16
458	42	26.52	19,75	0,00	1,00	19,75	0,00	1,00	7,83	3,72	2,14	0,89	14,58

P R Z Y K Ł A D 4. ANALIZA JAKOŚ CIOWA (TLC) I ILOŚCIOWA (HPLC I GC) Analiza jakościowa metodą TLC

Z dna fermentora pobrano próbki brzeczki (po około 40 ml każda). Próbk ę brzeczki (0,5 ml) ekstrahowano EtOAc (0,5 ml). Analizę TLC prowadzono na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym (60 F254, grubość 0,2 mm), stosując 0,050 ml EtOAc do ekstrakcji. Jako fazę ruchomą stosowano: heksany/EtOAc = 3:1; chloroform/aceton = 3:1; albo chlorek metylenu/aceton = 9:1. Po rozwinięciu płytki stosowano jeden z następujących odczynników do spryskiwania (lub zanurzania).

Odczynnik oparty na cerze, zawierający (dla 100 ml): wodę (94 ml), siarczan ceru (IV) (1,0 g), hydrat kwasu fosfomolibdenowego (2,5 g), kwas siarkowy (6 ml). Składniki rozpuszczono w wymienionej kolejności. Odczynnik można przechowywać przez ponad 1 rok.

Odczynnik oparty na molibdenianie, zawierający (dla 100 ml): wodę (90 ml), molibdenian amonu (10,85 g), kwas siarkowy (6 ml). Składniki rozpuszczono w wymienionej kolejności. Odczynnik można przechowywać przez ponad 1 rok.

Następnie płytkę ogrzewano przez 3 minuty w temperaturze 150°C. Wytworzone niebieskie plamy oznaczały obecność następujących związków (heksany/EtOAc = 3/1)

Rf = 0,75 - olej słonecznikowy;

Rf = 0,53 - fitosterol;

Rf = 0,47 - androstenodion (AD); oraz

RF = 0,02 - androstadienodion (ADD).

Monitorowanie AD, ADD i produktów ubocznych metodą HPLC

Próbkę (2 g piany lub 2 ml cieczy lub 10 mg kryształów) rozcieńczono metanolem do objętości

50,0 ml, dokładnie wymieszano i pozostawiono na 10 minut, w celu wytrącenia się białek i fitosteroli.

Porcję roztworu przesączono (filtr Millipore, typ HV 0,45 μm). Analizę HPLC prowadzono na kolumnie Radialpack (faza stacjonarna C₁₈, 5 μm, 4 x 100 mm, Waters). Faza ruchoma: woda/metanol = stosunek 4:6 (izokratyczna). Przepływ: 1 ml/min. Wykrywanie przy 280 nm.

Krzywa wzorcowa dla AD (mg) = (8,39 powierzchnia + 2033) x 10^-5, gdzie zakres powierzchni wynosi od 0 do 30000.

Krzywa wzorcowa dla ADD (mg) = (7,43 powierzchnia + 72,22) x 10^-4, gdzie zakres powierzchni wynosi od 0 do 100000.

Krzywe wzorcowe otrzymano na podstawie wyników dla czystych próbek androstenodionu (AD) i androstadienodionu (ADD). Czasy retencji dla produktów były następujące:

Związek Czas retencji (min.)

AD 8,73

ADD 13,20

Monitorowanie substratów i produktów metodą GC

Próbkę (50 mg kryształów) rozpuszczono w EtOAc i rozcieńczono do objętości 50 ml w kolbie wolumetrycznej. Alternatywnie, 2 ml mieszaniny do biotransformacji ekstrahowano 50 ml EtOAc.

Następnie roztwór w EtOAc analizowano metodą GC na zawartość fitosteroli, AD i ADD.

Warunki: kolumna SAC-6, temperatura pieca = 278°C, temperatura iniektora = 300°C, detektor FID.

PL 207 379 B1

Czasy retencji dla produktów były następujące: Związek Czas retencji (min.)

AD 8,06

ADD 9,21

Brassicasterol 20,53

Kampesterol 23,20

Kampestanol 23,66

Stigmasterol 24,70 β-Sitosterol 27,71

Sitostanol (Stigmastanol) 28,27

Wyniki biotransformacji fitosteroli i AD do ADD

T a b l i c a 7

Zestawienie z monitorowania dwuetapowego procesu biotransformacji

Czas (godziny)	Warstwa piany	Warstwa wodna
ADD/AD	ADD	AD	ADD/AD	ADD	AD
(-)	(%)	(%)	(-)	(%)	(%)
Pierwsza biotransformacja (fitosterole w AD)
0,0	0:0	0,0	0,0	0:0	0,0	0,0
87,5	11:89	4,0	30,4	25:75	0,6	1,8
89,0	12:88	6,4	47,8	19:81	0,7	3,1
91,0	11:89	3,8	29,2	17:83	0,7	3,4
Druga biotransformacja (AD w ADD)
0,0	11:89	3,8	29,2	17:83	0,7	3,4
18,0	53:47	23,2	20,7	70:30	3,1	1,3
22,0	77:23	18,9	5,4	89:11	3,0	0,4
26,0	79:21	34,3	9,1	89:11	7,6	1,0
41,5	75:25	9,3	3,0	86:14	6,8	1,1

T a b l i c a 8

Zestawienie z monitorowania dwuetapowego procesu biotransformacji

Czas (godziny)	Warstwa piany	Warstwa wodna
ADD/AD	ADD	AD	ADD/AD	ADD	AD
(-)	(%)	(%)	(-)	(%)	(%)
Pierwsza biotransformacja (fitosterole w AD)
0,0	0:0	0,0	0,0	0:0	0,0	0,0
43,0	16:84	3,9	19,9	37:63	0,5	0,8
62,5	17:83	2,8	13,7	31:69	0,7	1,5
69,5	10:90	3,0	27,1	27:73	0,7	1,9
86,5	9:91	5,5	57,6	25:75	0,6	1,8
90,0	8:92	3,9	44,7	25:75	0,5	1,5
Druga biotransformacja (AD w ADD)
0,0	8:92	3,9	44,7	25:75	0,5	1,5
29,0	97:3	23,7	0,8	95:5	4,3	0,2
46,0	94:6	19,6	1,3	95:5	3,2	0,2

PL 207 379 B1

P R Z Y K Ł A D 5. IDENTYFIKACJA NOWEGO MUTANTA F.SOLANI FMI 33

Do uzyskania danych dla sekwencji genów dużej podjednostki (LSU)rRNA stosowano następującą metodę. Z genomowego DNA wyodrębnionego z kolonii grzybów FMI 33 metodą PCR amplifikowano około 300 par zasad genu rRNA dla LSU, zaczynając w pozycji 3344. Produkty amplifikacji oczyszczono od nadmiaru starterów i dNTP, stosując membrany odcinające ciężar cząsteczkowy Microcon 100 (Amicon) i sprawdzono pod kątem jakościowym i ilościowym przez płukanie porcji produktów na żelu agarozowym.

Cykliczne sekwencjonowanie produktów amplifikacji LSU rRNA prowadzono stosując polimerazę DNA AmpliTaq FS DNA i kończące barwniki dRhodamine. Nadmiar znakowanych barwnikami zakończeń usunięto z reakcji sekwencjonowania na kolumnie Sephadex G-50 spin. Produkty zebrano przez odwirowanie, wysuszono pod próżnią i zamrożono w temperaturze -20°C aż do momentu wprowadzenia. Próbki ponownie zawieszono w roztworze formamid/błękit dekstranowy/EDTA i denaturowano przed wprowadzeniem. Próbki poddano elektroforezie w sekwenserze ABI Prism 377 DNA. Dane analizowano stosując oprogramowanie PE/Applied Biosystems DNA do edycji i składania.

Próbki FMI33 i innych mikroorganizmów porównano stosując bazę danych MicroSeq i oprogramowanie do analizy mikroorganizmów. Stwierdzono, że FMI ma dystans genetyczny 0,94% w stosunku do najbliższego mu szczepu F. solani, co wskazuje, że jest to odrębny mutant grzybowy.

Dane sekwencji FMI 33:

AGACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAG

AGTTA

AACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCTTGGTT

GATC

ATCCGGGGTTCTCCCCGGTGCACTCTTCCGGCCAGGCCAGCATCAGTTCGCCCTGGG

GG

ACAAAGGCATCGGGAACGTGGCTCTCTCCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAAT

ACCC

TGCGGCGGACTGAGGTTCGCGCATTCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGTG

ACCC

GTCTTGAAACACGGACCAAG

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób fermentacji kompozycji fitosteroli, z wytworzeniem androstenodionu (androst-4-eno-3,17-dionu), a następnie androstadienodionu (androsta-1,4-dieno-3,17-dionu), znamienny tym, że obejmuje:

prowadzenie hodowli mikroorganizmów z rodzaju Mycobacterium w pierwszej pożywce hodowlanej;

umieszczenie hodowli bakteryjnej i kompozycji fitosteroli w bioreaktorze na czas wystarczający do transformacji kompozycji do androstenodionu („roztwór AD);

prowadzenie hodowli grzybów z rodzaju Fusarium w drugiej pożywce hodowlanej; wstrzykiwanie 1) Fusarium sp. i/lub 2) pożywki hodowlanej dla grzybów zawierającej Fusarium sp., do bioreaktora i fermentacja roztworu AD przez czas wystarczający do transformacji roztworu AD do androstadienodionu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę grzybów Fusarium solani.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę grzybów Fusarium oxysporum.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę mikroorganizmów Mycobacterium MB 3683.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlą grzybów jest hodowla Fusarium solani FMI33 zdeponowanego w ATCC jako PTA-3947.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycja fitosteroli pochodzi ze smoły oleju talowego lub z pulpy mydlanej.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycja fitosteroli pochodzi z oleju roślinnego.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że olej roślinny jest wybrany z grupy obejmującej olej sojowy, olej z nasion rzepaku, olej kukurydziany, olej z nasion bawełny, olej słonecznikowy, olej z oliwek, olej z nasion lnu lub olej z otrąb ryżowych.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycja fitosteroli obejmuje jeden lub więcej spośród następujących fitosteroli: sitosterol, kampesterol, stigmasterol, brassicasterol, desmosterol, chalinosterol, poriferasterol, klionasterol, wszystkie ich uwodornione odpowiedniki oraz wszystkie naturalne i syntetyczne postaci i pochodne, łącznie z izomerami.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pierwsza pożywka hodowlana zawiera melasę rafinowaną i nieorganiczne sole.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że druga pożywka hodowlana zawiera glukozę i namok kukurydziany.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fermentacje prowadzi się przy dostępie tlenu.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kompozycję fitosteroli rozpuszcza się do postaci roztworu, stosując czynnik solubilizujący, a następnie dodaje się do reaktora.
14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że czynnik solubilizujący należy do rodziny glikoli.
15. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że czynnikiem solubilizującym jest glikol polipropylenowy.
16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że czynnik solubilizujący należy do rodziny silikonów.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bioreaktor sterylizuje się, a następnie oziębia przed wstrzyknięciem 1) hodowli grzybów i/lub 2) pożywki z hodowlą grzybów.
18. Fusarium solani FMI 33, zdeponowany w ATCC pod numerem PTA-3947.